מאמר שיטה

ספקטרוסקופיה הגרעיני תהודה מגנטית עבור זיהוי של Phosphorylations המרובה של חלבונים לא תקינים מהותיים

DOI:

10.3791/55001

⸱

27 בדצמבר 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UMR8576, CNRS, Lille University, 2UMR-S1172, INSERM CNRS, Lille University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים כאן שיטה לזיהוי זרחונים מרובים של חלבון לא מסודר באופן מהותי על ידי ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR), תוך שימוש בחלבון טאו כמקרה מבחן. טאו רקומביננטי מועשר איזוטופית ושונה במבחנה על ידי קינאז לפני איסוף הנתונים וניתוחם.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אגרגטים של חלבון הטאו העצבי נמצאים בתוך נוירונים של חולי אלצהיימר. התפתחות המחלה מלווה בזרחון מוגבר וחריג של טאו. במהלך החקירה המולקולרית של תפקודי טאו ותפקודים לקויים במחלה, נעשה שימוש בספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR) לזיהוי הזרחונים המרובים של טאו. אנו מציגים כאן פרוטוקולים מפורטים של ייצור רקומביננטי של טאו בחיידקים, עם העשרה איזוטופית למחקרי תמ"ג. מתוארים שלבי טיהור המנצלים את יציבות החום והנקודה האיזואלקטרית הגבוהה של Tau. הפרוטוקול לזרחון במבחנה של טאו על ידי ERK2 מופעל רקומביננטי מאפשר יצירת זרחונים מרובים. דגימת החלבון מוכנה לאיסוף נתונים בנושא שלבים אלה. הגדרת הפרמטר להתחלת הקלטה בספקטרומטר נחשבת הבאה. לבסוף, מוסברת האסטרטגיה לזיהוי אתרי זרחון של טאו שונה, המבוססת על נתוני NMR. נדון היתרון של מתודולוגיה זו בהשוואה לטכניקות אחרות המשמשות לזיהוי אתרי זרחון, כגון זיהוי חיסוני או ספקטרומטריית מסה (MS).

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אחד האתגרים העיקריים של שירותי בריאות במאה ה -21 הם מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר (AD). טאו הוא חלבון הקשורים-microtubule שמגר microtubule היווצרות (MT). טאו מעורב באותה מידה בכמה הפרעות ניווניות, tauopathies שנקרא, מתוכם את הטוב ביותר הידוע הוא לספירה. בהפרעות אלה, אגרגטים עצמיים טאו בחוטי סליל לזווג (PHFs) והוא נמצא שונה על שאריות רבות על ידי שינויי posttranslational (PTMs) כגון זרחון 1. זירחון של חלבון טאו הוא מעורב בשני הסדרת תפקודו הפיזיולוגי של ייצוב MT ואובדן פתולוגית של פונקציה המאפיינת נוירונים לספירה.

יתר על כן, חלבון טאו, כאשר משולבים PHFs בנוירונים חולה, ללא יוצא מן הכלל הוא hyperphosphorylated 2. בניגוד טאו רגיל המכיל 2-3 קבוצות פוספט, את טאו hyperphosphorylated ב PHFs מכיל 5 עד 9 phosphatקבוצות דואר 3. Hyperphosphorylation של טאו תואמת הן לעלייה של stoichiometry בכמה אתרים כדי זירחון של אתרים נוספים שנקראים אתרי פתולוגית של זירחון. עם זאת, קיימת חפיפה בין AD ודפוסים מבוגרים נורמלים של זירחון, למרות הבדלים כמותיים ברמה 4. איך פונקצית השפעה ספציפית אירועי זירחון לבין תפקוד לקוי של טאו נותר ברובה לא ידוע. אנו שואפים לפענח תקנת טאו ידי PTMs ברמה המולקולרית.

כדי להעמיק את ההבנה של ההיבטים המולקולריים של טאו, אנחנו צריכים להתמודד עם אתגרים טכניים. ראשית, טאו הוא חלבון סדר מהותי (IDP) כאשר מבודדים בתמיסה. חלבונים כאלה חסרי מבנה תלת ממדי מוגדר היטב גם במצב רגיל וגם דורשים שיטות biophysical בפרט ללמוד תפקידם (ים) ו תכונות מבניות. טאו היא פרדיגמה עבור המעמד ההולך וגדל של עקורים, נמצא לעתים קרובות קשורפתולוגיות כגון מחלות ניווניות, ומכאן גברת העניין כדי להבין את הפרמטרים המולקולריים שבבסיס תפקידיהם. שנית, אפיון של זירחון טאו הוא אתגר אנליטי, עם 80 אתרי זירחון פוטנציאל לאורך הרצף של איזופורם טאו 441 חומצות אמיניות הארוכה. מספר הנוגדנים פותח כנגד אפיטופים פוספורילציה של טאו ומשמש לצורך זיהוי של טאו פתולוגי בנוירונים או רקמת המוח. אירועי זירחון יכולים להתקיים ב -20 אתרים לפחות על כוונת של קינאזות מכוונת פרולין, רובם בסמיכות בתוך אזור פרולין העשיר. טיבה האיכותי (אילו אתרים?) וכמוני (מה ורכב?) אפיון קשה אפילו על ידי טכניקות MS האחרונות 5.

ספקטרוסקופיה NMR יכול לשמש כדי לחקור חלבונים סדר כי הם מערכות דינמיות מאוד היוו של הרכבים של conformers. ספקטרוסקופיה NMR ברזולוציה גבוהה הייתה applied לחקור הן המבנה והתפקוד של חלבון טאו. בנוסף, את המורכבות של פרופיל זירחון של טאו הובילו לפיתוח של כלים מולקולריים ושיטות אנליטיות חדשות באמצעות NMR לזיהוי אתרי זירחון 6 - 8. תמ"ג כשיטת אנליטיים מאפשר זיהוי של אתרי זירחון טאו באופן גלובלי, ויזואליזציה של כל השינויים באתר יחיד בניסוי יחיד, וכימות של היקף ההתאגדות פוספט. נקודה זו חיונית שכן למרות שמחקרים זירחון על טאו בשפע בספרות, רובם בוצעו עם נוגדנים, משאיר מידה רבה של אי-ודאות לגבי הפרופיל המלא של זרחון ובכך את ההשפעה האמיתית של אירועי זירחון פרט. קינאזות רקומביננטי כולל PKA, 3β קינאז גליקוגן-synthase (Gsk3β), A 2 / cyclin קינאז Cyclin התלוי (CDK2 / CycA), קינאז תלוי-ציקלין 5 (CDK5) / מעשה p25 חלבון ivator, קינאז התאי מוסדרת-אות 2 (ERK2) ו microtubule-זיקה-ויסות קינאז (MARK), אשר ניכר פעילות זירחון כלפי טאו, ניתן להכין בצורה פעילה. בנוסף, מוטציות טאו המאפשרות יצירת isoforms חלבון טאו ספציפי עם דפוסי זירחון היטב מאופיינים משמשות לפענח את קוד זירחון של טאו. ספקטרוסקופיה NMR מכן נעשה שימוש כדי לאפיין דגימות טאו שונה enzymatically 6 - 8. למרות במבחנה זירחון של טאו הוא יותר מאתגר מאשר-זירחון פסאודו כגון על ידי מוטציה של הנבחרת שירו / Thr לחומצה גלוטמית (Glu) שאריות, גישה זו יש לגופו. ואכן, לא פרמטרי ההשפעה ולא אינטראקציה המבניות של זירחון ניתן חיקה תמיד על ידי חומצות גלוטמית. דוגמה לכך היא המוטיב בתורו נצפה סביב phosphoserine 202 (pSer202) / phosphothreonine 205 (pThr205), אשר אינו משוחזר עם Glu מוטציות 9.

ss = "jove_content"> כאן, הכנת טאו שכותרתו isotopically לחקירות NMR יתואר ראשון. חלבון טאו פוספורילציה ידי ERK2 הוא שונה באתרים רבים מתוארים באתרי פתולוגית של זירחון, ובכך מייצג מודל מעניין של טאו hyperphosphorylated. פרוטוקול מפורט של טאו בזירחון במבחנה על ידי קינאז ERK2 רקומביננטי מוצג. ERK2 מופעל על ידי זירחון על ידי קינאז חלבון מופעל mitogen / קינאז ERK (MEK) 10 - 12. בנוסף ההכנה שונה, שכותרתו isotopically חלבון טאו, אסטרטגית NMR המשמשת לזיהוי של PTMs מתוארת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ייצור של 15 N, 13 C-טאו (איור 1)

  1. Transform פלסמיד ביטוי T7 רקומביננטי pET15b-טאו 13,14 לתוך BL21 (DE3) תאים חיידקיים המוסמכות coli Escherichia 15.
    הערה: קידוד cDNA עבור איזופורם טאו הארוך (441 שאריות חומצת אמינו) הוא משובטים בין NcoI ו XhoI אתרי הגבלה פלסמיד pET15b.
    1. מערבבים בעדינות 50 μl של BL21 המוסמכת (DE3) תאים, ויצרו 1-5 x 10 7 מושבות לכל מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד, עם 100 ננוגרם של DNA פלסמיד בתוך שפופרת פלסטיק 1.5 מ"ל.
      הערה: קודון-שימוש אופטימיזציה זני חיידקים לביטוי cDNA איקריוטיים אינם חיוניים לייצר טאו אדם.
    2. מניחים את תערובת תאים על קרח למשך 30 דקות ולאחר מכן הלם חום במשך 10 שניות על 42 מעלות צלזיוס. מניחים את הצינור בחזרה על קרח למשך 5 דקות ולהוסיף 1 מ"ל של בטמפרטורת החדר LB (לוריא- Bertani) בינוני. לדגור על השעיית חיידקים על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות תחת עדיןתסיסה.
  2. מורח באמצעות לולאת חיסון 100 μl של השעית התא באופן שווה על צלחת אגר של מדיום LB המכיל 100 מיקרוגרם / מיליליטר של אנטיביוטיקת אמפיצילין.
  3. דגירה את הצלחת הבחירה במשך 15 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
  4. שמור את הצלחת הבחירה ב 4 ° C עד שתמשיך לשלב תרבות, לכל היותר 2 שבועות כ.
    הערה: מלאי גליצרול של התרבות חיידקים (50% גליצרול), המאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס, ניתן להכין להתחיל בתרבות בשלב מאוחר יותר.
  5. הוסף 1 מ"ל 1 M 4 MgSO, 1 מ"ל 100 מ"מ CaCl 2, 10 מ"ל 100x השלמה ויטמין MEM, 1 מ"ל 100 מ"ג / אמפיצילין מ"ל עד 1 ליטר של מלחים M9 autoclaved (6 גרם Na 2 4 HPO, 3 גרם KH 2 PO 4 , 0.5 גרם NaCl).
    הערה: משקע לבן יהווה על תוספת של פתרון CaCl 2 אל מלחי M9 כי מתפוגגים במהירות.
  6. Solubilize 300 מ"ג של 15 N, 13 בינוני C-שלם, 1 גרם של 15NH 4 Cl ו -2 גרם של 13 C 6 -glucose ב 10 מ"ל של מדיום M9. סנן לעקר את הפתרון איזוטופ באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר, ישירות לתוך המדיום M9.
  7. להשעות באמצעות המושבה חיסון לולאה אחת pET15b-טאו טרנספורמציה חיידקים מהצלחת הבחירה ב 20 מ"ל של מדיום LB בתוספת 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​של אמפיצילין.
  8. דגירה בינוני מחוסן ב 37 מעלות צלזיוס במשך כ -6 שעות.
  9. מדוד צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD 600) ב -1 מ"ל של דילול פי עשרה של התרבות חיידקים קובט ספקטרומטר פלסטיק.
    הערה: עכירות של תרבות החיידקים המתאימה OD 600 של 3.0-4.0 עולה כי בשלב צמיחה הרוויה הוא הגיע.
  10. הוסף 20 מ"ל של התרבות LB רווי 1 ליטר של מדיום הגידול M9 השלימו עם אמפיצילין (100 מיקרוגרם / הריכוז הסופי מ"ל), ב 2 בקבוק תרבות L Erlenmeyer פלסטיק מבולבל.
  11. מניח את בקבוק תרבות חממה לתכנות מוגדר 10 °C ו -50 סל"ד. לתכנת את החממה כדי לעבור 200 סל"ד ו -37 מעלות צלזיוס בשעות הבוקר המוקדמות של יום המחרת.
  12. OD מדוד 600 על 1 מ"ל של תרבית החיידקים ב קובט ספקטרומטר פלסטיק. להוסיף 400 μl של 1 M IPTG (איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside) פתרון מניות (כל הזמן ב -20 ° C) כאשר OD 600 מגיע לערך של 1.0 עומד להשרות את הביטוי של חלבון טאו רקומביננטי.
  13. המשך הדגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך תקופת hr 3 נוספת. אסוף תאים חיידקיים ידי צנטריפוגה ב 5000 XG במשך 20 דקות.
  14. להקפיא את גלולת החיידקים ב -20 ° C. שמור קפוא עד שלב הטיהור, במשך תקופה ארוכה במידת צורך.

טיהור 2. של 15 N, 13 C-טאו (איור 2)

  1. מאגרי טיהור קטיון חילופי חיטוי (CEX) ב 121 מעלות צלזיוס מתחת לגיל 15 psi במשך 20 דקות. מאגרי חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. ההפשרה גלולה תא החיידק ו resuspend ביסודיות 45 מ"לממוצא CEX חיץ (50 מ"מ NaPi חיץ pH 6.5, 1 mM EDTA) השלימו טרי עם 1x קוקטייל מעכבי פרוטאז (1 טאבלטים) DNAseI (2,000 יחידות).
  3. לשבש תאים חיידקיים באמצעות homogenizer בלחץ גבוה ב -20,000 psi. 3-4 עובר נחוצים. צנטריפוגה ב 20,000 XG במשך 40 דקות כדי להסיר חומר מסיס.
  4. מחמם את תמצית תא החיידק במשך 15 דקות ב 75 מעלות צלזיוס באמצעות אמבט מים.
    הערה: משקע לבן הוא ציין לאחר כמה דקות.
  5. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 20 דקות ולשמור את supernatant המכיל את חלבון טאו חום יציב.
  6. חנות ב -20 ° C עד שלב הטיהור הבא, במידת צורך.
  7. בצע כרומטוגרפיה קטיון החליפין על שרף CEX חזק ארוז כגיס 5 מ"ל המיטה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהיר (FPLC) מערכת (איור 3).
    1. קצב הזרימה נקבע ל -2.5 מ"ל / דקה.
    2. לאזן את העמודה CEX חיץ
    3. טען את heated- 60-70 מ"ללחלץ המכיל טאו באמצעות משאבת מדגם, או לחילופין לשאוב A, בהתאם למערכת. אסוף את הזרימה דרך לניתוח על מנת לוודא כי חלבון טאו מחייב ביעילות השרף (ראה 2.8).
    4. לשטוף את השרף עם CEX חיץ עד ספיגה ב 280 ננומטר הוא חוזר לערך בסיס.
    5. Elute טאו מהעמודה באמצעות שיפוע NaCl שלושה שלבים מתקבל על ידי עלייה הדרגתית של חיץ B CEX (CEX חיץ עם 1 M NaCl). תכנת את FPLC כדלקמן: השלב הראשון של שיפוע עד 25% CEX B חיץ 10 כרכים עמודה (CV) להגיע 250 מ"מ NaCl, הצעד השני ל -50% CEX B חיץ 5 קורות חיים כדי להגיע ל -500 מ"מ NaCl, ואת השלב השלישי עד 100% CEX B חיץ 2 CV להגיע 1 M NaCl. אסוף 1.5 מיליליטר שבר במהלך שלבי elution.
  8. לנתח 10 μl של שברים שנאספו במהלך השלב elution ידי SDS-PAGE (12% ג'ל SDS-acrylamide) ו Coomassie מכתים (איור 3 א) 16. בדוק את שלב הטעינה על הטור, כמו גם על ידי analyזיע 10 μl של דרך-זרימה.
  9. בחר שברים המכיל טאו ובריכת שברים אלה לשלב הבא.
  10. בצע חילוף חיץ על טאו המכיל שברים ונקוו (איור 3 ב ').
    1. לאזן טור desalting מהמיטה ארז שרף 53 מ"ל G25 (26 x 10 ס"מ) אמוניום ביקרבונט 50 מ"מ (חיץ נדיפים) באמצעות מערכת FPLC.
    2. קצב הזרימה סט 5 מ"ל / דקה. להזריק את מדגם טאו על עמודה באמצעות לולאה הזרקת 5 מ"ל. אסוף שברים המתאים שיא ספיגת ב 280 ננומטר.
    3. חזור על הזריקה 3-4 פעמים, תלוי בנפח של ברכת CEX הראשונית.
  11. לחשב את כמות החלבון טאו מטוהרים באמצעות אזור השיא של chromatogram ב 280 ננומטר (1 מ"ג של טאו תואמת 140 מאו * מ"ל).
    הערה: מקדם ההכחדה של חלבון טאו ב 280 ננומטר היא 7,550 M -1 cm -1. טאו אינו מכיל שאריות TRP.
  12. הברכה כל שברי טאו.
  13. Aliquot המדגם לתוך צינורות המכילים את המקבילה של 1 עד 5 מ"ג של טאו. בחר צינורות אלה, כך היקף הפתרון הוא קטן בהשוואה להיקף הצינור (למשל 5 מ"ל של תמיסת בתוך שפופרת 50 מ"ל).
  14. פונץ 'חורי כמוסות הצינור באמצעות מחט. להקפיא דגימות טאו ב -80 מעלות צלזיוס.
  15. Lyophilize דגימות טאו. חלבון Lyophilized טאו יכול להישמר ב -20 מעלות צלזיוס במשך פרקי זמן ארוכים.

3. במבחנה זירחון של 15 N-טאו

  1. ממיסים 5 מ"ג טאו lyophilized במאגר 500 זירחון μl (50 מ"מ Hepes · KOH, pH 8.0, 12.5 מ"מ MgCl 2, 1 mM EDTA, 50 מ"מ NaCl).
  2. להוסיף 2.5 מ"מ ATP (25 μl של 100 מ"מ מניות פתרון והמשיך ב -20 מעלות צלזיוס), 1 מ"מ DTT (1 μl של 1 M פתרון מניות והמשיך ב -20 ° C), 1 מ"מ EGTA (2 μl של המניה 0.5 M פתרון), מעכבי פרוטאז קוקטייל 1x (25 μl של המניה 40x מתקבל על ידי המסת 1 לוח במאגר 1 מ"ל זירחון) ו -181; M המופעל ERK2 שלו (250 μl חיץ שימור 10 מ"מ Hepes, pH 7.3, 1 מ"מ DTT, 5 מ"מ MgCl 2, 100 מ"מ NaCl ו -10% גליצרול, לאחסן ב -80 ° C) בהיקף המדגם של 1 מ"ל.
    הערה: המופעל ERK2 שלו יכול להיות מוכן בתוך הבית 5,8 ידי זרחון עם קינאז MEK.
  3. דגירה 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
  4. מחממים את המדגם ב 75 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להשבית קינאז ERK.
  5. צנטריפוגה ב 20,000 XG במשך 15 דקות. לאסוף ולשמור את supernatant.
  6. Desalt המדגם חלבון לתוך אמוניום ביקרבונט 50 מ"מ באמצעות טור מהמיטה ארז שרף 3.45 מ"ל G25 (1.3 x 2.6 ס"מ), אשר מתאים מדגם 1 מ"ל.
  7. הפעל 12% SDS-PAGE 16 עם 2.5 μl של מדגם החלבון לבדוק הן שלמותה זירחון ביותר (איור 4).
  8. Lyophilize מדגם טאו פוספורילציה. אחסן את האבקה ב -20 ° C.

4. רכישת NMR ספקטרה (אלחוטיאיור 5)

  1. Solubilize 4 מ"ג lyophilized 15 N, 13 C ERK-פוספורילציה-טאו חיץ 400 μl תמ"ג (50 מ"מ NaPi או 50 מ"מ deuterated כמה עצוב D11 .cl, pH 6.5, 30 mM NaCl, 2.5 mM EDTA ו 1 מ"מ DTT).
  2. הוסף 5% D 2 O עבור נעילה בתחום ספקטרומטר תמ"ג ו -1 מ"מ TMSP (3- (trimethylsilyl) מלח נתרן propionic-2,2,3,3-ד 4 חומצה)) כנקודת התייחסות אות תמ"ג פנימי. הוסף 10 μl של פתרון 40x מלאה של מעכבי פרוטאז קוקטייל שלם.
  3. מעביר את המדגם בתוך שפופרת NMR 5 מ"מ באמצעות מזרק אלקטרוני עם מחט ארוכה או פיפטה פסטר. סגור את צינור NMR באמצעות הבוכנה. הסר את כל בועות אוויר שנלכדו בין הבוכנה ונוזל ידי תנועות הבוכנה.
  4. מניח את צינור תמ"ג הצנטריפוגה. התאם במצב האנכי שלה טווה עם המד המתאים ראש חללית NMR בשימוש, באופן שמרבית הפתרון המדגם יהיה בתוך סליל NMR.
  5. הפעל את זרימת האוויר: לחץ אני מריםn חלון מערכת בקרת מגנט. בזהירות במקום טווה עם הצינורית את זרימת האוויר בחלק העליון של קנה המגנט. עצור את זרימת האוויר (לחץ מעלית) ולתת הצינור לרדת למקומו בתוך ראש בדיקת המגנט.
  6. טמפרטורה מוגדרת 25 ° C (298 K).
  7. בצע חצי אוטומטי כוונון והתאמה של ראש החללית כדי לייעל העברת כוח. הקלד atmm על שורת הפקודה.
  8. נעל את תדירות ספקטרומטר באמצעות האות D 2 O של המדגם נרשם בערוץ דאוטריום. לחץ מנעול בחלון מערכת בקרת מגנט.
  9. להתחיל את הליך shimming כדי לייעל ההומוגניות של השדה המגנטי בעמדה של המדגם. הקלד topshim GUI בשורת הפקודה כדי לפתוח את חלון שים. לחץ להתחיל בחלון שים. בדוק את ערך הגירסה הסטנדרטית שיורית B0 כדי לוודא shims הם אופטימליים (פחות מ -2 הרץ הוא טוב).
  10. כייל את הפרמטר p1 (אורך של פרוטוןדופק גלי רדיו ב μsec), אשר יש צורך לקבל 90 ° סיבוב של ספיני פרוטון. כוון את הדופק 360 ° באמצעות ספקטרום 1D הפרוטונים מים (איור 6).
  11. התאם את התדירות בקיזוז קביעת פרמטר O1 (ב רץ) לתדר מי פרוטון בספקטרום 1D (איור 6).
  12. התחל רכישת ספקטרום פרוטון 1D (רצף דופק עם רצף ווטרגייט לדיכוי אות מים, למשל zggpw5) לאמת אותות מן המדגם (איור 7). התאם את מספר סריקות על ריכוז החלבון יחסית. הקלד ZG על שורת הפקודה כדי להפעיל את הרכישה.
  13. הגדרת פרמטרים נוספים לרכישת 2 ד [1 H, 15 N] ספקטרום HSQC (הדופק רצף hsqcetfpf3gpsi, תרשימים 8-9).
    1. במשך 15 N, 13 C שכותרתו מדגם, לנתק 13 צלזיוס במהלך 15 האבולוציה העקיפה N.
    2. הגדר את מספר נקודות ואת רוחב ספקטרלי (ppm) 1 H (F2) ו -15 N ממדים (F1).
      הערה: התאם את מספר נקודות הנתונים הרכישה לשדה ספקטרומטר לשמור על מספר דומה של הרץ לכל נקודה ולהגביל decoupling פעמים: להשתמש 3,072 נקודות ב -900 מגה-הרץ ו -2,048 נקודות ב 600 MHz, בממד 1 H.
    3. מטב פרמטרים נוספים של הרצפים הדופקים, מתאים עיכובים, אורכי דופק, לקזז תדרים, רמות כוח. סוג ased על שורת הפקודה כדי להציג את כל הפרמטרים הרלוונטיים לניסוי.
  14. פרמטרים שנקבעו לרכישת מגהרץ 3D [1 H, 15 N, 13 C] HNCACB ספקטרום (הדופק רצף hncacbgpwg3d, איור 10A) ב 600.
  15. פרמטרים שנקבעו עבור 3D [1 H, 15 N, 15 N] ניסוי HNCANNH (hncannhgpwg3d רצף דופק) ב 600 MHz. הגדר את מספר נקודות 2048 ב H 1 ו, 64ו -128 נקודות בשנתיים 15 N ממדים. הגדר את רוחב ספקטרלי כמו 14, 25, 25 חלקים למיליון (ppm) התרכזו 4.7, 119, 119 עמודים לדקה ב 1 H, 15 N ו- 15 N ממדים. משך הרכישה עם 16 סריקות הוא יום 1 ו -22 שעות.

5. זיהוי של אתרי זירחון

  1. ספקטרה תהליך באמצעות תוכנת רכישה והעיבוד NMR.
    1. בצע טרנספורמציה פורייה של הנתונים (איור 7). סוג רגל עבור ספקטרום 1D, xfb עבור ספקטרום 2D או ft3d עבור ספקטרום 3D, על שורת הפקודה.
    2. שלב והתייחסות כל ספקטרום (7C איור) באמצעות חלונות אינטראקטיביים.
  2. זיהוי תהודות של עניין 2D HSQC המקביל פוטנציאל למשקעים שירו ו Thr פוספורילציה (איור 9, תיבה אדומה).
  3. מטוסי חלץ (כלומר 2D 1 H- 13 ספקטרה צלזיוס)ספקטרום 3D 1 H- 15 N- 13 C באמצעות 15 N המשמרות הכימיות של תהודות של עניין 2D. השתמש הסמן של מימד 2 (W2) כדי לבחור את תדירות 15 N המקביל למישור (W1-W3) להיות דמיינו (איור 10 ב).
  4. פיק תדרי התהודה של Ca '' ו 'CB' 13 גרעיני C של 'אני' ו 'אני-1 "שאריות (סט החלשות אותות בהשוואה לאלו של שאריות i) עבור כל [1 H, 15 N] תהודה עניין בספקטרום 3D HNCACB ידי לחיצה על התהודה, בתפריט מצב המצביע למצוא / להוסיף שיא, להוסיף את ערך המשמרת הכימי בקובץ רשימת שיא.
    1. זהה את סוג שאריות i, pSer או pThr, על ידי השוואת המשמרות הכימיות ברשימת השיא לערכים הידועים של CA משמרות כימיות CB של pSer ו pThr 17.
    2. זיהוי נוכחות של שאריות פרו בבית i + 1 עמדה על ידי o שינוי מאפיין נוסף +2 עמודים לדקהf ערך המשמרת הכימי CA 18.
    3. השווה את הערכים המשמרים הכימית של תהודות CA ו- CB מתאימות שאריות i-1 שולחן של משמרות כימיות ניבאו שאריות חומצת אמינו טאו 19 לזהות את אופי השאריות במיקום i-1.
  5. פיק תדרי התהודה של 15 N גרעינים של 'אני' ו 'אני-1 "שאריות לכל [1 H, 15 N] תהודה של עניין ספקטרום HNCANNH.
  6. השווה את הערכים המשמרים כימי 15 N אל משימת המשמרת הכימית של חלבון טאו 20 - 23.
  7. השווה את dipeptides המזוהה עם רצף טאו להגדיר את משימת רצף מסוימת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 3 א מציג שיא ספיג גדול ב 280 ננומטר שנצפו במהלך שיפוע elution. שיא זה מתאים חלבון טאו מטוהרים כפי שניתן לראות על ג'ל acrylamide מעל הכרומתוגרמה. איור 3 ב מציג לשיא ספיגה מופרד היטב ב 280 ננומטר שיא של מוליכות, להבטיח כי desalting של החלבון הוא יעיל. איור 4 מראה ג'ל משמרת חלבון נצפתה על ידי SDS-PAGE ניתוח 16 מאפיין של זרחון חלבון המרובה (להשוות מסלולים 2 ו -3). איור 6 מציג סדרה של פרוטון (1 H) ספקטרום 1D עם ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השתמשנו ספקטרוסקופיה NMR לאפיין דגימות טאו שונות enzymatically. ביטוי רקומביננטי והטיהור המתוארת כאן עבור חלבון טאו אדם באורך מלא יכולים לשמש באופן דומה כדי לייצר מוטצית טאו או תחומי טאו. Isotopically חלבון מועשר נדרשת ספקטרוסקופיה NMR, דבר המחייב ביטוי רקומביננטי. זיהוי של אתרי זירחון דורש הקצאת תהודה ו 15 N, 13 C כפליים חלבון הנקרא. בהתחשב בעלות של איזוטופים, תשואה טובה נדרשת בשלב ביטוי רקומביננטי. גלוקוז הוא הגורם המגביל את התפתחות חיידקים במדיום M9 ולכן ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתקני התמ"ג מומנו על ידי Région Nord, CNRS, מכון פסטר של ליל, הקהילה האירופית (FEDER), משרד המחקר הצרפתי והאוניברסיטה למדעים וטכנולוגיות של ליל. אנו מודים לתמיכה מ-TGE RMN THC (FR-3050, צרפת), FRABio (FR 3688, צרפת) ומתקן הליבה של ליל NMR ו-RPE Health and Biology. המחקר שלנו נתמך על ידי מענקים מ-LabEx (מעבדת מצוינות), DISTALZ (פיתוח אסטרטגיות חדשניות לגישה טרנסדיסציפלינרית למחלת אלצהיימר), EU ITN TASPPI ו-ANR BinAlz.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
pET15B ביטוי רקומביננטי T7 פלסמידNovagen69257שמור על -20 מעלות; C
BL21 (DE3) טרנספורמציה מוכשרת E. coli חיידקיםניו אינגלנד BiolabsC2527Iשמור על -80 מעלות; C
מרק LB חיטוי, לנוקס DIFCO240210בינוני לגידול חיידקים
100xSigma58970Cתוסף גידול חיידקים בינוני
15N, 13C-ISOGRO אבקה בינונית שלמהSigma608297תוסף גידול חיידקים בינוני
15NH4Clסיגמא299251 איזוטופ
13C6-GlucoseSigma389374
טבליות מעכבי פרוטאז איזוטופים Roche5056489001לשמור על 4 מעלות;
טבליה C 1 ב-1 מ"ל היא תמיסה פי 40 שניתן לשמור בטמפרטורה של -20 מעלות; C
DNaseIEUROMEDEX1307שמור על -20 מעלות; C
הומוגנייזר (EmulsiFlex-C3)AVESTINLysis מתממש ב-4 מעלות; סי
פירס וסחר; חלבון לא מוכתם MWMarker Pierce266109
קינאז MEK1 אנושי פעיל, GST TaggedSigmaM8822יש לשמור בטמפרטורה של -80 ° C
AKTÄ מערכת כרומטוגרפיה טהורהGE HealthcareFPLC
HiTrap SP Sepharose FF (עמודה של 5 מ"ל)GE Healthcare17-5156-01עמודות כרומטוגרפיה להחלפת קטיון
HiPrep 26/10 התפלתGE Healthcare17-5087-01עמודת התפלת חלבון
PD MidiTrap G-25GE Healthcare28-9180-08עמודת התפלת חלבון
Tris D11, 97% DCortecnetCD4035P5Deuterated NMR buffer
5 מ"מ מיקרו-צינור סימטרי SHIGEMI D2O (סט של 5 צינורות פנימיים וחיצוניים) Euriso-topBMS-005BNMR Shigemi
Tubes eVol ערכת מתנע מזרק אלקטרוניCortecnet2910000Pipetting
Bruker 900 MHz AvanceIII עם בדיקה קריוגנית תהודה משולשתBruker NMR ספקטרומטר לרכישת נתוניםBruker
600 MHz Avance עם בדיקה קריוגנית תהודה משולשתספקטרומטר NMR Bruker
TopSpin 3.1Brukerתוכנת רכישה ועיבוד לניסויי NMR
Sparky 3.114UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller)תוכנת ניתוח נתוני NMR
משלים ויטמין MEM לרכישת נתונים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K., Tung, Y. C., Quinlan, M., Wisniewski, H. M., Binder, L. I. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83 (13), 4913-4917 (1986).
  2. Hasegawa, M., Morishima-Kawashima, M., Takio, K., Suzuki, M., Titani, K., Ihara, Y. Protein sequence and mass spectrometric analyses of tau in the Alzheimer's disease brain. J. Biol. Chem. 267 (24), 17047-17054 (1992).
  3. Kopke, E., Tung, Y. C., Shaikh, S., Alonso, A. C., Iqbal, K., Grundke-Iqbal, I. Microtubule-associated protein tau. Abnormal phosphorylation of a non-paired helical filament pool in Alzheimer disease. J. Biol. Chem. 268 (32), 24374-24384 (1993).
  4. Wischik, C. M., Edwards, P. C., et al. Quantitative analysis of tau protein in paired helical filament preparations: implications for the role of tau protein phosphorylation in PHF assembly in Alzheimer's disease. Neurobiol. Aging. 16 (3), 409-417 (1995).
  5. Prabakaran, S., Everley, R. A., et al. Comparative analysis of Erk phosphorylation suggests a mixed strategy for measuring phospho-form distributions. Mol. Syst. Biol. 7, 482(2011).
  6. Landrieu, I., Lacosse, L., et al. NMR analysis of a Tau phosphorylation pattern. J. Am. Chem. Soc. 128 (11), 3575-3583 (2006).
  7. Amniai, L., Barbier, P., et al. Alzheimer disease specific phosphoepitopes of Tau interfere with assembly of tubulin but not binding to microtubules. FASEB J. 23 (4), 1146-1152 (2009).
  8. Qi, H., Prabakaran, S., et al. Characterization of Neuronal Tau Protein as a Target of Extracellular Signal-regulated Kinase. J. Biol. Chem. 291 (14), 7742-7753 (2016).
  9. Bibow, S., Ozenne, V., Biernat, J., Blackledge, M., Mandelkow, E., Zweckstetter, M. Structural impact of proline-directed pseudophosphorylation at AT8, AT100, and PHF1 epitopes on 441-residue tau. J. Am. Chem. 133 (40), 15842-15845 (2011).
  10. Boulton, T. G., Yancopoulos, G. D., et al. An insulin-stimulated protein kinase similar to yeast kinases involved in cell cycle control. Science. 249 (4964), 64-67 (1990).
  11. Anderson, N. G., Maller, J. L., Tonks, N. K., Sturgill, T. W. Requirement for integration of signals from two distinct phosphorylation pathways for activation of MAP kinase. Nature. 343 (6259), 651-653 (1990).
  12. Seger, R., Ahn, N. G., et al. Microtubule-associated protein 2 kinases, ERK1 and ERK2, undergo autophosphorylation on both tyrosine and threonine residues: implications for their mechanism of activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88 (14), 6142-6146 (1991).
  13. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
  14. Rosenberg, A. H., Lade, B. N., Chui, D. S., Lin, S. W., Dunn, J. J., Studier, F. W. Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene. 56 (1), 125-135 (1987).
  15. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166 (4), 557-580 (1983).
  16. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  17. Bienkiewicz, E. A., Lumb, K. J. Random-coil chemical shifts of phosphorylated amino acids. J. Biomol. NMR. 15 (3), 203-206 (1999).
  18. Wishart, D. S., Bigam, C. G., Holm, A., Hodges, R. S., Sykes, B. D. 1H, 13C and 15N random coil NMR chemical shifts of the common amino acids. I. Investigations of nearest-neighbor effects. J Biomol NMR. 5 (1), 67-81 (1995).
  19. Tamiola, K., Acar, B., Mulder, F. A. A. Sequence-specific random coil chemical shifts of intrinsically disordered proteins. J. Am. Chem. Soc. 132 (51), 18000-18003 (2010).
  20. Lippens, G., Wieruszeski, J. M., et al. Proline-directed random-coil chemical shift values as a tool for the NMR assignment of the tau phosphorylation sites. Chembiochem. 5 (1), 73-78 (2004).
  21. Smet, C., Leroy, A., Sillen, A., Wieruszeski, J. M., Landrieu, I., Lippens, G. Accepting its random coil nature allows a partial NMR assignment of the neuronal Tau protein. Chembiochem. 5 (12), 1639-1646 (2004).
  22. Mukrasch, M. D., Bibow, S., et al. Structural polymorphism of 441-residue tau at single residue resolution. PLoS Biol. 7 (2), e34(2009).
  23. Harbison, N. W., Bhattacharya, S., Eliezer, D. Assigning backbone NMR resonances for full length tau isoforms: efficient compromise between manual assignments and reduced dimensionality. PloS One. 7 (4), e34679(2012).
  24. Morris, M., Knudsen, G. M., et al. Tau post-translational modifications in wild-type and human amyloid precursor protein transgenic mice. Nat. Neurosci. 18 (8), 1183-1189 (2015).
  25. Mair, W., Muntel, J., et al. FLEXITau: Quantifying Post-translational Modifications of Tau Protein in Vitro and in Human Disease. Analytical Chemistry. 88 (7), 3704-3714 (2016).
  26. Leroy, A., Landrieu, I., et al. Spectroscopic studies of GSK3{beta} phosphorylation of the neuronal tau protein and its interaction with the N-terminal domain of apolipoprotein E. J. Biol. Chem. 285 (43), 33435-33444 (2010).
  27. Theillet, F. -X., Smet-Nocca, C., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
  28. Qi, H., Cantrelle, F. -X., et al. Nuclear magnetic resonance spectroscopy characterization of interaction of Tau with DNA and its regulation by phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
  29. Cordier, F., Chaffotte, A., Wolff, N. Quantitative and dynamic analysis of PTEN phosphorylation by NMR. Methods. 77-78, 82-91 (2015).
  30. Thongwichian, R., Kosten, J., et al. A Multiplexed NMR-Reporter Approach to Measure Cellular Kinase and Phosphatase Activities in Real-Time. J. Am. Chem. Soc. 137 (20), 6468-6471 (2015).
  31. Smith, M. J., Marshall, C. B., Theillet, F. -X., Binolfi, A., Selenko, P., Ikura, M. Real-time NMR monitoring of biological activities in complex physiological environments. Curr. Opin. Struct. Biol. 32, 39-47 (2015).
  32. Theillet, F. X., Rose, H. M., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
  33. Bodart, J. -F., Wieruszeski, J. -M., et al. NMR observation of Tau in Xenopus oocytes. J. Magn. Reson. 192 (2), 252-257 (2008).
  34. Lippens, G., Landrieu, I., Hanoulle, X. Studying posttranslational modifications by in-cell NMR. Chem. Biol. 15, 311-312 (2008).
  35. Landrieu, I., Smet-Nocca, C., et al. Molecular implication of PP2A and Pin1 in the Alzheimer's disease specific hyperphosphorylation of Tau. PLoS One. 6, e21521(2011).
  36. Sibille, N., Huvent, I., et al. Structural characterization by nuclear magnetic resonance of the impact of phosphorylation in the proline-rich region of the disordered Tau protein. Proteins. 80 (2), 454-462 (2012).
  37. Schwalbe, M., Kadavath, H., et al. Structural Impact of Tau Phosphorylation at Threonine 231. Structure. 23 (8), 1448-1458 (2015).
  38. Amniai, L., Lippens, G., Landrieu, I. Characterization of the AT180 epitope of phosphorylated Tau protein by a combined nuclear magnetic resonance and fluorescence spectroscopy approach. Biochem. Biophys. Res. Commun. 412 (4), 743-746 (2011).
  39. Sottejeau, Y., Bretteville, A., et al. Tau phosphorylation regulates the interaction between BIN1's SH3 domain and Tau's proline-rich domain. Acta Neuropathol. Commun. 3 (1), (2015).
  40. Joo, Y., Schumacher, B., et al. Involvement of 14-3-3 in tubulin instability and impaired axon development is mediated by Tau. FASEB J. 29 (10), 4133-4144 (2015).
  41. Smet, C., Duckert, J. F., et al. Control of protein-protein interactions: structure-based discovery of low molecular weight inhibitors of the interactions between Pin1 WW domain and phosphopeptides. J. Med. Chem. 48 (15), 4815-4823 (2005).
  42. Milroy, L. -G., Bartel, M., et al. Stabilizer-Guided Inhibition of Protein-Protein Interactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 54 (52), 15720-15724 (2015).
  43. Smet, C., Sambo, A. V., et al. The peptidyl prolyl cis/trans-isomerase Pin1 recognizes the phospho-Thr212-Pro213 site on Tau. Biochemistry. 43 (7), 2032-2040 (2004).
  44. Landrieu, I., Smet, C., et al. Exploring the molecular function of PIN1 by nuclear magnetic resonance. Curr Protein Pept Sci. 7 (3), 179-194 (2006).
  45. Lippens, G., Landrieu, I., Smet, C. Molecular mechanisms of the phospho-dependent prolyl cis/trans isomerase Pin1. FEBS J. 274 (20), 5211-5222 (2007).
  46. Smet-Nocca, C., Launay, H., Wieruszeski, J. M., Lippens, G., Landrieu, I. Unraveling a phosphorylation event in a folded protein by NMR spectroscopy: phosphorylation of the Pin1 WW domain by PKA. J. Biomol. NMR. 55, 323-337 (2013).
  47. Smet-Nocca, C., Wieruszeski, J. M., Melnyk, O., Benecke, A. NMR-based detection of acetylation sites in peptides. J. Pept. Sci. 16 (8), 414-423 (2010).
  48. Kamah, A., Huvent, I., et al. Nuclear magnetic resonance analysis of the acetylation pattern of the neuronal Tau protein. Biochemistry. 53 (18), 3020-3032 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

TauIn VitroNMR

מאמרים קשורים