הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Assay המוגלובין המהיר ללא כימיקלים עם פיזור photothermal זוויתי אור

9.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55006

⸱

7 בדצמבר 2016

 ,  ,  ,  , 
1School of Mechanical Engineering, Yonsei University, 2Department of Laboratory Medicine, Yonsei University

במאמר זה

סיכום

חיישן פיזור אור זוויתי פוטו-תרמי (PT-AS) מאפשר בדיקת המוגלובין מהירה ונטולת כימיקלים של דגימות דם בקנה מידה ננו-ליטר. כאן מסופקים פרטים על מערך PT-AS ופרוטוקול מדידה לריכוז ההמוגלובין בדם. מוצגות גם תוצאות מייצגות לדגימות דם אנמיות.

תקציר

תמונת תרמית פיזור אור זוויתי (PT-AS) הוא שיטה אופטית חדשה למדידת ריכוז המוגלובין ([Hb]) של דגימות דם. על סמך תגובת photothermal הפנימית של מולקולות ההמוגלובין, החיישן מאפשר רגישות גבוהה, מדידה ללא הכימי של [Hb]. [Hb] יכולת איתור עם הגבלה של 0.12 g / dl מעל בטווח של 0.35 - 17.9 g / dl הודגמה בעבר. השיטה יכולה להיות מיושמת בקלות באמצעות מכשירי צריכה אלקטרוניים זולה כגון מצביע ליזר ומצלמת אינטרנט. שימוש צינור מייקרו-נימים כמכל דם גם מאפשר assay המוגלובין עם נפח דם nanoliter בקנה מידה ובעלות תפעול נמוכה. הנה, הנחיות מפורטות הליכי עיבוד התקנת אות PT-AS אופטיים מוצגות. פרוטוקולי ניסוי ותוצאות נציגי דגימות דם בתנאים אנמית ([Hb] = 5.3, 7.5, ו -9.9 גרם / ד"ל) ניתנים גם, והמדידות מושוות עם אלה הלוך ושובמנתח המטולוגיה ma. הפשטות שלה ביישום ותפעול צריך לאפשר אימוץ רחב במעבדות קליניות הגדרות משאב מוגבל.

מבוא

בדיקת דם מבוצעת בדרך כלל כדי להעריך בריאות אדם כוללת וכדי לזהות סמנים ביולוגיים הקשורים למחלות מסוימות. לדוגמא, ריכוז כולסטרול בדם משמש כקריטריון היפרליפידמיה, אשר קשור קשר הדוק למחלות לב וכלי דם דלקת בלבלב. התכנים הגלוקוז בדם צריכים להימדד בתדירות גבוהה, ככל שרמת הגלוקוז קשורה סיבוכים כגון בחמצת סוכרתית ותסמונת hyperosmolar hyperglycemic. מחלות קשות כמו מלריה, נגיף הכשל החיסוני האנושי אֵידְס מאובחנים על ידי בדיקות דם, וכימות של מרכיבי הדם כולל אריתרוציטים, טרומבוציטים, ו לויקוציטים מאפשר הקרנת הלבלב ומחלות כליה.

המוגלובין (Hb), מרכיב קריטי של דם, המרכיבה כ -96% של אריתרוציטים, ומעביר חמצן איברים אנושיים. שינוי משמעותי של ריכוז המסה שלו ([Hb]) עשוי להצביע לישינויי tabolic, מחלות כיס, ונוירולוגיות, לב וכלי דם והפרעות endocrinological 1. [Hb] ולכן נמדדת באופן שגרתי בדיקות דם. בפרט, בחולים אנמיים, חולי דיאליזה, ונשים הרות מומלץ בחום לעקוב אחר [Hb] כמשימה חיונית 2.

שיטות זיהוי [Hb] שונות ובכך פותחו. השיטה ציאניד המוגלובין, אחת הטכניקות הנפוצות ביותר עבור [Hb] כימות, מעסיקה אשלגן ציאניד (KCN) להרוס את bilayer השומנים של אריתרוציטים 3. ההמוגלובין ציאניד המיוצר על ידי הקליטה הגבוהה המייצגת הכימי סביב 540 ננומטר; ומכאן, [Hb] מדידות יכולות להתבצע באמצעות ניתוח colorimetric. שיטה זו היא מועסק נרחבת בשל הפשטות שלה, אבל הכימיקלים המועסקים (למשל, KCN ותחמוצת dimethyllaurylamine) הם רעילים לאדם ולסביבה. ערכת המטוקריט מודדת את יחס הנפח של תאי דם אדומים בהשוואת כרך הדם הכוללume דרך ההפרדה צנטריפוגליים; אולם זה דורש נפח דם גדול יחסית (50-100 μl) 4. מדד שיטות spectrophotometry [Hb] בדיוק ללא כל כימיקלים, אבל מדידות באורכי גל מרובים נפח דם גדול נדרשים 5,6. באופן דומה, כמה שיטות אופטיות למדידה [Hb] הוצעו כולל שיטות זיהוי המבוססות על פיזור אור, אבל דיוק המדידה שלהם תלויות מאוד על הדיוק של מודל הדם התיאורטי.

כדי להתגבר על המגבלות האלה, [Hb] שיטות זיהוי המבוססות על אפקט photothermal (PT) של המוגלובין לאחרונה הוצעו 7. Hb, אשר מורכב בעיקר של תחמוצות ברזל, סופג אור ב 532 ננומטר וממיר את אנרגיית האור לחום 8-10. עלייה בטמפרטורה PT זה ניתן לאתר אופטית ידי מדידת שינוי מקדם השבירה (RI) של דגימות דם. Yim et al. reflectometr קוהרנטיות רפאים-תחום מועסקות האופטיותy למדוד את שינוי נתיב באורך אופטי PT בתא דם המכיל 11. למרות השיטה מאפשרת ללא כימיקלים וישיר [Hb] המדידה, השימוש ספקטרומטר ואת הסדר interferometric עלול לעכב המזעור שלה. לאחרונה הציגו חלופה [Hb] שיטת זיהוי, כינת חיישן צילום תרמי פיזור אור זוויתי (PT-AS), אשר מתאים יותר מזעור תקן 12. חיישן PT-AS מנצל את רגישות RI הגבוהה של interferometry פיזור הגב (BSI) כדי למדוד שינויי PT ב RI של דגימת דם בתוך צינור נימים. BSI כבר נוצלו כדי למדוד RI של פתרונות שונים 13-15 וכדי לפקח אינטראקציות ביוכימי בתמיסה חינם 16. חיישן PT-AS מעסיק הסדר אופטי דומה כמו BSI, אך משלב התקנת עירור photothermal למדוד גידול PT של RI בדגימות דם. עקרונות הפעלה של BSI וחיישני PT-AS מתוארים בפירוט במקום אחר 12,15. חיישן PT-AS הפגין רגישות גבוהה [Hb] מדידה על פני טווח גילוי רחב (0.35-17.9 g / dl) והוא מסוגל לפעול עם כרכים מדגמים של <100 NL. אין נפשי מראש של דגימת דם נדרש, ואת זמן המדידה הוא רק ~ 5 שניות. הנה, הגדרת הניסוי ואת פרוטוקול מדידה מפורט מתוארת. נציג תוצאות PT-AS ניתנים באמצעות דגימות דם מחולים אנמית, והתוצאות לעומת נגד מי מן מנתח המטולוגיה להעריך את הדיוק של חיישן PT-AS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ניסויים עם דגימות דם בוצעו ציות לחוקים הרלוונטיים והנחיות מוסדיות. הדגימות היו דגימות דם שיורית כי נרכשו ומעובד בבדיקות קליניות במוסד.

1. הגדרה אופטית PT-AS

הערה: אפשר להשתמש בצינור מייקרו-נימים ריק עבור התקנת PT-AS ראשונית.

  1. הר צינור מיקרו-נימי ריק בקטרים ​​הפנימיים והחיצוניים של 200 עד 330 מיקרומטר, בהתאמה, ובאורך של יותר מ ~ 5 ס"מ על אביזר צינור נימי. , זמין מסחרית גופי סיבים יכול לשמש אביזר צינור.
  2. מאובטח לעגן מצביע לייזר 650 ננומטר, כלומר, לחקור מקור האור, להאיר את צינור נימי. אלומת החללית צריכה להיות גדולה יותר מאשר צינור הנימים. הניח מסך (למשל, נייר לבן) מאחורי צינור הנימים להתבונן דפוס תקופתי זוויתי.
  3. עבור חלק זיהוי, להסיר עדשות שום מצלמת אינטרנט כדי ללכוד את scatt ישירותering דפוס. מקם את המצלמת מאחורי צינור הנימים בזווית של 25-35 מעלות ביחס לכיוון קורה בדיקה. ודא כי הדפוס התקופתי זוויתי המיוצר על ידי צינור הנימים ניתן למדוד עם הגלאי (איור 1). לבחון את הדפוס התקופתי זוויתי באמצע חיישן התמונה כאשר חיישן התמונה ממוקם בצורה נכונה.
  4. מקם מקור אור עירור PT 532 ננומטר כדי להאיר את צינור הנימים. מקם את מקור אור PT בכל זווית, כל עוד אור עירור PT חופף קרן בדיקה על צינור הנימים ואינו מגיע אל הגלאי ישירות. PT עירור של דגימות דם באמצעות כוח אופטי גבוה בדרך כלל משפר את PT-AS רגישה, כפי שהוא מוביל לשינוי גדול יותר של RI.
    1. השתמש הכח האופטי הגבוה ביותר של מקור אור עירור PT המועסק. בנוסף, מוודא שנורית עירור PT חופפת את האור החללי על צינור הנימים. השתמש גודל אלומת אור עירור PTלפחות כפול מזה של האור החללי כדי לחמם את נפח החללית כולה.
  5. מקום מסנן ארוך לעבור מול הגלאי לחסום את אור 532 ננומטר ולמדוד רק האור החללי 650 ננומטר.
  6. תקן מסוק אופטי בנתיב של אור עירור PT לפני מאיר את צינור הנימים. המסוק האופטי מועסק לווסת את עוצמת אור עירור PT.

2. הכנת דגימת דם

  1. צייר 6 מיליליטר של דם מלא טרי במצב אנמי לתוך צינורות דגימת דם ethylenediaminetetraacetic חומצה, ומערבב את הדגימות היטב. אין עיבוד אחר נדרש.
  2. מדוד את דגימות הדם באמצעות חיישן PT-AS תוך 24 שעות ממוצא למנוע קרישה.

3. פרוטוקולי מדידת PT-AS

  1. טען צינור מיקרו-נימי עם דגימת דם כדי למדוד. מלא את צינור נימים עם הדם דרך פעולת נימים ידי נחת הצינור לתוך ים הדםמַסְפִּיק. היקף המדגם המינימאלי הנדרש למדידה נקבע לפי הקוטר הפנימי של הצינור נימי ואת גודל קרן בדיקה.
    1. להעסיק צינור בקוטר פנימי של 200 מיקרומטר. גודל אלומת החללית היתה 2 מ"מ בתוצאות נציג, דבר המצביע על כך המדידה יכולה להתבצע עם נפח דגימה של> 63 NL.
  2. הר צינור הנימים במיקום המיועד שבתוך בית הנורה.
  3. הפעל את הלייזר החללית 650 ננומטר כדי להאיר את צינור מיקרו-נימי טעון-דם. הדפוס התקופתי זוויתי יש לשים לב עם מצלמת האינטרנט.
  4. הפעל את הלייזר עירור PT 532 ננומטר כדי להאיר את הצינור.
  5. הפעל את המסוק האופטי לווסת את עוצמת אור עירור PT ב -2 הרץ.
    הערה: הרציונל לבחירת מצב הפעלה זו מתואר דיון וקים ואח '. 12.
    1. הר גלגל מסוק ב במכלול ראש המנוע של המסוק האופטימערכת.
    2. הפעל את תיבת בקרת מסוק, ולהשתמש ידית השליטה במסוף כדי להגדיר את תדירות האפנון.
    3. הפעל את המסוק באמצעות ידית שליטה.
  6. רשום את דפוס תנודות פיזור באמצעות מצלמת 5 שניות בפורמט MPEG-4 (MP4).

4. עיבוד אותות

הערה: עיבוד אותות PT-AS בוצעה באמצעות קוד MATLAB שפותח במעבדה.

  1. טען את קובץ וידאו כדי לחלץ את התמונות. עבור כל תמונה [ראה איור 2 (א) עבור תמונה מייצגת] יש לקבל את דפוס פיזור בממוצע על ידי חישוב הממוצע של ערכי הפיקסלים לאורך בכיוון האנכי [איור 2 (ב, ג)].
  2. להעריך את ההתמרה של דפוס פיזור בממוצע, ולחשב את השלב בתדר המרחבי השיא. בצע פעולות אלה עבור כל המסגרות של כל התמונות המוקלטות.
  3. באמצעות ערכי השלב מתקבלים מכל התמונות, עלילת השלב הזמניתנודות [איור 2 (ד)]. ראוי לציין, כי בשלב משתנה בתדר אפנון PT. קח את ההתמרה של התנודות בשלב במישור הזמן, ולקבל את הגודל בתדר האפנון. איתות זה המכונה PT-כאות [איור 2 (ה)].
  4. מדוד את [Hb] של דגימת דם על ידי המרת האות PT-AS שלה לתוך המקביל [Hb] באמצעות עקומת כיול כי מתקבל בפרוטוקול 5.

5. PT-AS כיול

  1. הכינו דגימות דם, שיש [Hb] ערכים המופצות באופן אחיד את טווח הגילוי של החיישן PT-AS (למשל, 0 - 18 גר '/ ד"ל).
  2. לפני הכיול, לכמת את [Hb] ערכים של דגימות באמצעות נתח המטולוגיה התייחסות. מדוד את אותות PT-AS של הדגימות.
  3. לגזור עקומת כיול הקשורים [Hb] לאות PT-AS על ידי ביצוע ליניארי לפחות ריבועים להתאים, [Hb] = A [איתותים PT-AS] + B, של experimentaתוצאות l. לקבלת תנאי ההפעלה שצוינו בטבלת 1, היחס בין [Hb] ואת אות PT-AS נמצא [Hb] = 5.13 [אות PT-AS] - 0.09. השתמש בקוד MATLAB לבצע את ההתאמה ליניארי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

Assay המוגלובין בוצע באמצעות חיישן PT-AS, ומידותיו הושוו לאלה מן מנתח המטולוגיה. הניסוי נערך עם עוצמת אור עירור PT של 1.4 W / 2 סנטימטר, תדירות אפנון PT של 2 הרץ, ומדידת זמן של 5 שניות. טבלה 1 מסכמת את תנאי הניסוי. גדלי אלומת אור בדיקת PT העירור היו 5.5 ו -2 מ"מ, בהתאמה. מצלמת האינטרנט רשמה את התמונות בקצב פריימים של 30 פריימים לשנייה. עבור מדידה, דגימות דם אנמית עם שלושה ריכוזים שונים Hb הועסקו. לפני מדידות PT-AS, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

חיישן PT-AS מייצג שיטה כל-אופטית מסוגלת מדידה ישירה [Hb] של דגימות דם לא מעובד. השיטה מכמתת [Hb] בדם באמצעות תגובת PT הפנימית של מולקולות ההמוגלובין אריתרוציטים. תחת תאורה ידי אור 532 ננומטר, מולקולות המוגלובין לספוג את אנרגיית האור ולייצר חום. עליית הטמפרטורה כתוצאה משנה את RI של דגימת דם. רגישות RI הגבוהה של BSI נוצלה כדי למדוד שינוי RI זה בדם. בעבר הראינו כי חיישן PT-AS מאפשר [Hb] מדידה עם גבול גילוי של 0.12 g / dl פני הטווח של 0.35-17.9 g / dl, אשר ניתן להשוות לזה של מסחרי [Hb...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי תוכניות המחקר של קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) (NRF-2015R1A1A1A05001548 ו-NRF-2015R1A5A1037668).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מצביע לייזר 650 ננומטרLASMACLED-1אור בדיקה
נימי זכוכית עגולים חלוליםVitroComCV2033מיכל דגימת דם
מצלמת רשתחיישן אופטי LogitechC525CMOS
מערכת מסוק אופטיThorlabsMC2000-ECמסוק אופטי מסנן
פלסטיק ארוך מעבראדמונד#43-942כדי לדחות אור עירור PT 532 ננומטר
מהדק סיביםThorlabsSM1F1-250מתקן צינור נימי
צינור דגימת דם מצופה EDTAגריינר Bio-OneVACUETTE 454217דגימת דם ונוגד קרישה
סימנס AGADVIA 2120iמנתח המטולוגיה ייחוס
אופטי מנתח המטולוגיה

מקורות

  1. Mokken, F. C., Kedaria, M., Henny, C. P., Hardeman, M., Gelb, A. The clinical importance of erythrocyte deformability, a hemorrheological parameter. Ann. Hematol. 64 (3), 113-122 (1992).
  2. Rosenblit, J., et al. Evaluation of three methods for hemoglobin measurement in a blood donor setting. Sao Paulo Medical Journal. 117 (3), 108-112 (1999).
  3. Van Kampen, E., Zijlstra, W. Standardization of hemoglobinometry II. The hemiglobincyanide method. Clin. Chim. Acta. 6 (4), 538-544 (1961).
  4. Billett, H. H. Hemoglobin and hematocrit. Clinical Methods: The History, Physical, and Laboratory Examinations. 3, (1990).
  5. Kuenstner, J. T., Norris, K. H., McCarthy, W. F. Measurement of hemoglobin in unlysed blood by near-infrared spectroscopy. Appl. Spectrosc. 48 (4), 484-488 (1994).
  6. Zwart, A., et al. A multi-wavelength spectrophotometric method for the simultaneous determination of five haemoglobin derivatives. Clin. Chem. Lab. Med. 19 (7), 457-464 (1981).
  7. Kwak, B. S., et al. Direct measurement of the in vitro hemoglobin content of erythrocytes using the photo-thermal effect of the heme group. Analyst. 135 (9), 2365-2371 (2010).
  8. Lapotko, D., Lukianova, E. Laser-induced micro-bubbles in cells. International Journal of Heat Mass Transfer. 48 (1), 227-234 (2005).
  9. Lapotko, D. O. Laser-induced bubbles in living cells. Lasers in surgery and medicine. 38 (3), 240-248 (2006).
  10. Lapotko, D. O., Romanovskaya, T. yR., Shnip, A., Zharov, V. P. Photothermal time-resolved imaging of living cells. Lasers in surgery and medicine. 31 (1), 53-63 (2002).
  11. Yim, J., et al. Photothermal spectral-domain optical coherence reflectometry for direct measurement of hemoglobin concentration of erythrocytes. Biosens. Bioelectron. 57, 59-64 (2014).
  12. Kim, U., et al. Capillary-scale direct measurement of hemoglobin concentration of erythrocytes using photothermal angular light scattering. Biosens. Bioelectron. 74, 469-475 (2015).
  13. Sørensen, H. S., Larsen, N. B., Latham, J. C., Bornhop, D. J., Andersen, P. E. Highly sensitive biosensing based on interference from light scattering in capillary tubes. Appl. Phys. Lett. 89 (15), 151108(2006).
  14. Swinney, K., Markov, D., Bornhop, D. J. Ultrasmall volume refractive index detection using microinterferometry. Rev. Sci. Instrum. 71 (7), 2684-2692 (2000).
  15. Tarigan, H. J., Neill, P., Kenmore, C. K., Bornhop, D. J. Capillary-scale refractive index detection by interferometric backscatter. Anal. Chem. 68 (10), 1762-1770 (1996).
  16. Bornhop, D. J., et al. Free-solution, label-free molecular interactions studied by back-scattering interferometry. science. 317 (5845), 1732-1736 (2007).
  17. Yang, X., et al. Simple paper-based test for measuring blood hemoglobin concentration in resource-limited settings. Clin. Chem. 59 (10), 1506-1513 (2013).
  18. Zhu, H., et al. Cost-effective and rapid blood analysis on a cell-phone. Lab Chip. 13 (7), 1282-1288 (2013).
  19. Pogačnik, L., Franko, M. Detection of organophosphate and carbamate pesticides in vegetable samples by a photothermal biosensor. Biosens. Bioelectron. 18 (1), 1-9 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Assay המוגלובין המהיר ללא כימיקלים עם פיזור photothermal זוויתי אור
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.