הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

במבחנה בידול של האדם CD4 + FOXP3 + מושרה תקינה בתאי T (iTregs) מ נאיבית CD4 + T תאים באמצעות פרוטוקול TGF-β-המכיל

20.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55015

⸱

30 בדצמבר 2016

 ,  ,  , 
1Unit of Computational Medicine, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, & Science for Life Laboratory

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את דור phenotyping לשחזור של תאי T רגולטוריים מושרה אדם (iTregs) מתאי CD4 + T נאיביים במבחנה. פרוטוקולים שונים לזירוז FOXP3 לאפשר לחקר פנוטיפים iTreg הספציפיים שהושגו עם פרוטוקולי בהתאמה.

תקציר

תאי T רגולטוריים (Tregs) הם חלק בלתי נפרד מסבילות היקפית, מדכאים תגובות חיסוניות כנגד מבנים עצמיים ובכך מונעים מחלות אוטואימוניות. גישות קליניות להעברת Tregs לאימוץ, או לדלדול Tregs בסרטן, נמצאות בעיצומן עם תוצאות ראשונות מבטיחות.

מכיוון שמספר ה-Tregs המופיעים באופן טבעי (nTregs) מוגבל מאוד, חקר תכונות מסוימות של Treg באמצעות Tregs המושרים במבחנה (iTregs) יכול להיות יתרון. נכון להיום, סמן החלבון הטוב ביותר אם כי לא ספציפי לחלוטין לתיחום Tregs הוא גורם השעתוק FOXP3. למרות החשיבות של Tregs כולל תפקידים לא מיותרים של Tregs המושרים היקפית, הפרוטוקולים ליצירת iTregs שנויים במחלוקת כיום, במיוחד עבור תאים אנושיים. פרוטוקול זה מתאר אפוא את ההתמיינות במבחנה של CD4+FOXP3+ iTregs אנושיים מתאי T נאיביים אנושיים תוך שימוש במגוון גורמים מעוררי Treg (TGF-β בתוספת IL-2 בלבד, או השילוב שלהם עם חומצה רטינואית, רפמיצין או בוטיראט) במקביל. הוא גם מתאר את הפנוטיפ של תאים אלה על ידי זרימה ציטומטרית ו-qRT-PCR.

פרוטוקולים אלה מביאים לביטוי ניתן לשחזור של FOXP3 וגנים אחרים של חתימת Treg ומאפשרים לחקור מנגנוני ויסות כלליים של FOXP3 כמו גם השפעות ספציפיות לפרוטוקול כדי לתאר את ההשפעה של גורמים מסוימים. ניתן להשתמש ב-iTregs כדי לחקור היבטים פנוטיפיים שונים כמו גם מנגנונים מולקולריים של אינדוקציה של Treg. מחקרים מולקולריים מפורטים מתאפשרים על ידי מספר תאים גדול יחסית שניתן להשיג.

מגבלה ליישום iTregs היא חוסר היציבות היחסי של ביטוי FOXP3 בתאים אלה בהשוואה ל-nTregs. iTregs שנוצרו על ידי פרוטוקולים אלה יכולים לשמש גם למבחנים פונקציונליים כגון חקר תפקודם המדכא, שבו iTregs המושרים על ידי TGF-β בתוספת חומצה רטינואית ורפמיצין מציגים פעילות דיכוי מעולה. עם זאת, יכולת הדיכוי של iTregs יכולה להיות שונה מ-nTregs והשימוש בבקרות מתאימות הוא קריטי.

מבוא

CD4 + CD25 + FOXP3 + תאי T רגולטוריים (Tregs) לדכא תאי חיסון אחרים והם מתווכים קריטיים של סובלנות היקפית, אוטואימוניות במניעת 1 דלקת מופרזת. חשיבותה של Tregs מודגמת על ידי enteropathy האדם המחלה immunodysregulation polyendocrinopathy תסמונת ה- X-צמודות (אייפקס), שבו אובדן Tregs עקב מוטציות בשנות ה P3 תיבת forkhead גורם שעתוק Treg master' (FOXP3) מוביל למחלות אוטואימוניות מערכתי חמור, קטלן בגיל צעיר. עם זאת, Tregs לפעול כחרב פיפיות במערכת החיסונית: הם גם יכולים להפריע חסינות אנטי סרטנית במסגרות מסוימות 2. מניפולציה טיפולית של מספר ותפקוד Treg לפיכך כפופה חקירות קליניות רבות. בשנת סרטן, דלדול של Tregs יכול להיות רצוי והצלחה חלק גישות קליניות מעודדת מחקר נוסף 3. במחלות אוטואימוניות ודלקתיות, בנוסף השפעות טיפוליות של Tregs ב seveמודלי עכבר מחל RAL, ניסויים-האדם ראשונים האחרונים של העברת מאמצת Treg למנוע graft- מול מחל -host (GvHD) 4 - 7 ועל מנת להעריך את בטיחות בטיפול בסוכרת סוג 1 8 הראו תוצאות מבטיחות מאוד.

בטבע הופעת Tregs (nTregs) מהווה tTregs נגזרות הרתי ואת שולה מושרה pTregs, עם פונקציות חיוניות לא יתירים בשמירה על בריאות 9 - 11. עם זאת, מספרי nTreg מוגבלים, עידוד הגישה המשלימה של Tregs התרמה (iTregs) במבחנה מן מבשרי תא T נאיביים 12. עדיין יציבות iTregs, ככל הנראה בשל חוסר demethylation באזור demethylated שנקרא Treg הספציפי (TSDR) ב לוקוס גן FOXP3 13, נותרת חשש וכמה מחקרים מצביעים על כך in vivo מושרה Tregs יציבים יותר 14.

נכון להיום, FOXP3 נשאר מ 'החלבון הטוב ביותרarker עבור Tregs אבל זה לא ספציפי לחלוטין כי תאי CD4 + T CD25- קונבנציונאלי אדם זמני מבטאים רמות ביניים של FOXP3 באקטיבציה 15,16. למרות התקדמות משמעותית נעשתה הבהרת בקרת הביטוי FOXP3, הרבה נשאר להתגלות לגבי אינדוקציה, יציבות ותפקוד של FOXP3 במיוחד בתאים אנושיים. למרות ההבדלים כדי nTregs, במבחנה המושרה FOXP3 + CD4 + T תאים יכול לשמש כמערכת מודל ללמוד המנגנונים המולקולריים של אינדוקציה FOXP3 ו כנקודת המוצא לפיתוח פרוטוקולים בעתיד המאפשרים דור iTregs כי הם דומים יותר ב vivo שנוצר Tregs, אשר יכול להיות רלוונטי עבור אסטרטגיות העברת מאמצת בעתיד.

יש `אין פרוטוקול הזהב standard' לגרום iTregs אדם, ופרוטוקולים נוכחיים פותחו בהתבסס על מחק תנאי Treg וישכנע in vivo: אינטרלוקין 2 (IL-2) והאיתות גורם הגדילה הפיכת β (TGF-β) הם קריטיים לזירוז FOXP3 in vivo 17, וכל-טרנס החומצה הרטינואית (ATRA) - אשר מופק in vivo על ידי תאים דנדריטים הקשורים במעיים - משמש לעתים קרובות כדי לשפר אינדוקציה FOXP3 במבחנה 18 - 21. פתחנו פרוטוקולי Treg וישכנעו אדם נוספים באמצעות בוטיראט 22, בטן חיידקים נגזרת חומצת שומן קצרה שרשרת אשר הוצגה לאחרונה להגדיל בעכברי Treg אינדוקציה 23,24. אנחנו גם קימה לאחרונה פרוטוקול חדש עבור דור של iTregs עם פונקציה מדכאת מעולה במבחנה באמצעות שילוב של TGF-β, ATRA ו Rapamycin 22, האחרון הוא יעד יונק אשר קליני של rapamycin (mTOR) מעכב כי ידוע כדי לקדם תחזוקת FOXP3 במהלך התרחבות אדם Treg 25,26.

שיטה זו מתארת את לשחזורדור במבחנה של CD4 אדם + FOXP3 + iTregs באמצעות סדרה של תנאים שונים, phenotyping הבא שלהם על ידי cytometry זרימת תגובת שרשרת פולימראז השעתוק כמוני הפוך (qRT-PCR) לחשוף את דפוסי פרוטוקול ספציפי ביטוי של FOXP3 ומולקולות חתימת Treg אחרים כגון כמו CD25, CTLA-4, EOS, כמו גם הדיכוי של-γ IFN ו- SATB1 הביטוי 22. אוכלוסיות התאים שנוצרו יכולות לשמש מבחנים תפקודיים לגבי פעילות מדכאת או עבור מחקרים מולקולריים, בין אם בנוגע רגולטורי FOXP3 כלליים או ללמוד השפעות ספציפיות תרכובות מסוימות כגון בוטיראט או rapamycin. הבנה נוספת של מנגנונים מולקולריים נהיגת בידול Treg רלוונטית ביותר עבור גישות טיפוליות עתידיות אוטואימוניות או סרטן למקד מולקולות מעורבות במיוחד בדור Treg ותפקוד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

תאי דם היקפיים mononuclear האדם (PBMCs) היו מבודדים טרי מ מעילים באפי מתורם בריא ואנונימי שנקנו החולים האוניברסיטאי קרולינסקה שבשבדיה. היתר אתי עבור הניסויים התקבל המועצה לביקורת האתית האזורית בשטוקהולם (Regionala etikprövningsnämnden אני שטוקהולם), שוודיה (מספר אישור: 2013 / 1458-1431 / 1).

1. בידוד תא T מ דם היקפי

  1. בידוד PBMC
    1. צפיפות צנטריפוגה טרום שכב 15 מ"ל בינוני (כגון Ficoll) פתרון ב 50 מ"ל צינורות (5 צינורות לכל מעיל באפי). טרום חמים לטמפרטורת החדר.
    2. מלאו את המעיל באפי עם בופר פוספט (PBS) (בטמפרטורת החדר) 180 מ"ל. אם דם טרי משמש, לדלל דם עם נפח שווה של PBS.
    3. צינור הטית לצד ובינוני צנטריפוגה צפיפות כיסוי לאט עם ~ 35 מיליליטר דם מדולל לכל צינור. מוסיפים את הדם בזהירות רבה, ללא כל ערבוב של צנטריפוגה צפיפות medשלב ium שכבת הדם.
    4. צנטריפוגה 20 דקות ב 1,150 XG בטמפרטורת החדר ללא בלם. הפעל את צנטריפוגות ללא בלם ואם אפשר עם נמוך להאצה בינונית כדי למנוע ערבוב של השכבות.
    5. קח את טבעת לבן המכיל PBMCs בין מדיום צנטריפוגה צפיפות ואת שלב הפלזמה. מעבירים צינור חדש 50 מ"ל (1 זמן עם פיפטה 5 מ"ל ו -2 פעמים עם 2 מ"ל פיפטה פלסטיק-פסטר). לקחת קצת כמו פלזמה אפשרית ובינוני צנטריפוגה צפיפות. אל תיגעו גלולה הכדורית האדומה.
    6. לשטוף PBMCs. פיצול PBMCs לתוך 50 מ"ל צינורות (4 צינורות לכל מעיל באפי). ממלאים כל 50 מ"ל עם PBS.
    7. צנטריפוגה 450 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    8. סר וזורק supernatant, לרכז את התאים לתוך 1 שפופרת עם 10 מיליליטר סרום RPMI / 10% עוברי עגל (FCS) בינוני ו resuspend היטב. אם גושי תאים נוכחים, תאי זן דרך מסננת תא 40 מיקרומטר.
    9. עבר תאי בקבוק תרבית תאי T175 מודעהתאי Herent. לשטוף צינורות עם 40 בינוני מ"ל ולשלב עם תאים (50 מ"ל סה"כ). במידת הצורך, להסיר aliquot לניתוח cytometry זרימה (ראה שלב 1.4). בדרך כלל, CD4 + T תאים מהווים כ 30-40% של תאים בשער לימפוציטים, ותאי T נאיביים מהווים כ 30 עד 60% של תאי CD4 + T תלויים התורם.
    10. דגירה תאים בהנחת הבקבוק עבור 45 עד 90 דקות ב 37 2 ° C / 5% CO. שלב זה יהיה לרוקן מונוציטים ידי דבקות פלסטיק. זה לא חובה, אבל יגדיל את התשואה תא אחוז T לכל כמות PBMCs בשלבים הבאים.
    11. תאי Resuspend (ב 50 המ"ל כלול בינוניים הבקבוק) ולשטוף שכבת תאים בחלק התחתון של הבקבוק היטב. פזר התאים באופן שווה לשתי צינורות 50 מ"ל (הצינורות הקודם ניתן להשתמש בהן שוב ושוב על אותו התורם). לשטוף הבקבוק עם 50 מ"ל טרי RPMI / 10% בינוני FCS, ולהעביר באופן שווה לאותו 2 צינורות.
      הערה: PBMCs ניתן לאחסן לילה בשעת 4 ° C עם צינורות סמיכיםבצד, או באופן אידיאלי, להשתמש בהם ישירות על בידוד תא T.
  2. בידוד nTreg ידי מיון התא מגנטי מופעל
    1. הכן חיץ בידוד: 0.5% (w / v) אלבומין אנושי 2 mM EDTA ב PBS. שמור תמיד חיץ על 4 מעלות צלזיוס. לחלופין כדי אלבומין אנושי, להשתמש אלבומין שור.
    2. Resuspend ולספור PBMCs עם דלפק תא אוטומטי או ידני בנוכחות trypan כחול (לא סופרים טסיות קטן). אם גושי תאים הם נצפו, תאי זן דרך מסננת תא 40 מיקרומטר.
    3. PBMCs צנטריפוגה ב 450 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. תאים Resuspend (עם 1 מ"ל pipet) במאגר בידוד 90 μl לכל 10 7 PBMCs לקבל השעיה תא בודד. שמור את התאים ב -50 צינורות מ"ל המקורי (2 צינורות לכל מעיל באפי).
    5. מוסיפים 2 חרוזים CD25 μl לכל 10 7 תאים, לערבב, ו דגירה במשך 15 דקות ב 4 °.
    6. מלאו עם PBS 30 מ"ל. צנטריפוגה ב 450 XG במשך 10 דקות ב 46; C.
    7. הכן עמודות LS (2 לכל מעיל באפי): לאזן עם חיץ בידוד 3 מ"ל, וזורקים לזרום. צינורות ניתן להשתמש בהן שוב ושוב לשטוף עמודות נוספות.
    8. תאים Resuspend במאגר 3 מ"ל בידוד לכל צינור (עם 1 מ"ל pipet). העברת התאים LS טור, ולאסוף הזרימה דרך צינורות 15 מ"ל טריים.
    9. שוטפים את צינורות 50 מ"ל עם 2 מ"ל בידוד חיץ כל. העברת שטיפת חיץ כדי העמודים.
    10. 2x טור לשטוף עם 3 מ"ל בידוד חיץ כל. תמיד לחכות עד עצר הטור מטפטף, לפני הוספת כל נוזל חדש. חנות לזרום ב 4 ° C עבור צעדים מאוחר יותר.
    11. הסר עמודה מגנט. Elute 2x עם 3 מ"ל בידוד חיץ לכל עמודה לתוך 15 צינור מ"ל.
      הערה: eluate מ 2 טורים תורמים יכולה להיות משולבת. אין לטבול את העמודה לתוך הנוזל.
    12. הכן לאזן עמודות LS החדשה (1 עמודה לכל מעיל באפי). מעבירים את eluate מ 1.2.11 לעמודה. זרימת דרך יכולה להיות מושלך. לאחר eluate יש פאסהד דרך העמודה, לשטוף צינור ולשטוף 3x העמודה עם חיץ 3 מ"ל בידוד.
      הערה: הטור השני נדרש, אפוא, צורך להגדיל טוהר.
    13. הסר עמודה מגנט. "NTregs" ++ Elute CD25 2x עם 3 מ"ל בידוד חיץ.
    14. צנטריפוגה ב 450 XG במשך 10 דקות ב 4 °. הסר supernatant לחלוטין.
    15. שטוף תאים עם מדיום תרבות 15 מיליליטר T תא, צנטריפוגות ב 450 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C. הסר supernatant לחלוטין.
    16. תאים Resuspend במדיום תרבות 0.5 מ"ל T התא, בתוספת 100 IU / ml IL-2, כל אחד. העברת תאים לצלחת 24 באר. צינור לשטוף עם 0.5 מ"ל בינוני (+ 100 IU / ml IL-2) ולשלב לתוך צלחת 24 גם.
    17. רוזן nTregs (כמו בשלב 1.2.2). התשואה היא בדרך כלל כ 1-4 x 10 6 Tregs לכל המעיל באפי. התאם צפיפות של Tregs 1-2 x 10 6 תאים / מ"ל עם מדיום תרבית תאים T + 100 IU / ml IL-2.
    18. דגירה Tregs ב 37 ° C / 5% CO 2 עד השימוש.
  3. בידוד תא הנאיבי CD4 + T על ידי מיון תא מגנטי מופעל
    הערה: קח לזרום דרך משלב 1.2.8-1.2.10 להמשיך בידוד תא. לחלופין, אם לא nTregs בודד, להמשיך ישירות PBMCs.
    1. שלב 2 צינורות לכל תורם של PBMCs מדולדל Treg ב 50 מ"ל צינור. מלאו עם PBS 50 מ"ל בטמפרטורת החדר.
    2. PBMCs צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר. סר וזורק supernatant. תאים Resuspend ב 50 מ"ל PBS.
    3. חזור על שלב 1.3.2 פעמים.
      הערה: שוטף PBS הוא קריטי עבור הסרת טסיות, אשר לא יוסרה עם ערכת הבידוד השלילית הבאה. טסיות להישאר supernatant ב צנטריפוגה במהירות נמוכה זה. דלדול טסיות ניתן לנטר הצעדים הבודדים בשקופית מיקרוסקופית. הצעדים צריכים להתבצע עם PBS centrifugations בטמפרטורת החדר.
    4. Resuspend PBMCs ב 50 מ"ל PBS. ספירת תאים כמו בשלב 1.2.2.
    5. PBMCs צנטריפוגה ב 450 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C. מחק תאים supernatant ו resuspend ב 40 חיץ בידוד μl (4 ° C) לכל 10 7 תאים.
    6. הוסף 10 μl של נאיבית CD4 + T Cell ביוטין-נוגדן הקוקטייל שני לכל 10 7 תאים.
    7. מערבבים, דגירה במשך 10 דקות ב 4 ° C.
    8. שטפו תאים על ידי הוספת 40 מ"ל PBS (4 ° C), ו צנטריפוגות ב 450 XG במשך 10 דקות ב 4 °. הסרת תאים supernatant ו resuspend במאגר בידוד 80 μl לכל 10 7 תאים.
    9. הוסף 20 μl של microbeads אנטי ביוטין לכל 10 7 תאים. מערבבים היטב, דגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C.
    10. מלאו 50 מ"ל עם קר PBS, צנטריפוגות 450 XG במשך 10 דקות ב 4 °.
    11. הכן עמודות LS (לאזן עם חיץ 3 מ"ל בבידוד). כדי למנוע עומס יתר עמודה, השתמש בעמודה אחת עבור מקסימאלי 250 x 10 6 PBMCs, או פחות אם PBMCs מכיל כדוריות דם אדומות רבות.
    12. הסר ג supernatant ו resuspendאמות חיץ 3 מ"ל בידוד. העברת תאים בעמודת LS. אסוף זרימה דרך, אשר מכילה את תאי CD4 + T הנאיביים, ב 15 מיליליטר צינורות.
    13. לשטוף בצינור עם חיץ בידוד 2 מ"ל. העבר לעמודה.
    14. 3x טור לשטוף עם חיץ 3 מ"ל בידוד. תמיד לחכות עד בעמודה מפסיקה מטפטפת, לפני הוספת כל נוזל חדש.
    15. קח את זרימת דרך (תאים נאיביים CD4 + T) ו צנטריפוגות 450 XG עבור 10 דקות ב 4 ° C. יכול להיות מושלך עמודות.
    16. הסר supernatant לחלוטין. שטפו תאים עם 15 בינוני מ"ל, צנטריפוגה 450 XG עבור טמפרטורה 10 דקות ב חדר ולהסיר supernatant לחלוטין.
      הערה: בידוד חיץ מכיל EDTA, אשר chelates יוני הסיד ובכך פוגע הפעלת תא T. לפני כל מבחני גירוי, להסיר את החיץ בידוד לחלוטין ולשטוף תאים פעמיים עם 15 מ"ל בינוני.
    17. Resuspend תאים בינוני תרבית תאי T 2-3 x 10 6 תאים לכל מיליליטר. תאים נוח על משכבך o הבקבוק המתאיםr גם במשך הלילה בחממה. אם תאים משמשים ישירות עבור מבחני גירוי, לשטוף אותם עוד פעם אחת עם מדיום.
  4. טוהר בקרה מכתימה
    1. קח ~ 50,000 תאים (Tnaïve; nTreg; PBMCs) כל אחת, ב 20 μl.
      הערה: אם שני Tnaïve ו nTreg פאנל הם להיצבע, לקחת 2 דוגמאות לכל.
    2. כן 2x premix נוגדן מרוכז (PBS) בהתאם המכשיר, למשל: לוח Tnaïve: CD4-PerCP 1: 5; CD45RA-FITC 1:10, CD45RO-PE 1: 5, CD8-eFlour450 1: 8. לקבלת לוח Treg, להחליף CD45RO-PE עם CD25-PE, 1:10.
      הערה: נוגדנים CD25 מסוימות בלבד, שמזהים אפיטופים שונים מאשר-microbeads CD25, שניתן להשתמש בהם כדי להכתים nTregs מבודד עם microbeads CD25.
    3. הוסף 20 μl premix נוגדן ל -20 תאים μl. כמו כן להכין האחת stainings לכל fluorochrome (באמצעות מדגם המכיל תאים חיוביים, למשל, PBMCs) ו מדגם בלא כתם עבור זרימת cytometry settinGS ופיצוי.
    4. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
    5. ממלא כל מדגם עם 200 μl PBS, צנטריפוגות 450 XG למשך 5-10 דקות.
    6. קח את התאים בתא מופעל קרינת מיון (FACS) חיץ (= חיץ בידוד ללא EDTA) ולנתח ידי cytometry זרימה. הטוהר של תאים נאיביים CD4 + T הוא בדרך כלל> 95% (ראה איור 2).

2. Treg אינדוקציה תרבות

  1. הכנת מדיה גירוי וצלחות
    1. כן בינוני תרבות טרום חם T תא: השלם בינוני hematopoietic סרום ללא עם 2 מ"מ גלוטמין L-alanyl-L.
    2. כן ציטוקינים, נוגדני גירוי וריכוזי מניות מתחמים.
      1. כן פתרון מניות IL-2: 400,000 IU / ml ב סטרילי, מסונן (מסנן עם חומצה עמידה) 100 מ"מ חומצה אצטית (167 מיקרוגרם / מיליליטר אם פעילות של המגרש משמש היא 2,400 IU לכל 1 מיקרוגרם; לאשר עם ספק). Aliquot לנמוך חלבון מעוקר מחייב צינורות 0.5 מ"ל, חותם עם Parafilm, הקפאת קרח ולאחסן יבש ב -80 ° C עבור אחסון לטווח ארוך או -20 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים.
      2. כן פתרון מניות TGF-β1 (ל -10 מיקרוגרם בקבוקון, מוביל-חינם): אבקת צנטריפוגה TGF-β1 (1,000 דקות XG 3), להוסיף 100 μl של 4 המ"מ HCl (סטרילי, מסונן עם מסנן עמיד חומצה) להכין פתרון מניות עם 100 מיקרוגרם / מ"ל, ולאפשר להתמוסס לחלוטין; מְעַרבּוֹלֶת. Aliquot 5 μl כל לנמוך חלבון מעוקר מחייב צינורות 0.5 מ"ל, חותם עם Parafilm, הקפאת קרח ולאחסן יבש ב -80 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
      3. הכן פתרון המניות ATRA: ממיסים אבקת ב 20 מ"ג / מ"ל ​​(66.6 מ"מ) ב DMSO. הכן פתרון מניות של 10 מ"מ על ידי דילול נוסף aliquots DMSO ולאחסן, מוגן מפני אור, ב -80 ° C עד 1 שנה. ATRA הוא רגיש לאור, חום ואוויר.
      4. הכן פתרון המניות rapamycin: 1 מ"ג / מ"ל ​​(1.11 מ"מ) ב DMSO, חנות aliquots ב -80 מעלות צלזיוס במשךעד 1 שנה.
      5. הכן פתרון המניות בוטיראט נתרן: 0.908 M (0.1 מ"ג / מ"ל) מניות H סטרילי אולטרה-טהור 2 O ולסנן סטרילית. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C.
    3. כן 4x premixes המרוכז (50 μl לכל טוב) במדיום תרבית תאי T כמו בטבלה 1.
    4. ביום הקודם, צלחות מעיילות עם נוגדן אנטי CD3. מעיל הרצוי מספר בארות מ -96 צלחת U-היטב עם 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​נוגדן אנטי CD3 ב PBS, 65 μl / טוב. עוטפים בנייר כסף צלחת דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: אין להשתמש בארות מרווח של 96 צלחות היטב. בארות בגרו ניתן להשתמש, אך בארות בצורת U להקל את השימוש של אותם מספרי התא ליחידת שטח פני ניסויים. אם יותר תאים נדרשים, ברכה את הכמות הנדרשת של בארות אחרי התרבות. בדרך כלל, לאחר 4-6 ימים של הרחבה, 2 בארות מדגם מספיקים ניתוח תזרים cytometry וניתוח RNA.
      1. ביום ציפוי, זמן קצר לפני הציפוי, להסיר אנטיפתרון -CD3 מבאר. מלאו בארות עם 200 μl / גם PBS. הסר PBS. חזור כביסה עם 200 μl / גם PBS. הסר PBS לחלוטין ולהשתמש צלחות מיד.
    5. כן צלחות (לא להשתמש בבארות מרווח):
      1. עבור כל טוב, להוסיף 50 μl של premix אנטי CD28 / IL-2 4x (למעט תאים "unstimulated", להוסיף בינוני תרבית תאים T), 50 μl 4x premix TGF-β1 (לכל iTregs) או 50 μl T תרבית תאים בינוני לשליטה "גירוי רק" מדומה, 50 μl 4x ATRA, ATRA / rapamycin או premix בוטיראט (אם ישים) או בינוני
      2. מלא את כל הבארות הריקות, כוללת בארות המרווח, עם 200 μl PBS. טרום חמים צלחות ב 37 ° C / 5% CO 2.
  2. כן תאי T הנאיבי עבור ציפוי
    1. אחרי שנחתי תאים, להעביר 15 צינור מ"ל, לשטוף בקבוק / בארות עם תרבית תאים בינוניים מחומם מראש T ובריכת צינור. מלאו צינור עד 15 מיליליטר עם מדיום תרבית תאי T.
    2. תאים צנטריפוגה ב 450 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. הסר בינוני תופסים התאים בינוני תרבית תאים טרי, מחומם מראש T לצפיפות של 2.2-2.6 x 10 6 / ml. ספירת תאים כמו בשלב 1.2.2 ולהתאים צפיפות במידת הצורך.
    4. הוספת תאי צלחות גירוי מוכנות (ראה 2.1), 50 תאי μl / טובים (110,000-130,000 תאים / טוב). כל טוב צריך עכשיו מכילים בנפח כולל של 200 μl.
    5. גלישת צלחות בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור ATRA; לדגור על 37 ° C / 5% CO 2 לתקופות זמן רצויות.
  3. צג Treg אינדוקציה תרבות
    1. צג תרבויות Treg ידי מיקרוסקופ אור (בהגדלה 40X). מכ יום 2 עד 3, אשכולות קטנים של תאים מתרבים צריכים להיות גלויים, אשר מתמזגים אשכולות גדולים בנקודות מאוחר יותר זמן. תרבויות גדלו עם rapamycin כלל בגידולו. ראה גם איור 3.
    2. בנקודות זמן רצויות, לקחת דגימות עבור דואר רנ"אxtraction או cytometry זרימה phenotyping (ראה להלן). לקבלת נקודות במועד מאוחר יותר עם התפשטות תאים, 1 גם כל מספיקה, אחרת לקחת 1 x 10 5 -1 x 10 6 תאים עבור כל רנ"א 3 x 10 5 -1 x 10 6 תאים cytometry הזרימה.
  4. הערכת FOXP3 יציבות
    1. להערכת היציבות של פנוטיפ iTreg כפי שתואר לעיל 22,27, לשטוף iTregs פעמיים עם תרבית תאים בינוניים T, ו iTregs תרבות נוספת במדיום תרבית תאים T או בלי או עם אנטי CD3 ואנטי-CD28 restimulation כמתואר 2.1 ו -2.2 . הוסף ציטוקינים, כגון 50 IU / ml IL-2, ללמוד את השפעתם על יציבות FOXP3.
    2. בנקודות זמן רצויות, לקחת דגימות להפקת RNA, cytometry זרימת phenotyping (ראה להלן), וניתוח מתילציה TSDR כמתואר 22,28.

ניתוח פנוטיפי 3. iTregs ידי qRT-PCR

  1. הכנה שלדגימות
    1. בנקודות זמן רצויות, לקחת 1 x 10 5 כדי 1 x 10 6 תאים לדגימה להפקת RNA. העברת התאים צינור RNase ללא 1.5 מ"ל, ו צנטריפוגות ב XG 500 במשך 5 דקות.
    2. במידת הצורך, להסיר חלק supernatant ולהקפיא עבור assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA) או ניתוח דומה. הסר הנותרים supernatant לחלוטין מתאי. להמשיך ישירות מיצוי RNA או להקפיא גלולת תא על קרח יבש חנות ב -20 ° C ל -80 ° C עד 2 שבועות.
    3. חלץ RNA ולבצע qRT-PCR עבור FOXP3 וכן גן משק (כגון RPL13A) על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. בנוסף, למדוד ביטוי של גנים החתימה Treg אחרים (למשל `Treg up' גנים IL2RA, CTLA4, IKZF4, וה גנים down' Treg IFNG, SATB1).

4. ניתוח פנוטיפי על ידי זרימת cytometry

הערה: פרוטוקול זה הוא אופטימיזציה עבור כתםing בפורמט צלחת היטב 96U עם 3 x 10 5 -1 x 10 6 תאים. אם יש פחות תאים לכל טוב, תתחיל עם כמה בארות וברכה כמתואר להלן.

  1. Cell Restimulation (אופציונלי)
    1. אם מכתים ציטוקינים תאיים הוא רצוי, תאים דופקים עם phorbol 12-myristate 13-תצטט (PMA) / ionomycin בנוכחות מעכב תחבורת חלבון.
      הערה: הליך זה אינו משפיע על ביטוי FOXP3 ב מתוארות לעיל תרבויות iTreg, אבל סמנים אחרים עשויים לשנות - לדוגמה, CD4 הוא downregulated.
    2. כן 10x Brefeldin A / PMA / ionomycin premix (20 μl לכל טוב) במדיום תרבית תאי T: Brefeldin פתרון מניות 1: 100, ionomycin (מנייה 5 מיקרוגרם / μl) 1: 1,300, PMA (מניית 12.35 מיקרוגרם / μl, מראש -dilute 1: 1235) 1: 100 של המניה מראש מדולל.
    3. 4 שעות לפני מכתים, להוסיף 20 μl Brefeldin A / PMA / ionomycin 10x תערובת לכל טוב להשיג ריכוזים סוף 1: 1,000 Brefeldin, 0.5 μM (375 ng / ml) ionomycin, 10 ng / ml PMA.
    4. דגירה של 4 שעות ב 37 ° C / 5% CO 2
  2. מכתים Surface
    הערה: הפאנל הציע הנה הצעה; לוחות אחרים עשויים לשמש תלוי את האנטיגנים של עניין ההתקנה המכשיר.
    1. מגניב PBS על קרח. הכן חיץ FACS (PBS עם 0.5% אלבומין בסרום אדם, HSA) ומצננים על הקרח. BSA או FBS ניתן להשתמש כחלופה HSA.
    2. תאים מחדש צלחת צלחת מכתים: גלולת תאים עם טפטפתי ולהעביר את התאים לתוך צלחת היטב 96U חדש, עוזב אחד חינם היטב סביב כל טוב (כדי למנוע זליגה בהליך מכתים מאוחר יותר). אם פחות מ מספרי תא רצויים נמצאים הבאר המקורית, סר חלק supernatant לפני resuspension, וברכה כמה בארות לתוך מכתים גם.
    3. צלחת צנטריפוגה 400 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. הסר את supernatant. שפוך supernatant לתוך תיבת פסולת, לעזוב את הצלחת הפוכהלמטה ומיד (ללא דרך חזרה לצלחת) הקש על הצלחת פעם אחת על נייר סופג. ואז מייד להחזיר את הצלחת. צלחת וורטקס כדי resuspend תאי נותרים נוזליים.
    5. הוסף 25 premix מכתים משטח μl (CD25-PE 1:20, CD4-PerCP 1: 5 במאגר FACS) ו resuspend.
      הערה: כמו כן כוללים יחיד stainings עבור כל אחד fluorochromes בשימוש עם דגימות המכילות תאים חיוביים עבור אנטיגן בהתאמה; וכולל מדגם בלא כתם. אלה יהיו צורך התקנת פיצוי מכשיר. לחלופין, להשתמש חרוזי פיצויים.
    6. דגירה 30 דקות ב 4 ° C בחושך.
    7. הוסף 200 μl PBS, צלחת צנטריפוגות 400 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C ולהסיר supernatant כמתואר בשלב 4.2.4. צלחת וורטקס.
    8. חזור על שלב 4.2.7 פעמים.
  3. כדאיות מכתימה
    הערה: מכתים כדאיות הוא הכרחי, שכן לאחר הקיבוע / permeabilization תאים מתים לא ניתן לשלול באופן מספק על ידיFSC / SSC ועשויים מולידים אותות נוקבים. יש לצבוע כדאיות fixable לשמש.
    1. Resuspend תאי premix הכתם כדאי 130 μl (כדאיות fixable צבען eFlour780 1: 1,400 ב PBS) ותאי resuspend מייד עם pipet רב ערוצית.
      הערה: כמו כן כוללת מכתים יחיד עבור צבע הכדאיות המכיל תאים מתים, למשל, תאי T unstimulated בתרבית למשך כמה ימים או להרוג תאים על ידי הפעלת חום כמו על ידי 'הוראות היצרן. אלה יהיה צורך לפיצוי.
    2. דגירה 30 דקות ב 4 ° C בחושך.
    3. צלחת צנטריפוגה ב 400 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C. הסר supernatant כמו בשלב 4.2.4. צלחת וורטקס.
    4. מלא עם 200 μl חיץ FACS. חזור על שלב 4.3.3.
    5. מלא עם 200 μl PBS. חזור על שלב 4.3.3.
  4. מכתים תאי עם FOXP3 מכתים הצפת גדר
    1. עבור כל טוב, להכין: 150 תקן μl / חיץ פרם (לדלל תקן / פרם קונצרט כלשהוentrate 1: 4 עם diluent); 850 μl 1x חיץ permeabilization (לדלל 10x permeabilization חיץ 1:10 עם O טהורים H 2).
    2. לאחר vortexing, תאים resuspend ב 150 μl תקן / פרם חיץ ומיד resuspend עם פיפטה. חשוב מיד resuspend להימנע קיבעון של גושי תאים.
      זהירות: קיבוע חיץ מכיל paraformaldehyde יש לטפל וזנוח כראוי.
    3. דגירה 30 דקות ב 4 ° C בחושך.
    4. הוספת 100 μl PBS קר. צנטריפוגה ב 850 XG במשך 10 דקות ב 4 °.
      הערה: משלב זה ואילך מהירות צנטריפוגה היא גדלה כדי למנוע אובדן של תאים. לאחר קיבוע, תאים לבלתי נראים וטיפול יש לנקוט כדי להסיר supernatants כמתואר בשלב 4.2.4 ומיד לאחר צנטריפוגה נגמר כדי להקטין את איבוד של תאי.
    5. הסר supernatant כמתואר בשלב 4.2.4. צלחת וורטקס.
      הערה: מכתים עלול להיות מושהה בשלב זה; בבמקרה זה, לשטוף את התאים פעמיים עם 200 μl PBS; אז תופסים 250 μl PBS ולאחסן ב 4 ° C, מוגן מפני אור. התאים יכולים להיות מאוחסנים במשך כמה ימים, ולאחר מכן להמשיך עם permeabilization. עם זאת, תוצאות אופטימליות מושגות כאשר המשיך ישירות permeabilization.
    6. לאחר vortexing, להוסיף 200 חיץ Permeabilization μl. צנטריפוגה ב 850 XG במשך 10 דקות ב 4 °. הסר supernatant כמתואר בשלב 4.2.4. צלחת וורטקס.
    7. הוספת 200 חיץ Permeabilization μl כדי resuspend.
      הערה: כאן, דגימות ניתן לפצל מכתים תאיים מדגם לשלוט אלוטיפ (לקחת חצי של כל דגימה). אם מספרים סלולריים מגבילים, מדגם אלוטיפ ונקווה ניתן להכין (לקחת 10-20 μl של כל דגימה וברכה). כמו כן, דגימות ניתן לקחת עבור הקרינה מינוס-One (FMO) שולטת.
    8. צנטריפוגה ב 850 XG במשך 10 דקות ב 4 °. הסר supernatant כמתואר בשלב 4.2.4. צלחת וורטקס.
    9. Resuspend גלולה ב44 סרום עכבר רגיל μl חיץ Permeabilization פלוס 1 μl (premixed) לחסום מחייב נוקב.
      הערה: זו חלה אם נוגדנים המשמשים בשלב הבא הם של אלוטיפ בעכברים. אם נוגדנים אחרים, כגון נגזר מן החולדה, משמשים, כולל את הנסיוב המתאים לחסימה (למשל, סרום עכברוש).
    10. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בחושך.
    11. הוספת נוגדנים:
      הערה: חקרי ריכוזי הנוגדן עבור הסדרה הספציפית. אם לא נעשה צעד 4.2 עם נוגדנים כנגד אנטיגנים פני השטח (למשל, CD4) עם fluorochromes בהתאמה, כוללים גם stainings יחיד עבור כל אחד fluorochromes בשימוש עם דגימות המכילות תאים חיוביים לפיצוי.
      1. הוסף 15 μl premix נוגדנים דגימות (למעט stainings יחיד, דגימות בלא כתם, דגימות בקרה אלוטיפ ובקרות FMO): Premix לדגימה: 0.7 μl (0.35 מיקרוגרם) גמא אנטי-אינטרפרון (IFN-γ) -FITC (אם זה אפשרי לאחר restimulation ),2.3 μl (0.115 מיקרוגרם) CTLA-4 מבריק ויולט 421, 2 μl (0.05 מיקרוגרם) Anti-FOXP3-APC, 10 μl PBS.
      2. כדי אלוטיפ דגימות בקרה, להוסיף 15 μl premix נוגדן אלוטיפ, באמצעות אותן כמויות של נוגדנים ובאשר נוגדנים המשמשים 4.4.11.1: Premix לדגימה: 0.7 μl (0.35 מיקרוגרם) FITC אלוטיפ עכבר IgG1 K (אם רלוונטי), 0.58 μl (0.115 מיקרוגרם) עכבר IgG2a-BV421 אלוטיפ, 0.5 μl (0.05 מיקרוגרם) APC אלוטיפ עכבר IgG1 K, 13.2 μl PBS.
      3. עבור פקדים FMO, להוסיף נוגדנים כמו 4.4.11.1, החלפת נוגדן אחד כל אחד עם PBS.
    12. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך.
    13. הוספת 200 חיץ Permeabilization μl. צנטריפוגה, להסיר supernatant ו מערבולת כמו בשלב 4.4.8. חזור פעם אחת.
    14. תאים Resuspend במאגר קר FACS (נפח פי המכשיר בשימוש) ולרכוש, אידיאלי מיד, על cytometer את הזרימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 מציג סכמה של הגדרת הניסוי. איור 2 מראה מכתים מלא טוהר נציג תאי nTregs CD4 + T מבודדים מגנטי נאיביים.

F igure 3A מראה את זרימת cytometry האסטרטגיה gating ואיור 3 ב מציג FOXP3 ו CD25 נציג cytometry זרימה stainings ביום 6 של התרבות בתנאים iTreg או שליטה המצוין. עם

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר מאפשר האינדוקציה החזקה של CD4 + אדם FOXP3 + iTregs מתאי אדם נאיביים CD4 + T. היא כוללת פרוטוקול חדשות שתארנו לאחרונה, באמצעות שילוב של TGF-β, ATRA ו rapamycin, לזירוז של iTregs עם פונקציה מדכאת מעולה במבחנת 22. לעומת פרוטוקולים שפורסמו אחרים, יתרון נוסף הוא הגיוס של אוכלוסיות iTreg שונות במקביל על ידי פרוטוקולים שונים, המאפשר השוואה הישירה של השפעות של גורמים iTreg וישכנעו מסוימים, יחד עם תאי שליטה אשר מופעלים בנוכחות IL-2 בלבד . הפר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

נינה נייגל זוכה להכרת תודה על הסיוע הטכני במהלך צילומי הווידיאו וההכנה הניסיונית. אנו מודים לאווה-מריה וייס על העזרה בפרוטוקול הצביעה התוך-תאי FOXP3 ולאליזבת סורי-פייר ונינה אוברל על קביעת פרוטוקול הבידוד של nTreg. מטילדה אריקסון ופרי נורי זוכות להכרה על ניהול המעבדה.

מימון: A.S. נתמך על ידי מלגת מארי קירי התוך-אירופית במסגרת תוכנית מסגרת הקהילה האירופית השביעית, קרן ד"ר אקה אולסון וקרנות המחקר של KI; A.S. ו-J.T. נתמכו על ידי מענק CERIC (מרכז המצוינות לחקר דלקת ומחלות לב וכלי דם), J.T. נתמך על ידי Vetenskapsrådet Medicine and Health (Dnr 2011-3264), קרן טורסטן סודרברג, FP7 STATegra, AFA Insurance ומועצת מחוז שטוקהולם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומצה רטינואית All-transסיגמא אולדריץ'R2625-50MG   
שיבוט Foxp3-APC אנושי 236A/E7eBioscience17-4777-42
מיקרו-חרוזים CD25 אנטי-אנושייםMiltenyi Biotec130-092-983
אנטי-אנושי CD25-PEMiltenyi Biotec130-091-024
נוגדן CD28 אנטי-אנושי, LEAF Purified Biolegend302914
נוגדן CD3 אנטי אנושי, LEAF Purified Biolegend317315
אנטי אנושי CD45RA, FITCMiltenyi Biotec130-092-247
אנטי אנושי CD45RO שיבוט PE UCHL1BD Biosciences555493
שיבוט CD4-PerCP אנטי אנושי SK3; mIgG1BD Biosciences345770
אנטי אנושי CD8-eFluor 450 (שיבוט OKT8), mIgG2aeBioscience48-0086-42 
CTLA-4 אנטי אנושי (CD152), שיבוט BNI3, mIgG2ak, סגול מבריק 421BD Biosciences562743
שיבוט IFN-g FITC אנטי אנושי 4S. ב3; mIgG1keBioscience11-7319-81 
תמיסה המכילה ברפלדין A: ערכת סינתזת cDNA של GolgiPlugBD Biosciences555029
: ערכת סינתזת cDNA SuperScript VILO (Reverse transcriptase)Invitrogen11754-250
מדיום צנטריפוגה צפיפות: Ficoll-PaqueGE healthcare17-1440-03
DMSO 99.7%Sigma AldrichD2650-5X5ML
FBS, Invitrogen10082-147 צבע כדאיות לתיקון Invitrogen 10082-147
, eFluor 780   eBioscience65-0865-14 או 65-0865-18 
ערכת חיץ מכתים Foxp3eBioscience00-5523-00אזהרה: מכיל פרפורמלדהיד. ניתן לקנות גם בערכה משולבת עם נוגדן; 77-5774-40 סט צביעה אנטי אנושי Foxp3 שיבוט APC: סט 236A/E7
GlutaMAX (200 מ"מ L-alanyl-L-גלוטמין)Invitrogen35050-061
ערכת בידוד תאי CD4 T נאיבית אנושית IIMiltenyi Biotec130-094-131
אלבומין בסרום אנושי 50 גרם/ליטרבקסטר1501057
יונומיצין מ-Streptomyces conglobatus >98%סיגמא אולדריץ'I9657-1MG
עמודות MACS LSMiltenyi Biotec130-042-401
עכבר IgG1 K בקרת איזוטיפ APC שיבוט: P3.6.2.8.1eBioscience17-4714-42
עכבר IgG1 K בקרת איזוטיפ FITC 50 & #956; geBioscience11-4714-81 
עכבר בקרת איזוטיפ IgG2a, סגול מבריק 421, שיבוט MOPC-173BD Biosciences563464
פלסטיק פיפט פסטר, ארוז בנפרדSarstedt86.1172.001   
PMA פורבול 12-מיריסטט 13-אצטטסיגמא אולדריץ'P1585-1MG 
רפמיציןEMD (Merck)553210-100UG
רקומביננטי אנושי IL-2, CFמו"פ D202-IL-050/CF
רקומביננטי אנושי TGF-beta 1, CFRnD240-B-010/CF
ערכת בידוד RNA: ערכת RNAqueous-MicroאמביוןAM1931   
RPMI 1640 בינוני Invitrogen72400-054 
נתרן בוטיראטסיגמא אולדריץ'B5887-250MG 
מדיום תרבית תאי T: מדיום X-Vivo 15, עם גנטמיצין+פנולרדLonza04-418Q
בדיקת ביטוי גנים TaqMan, FOXP3 (הכיסוי הטוב ביותר) Applied Biosystems4331182; מזהה בדיקה: Hs01085834_m1זהירות: מכיל paraformaldehyde
TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (הכיסוי הטוב ביותר)Applied Biosystems4351370; מזהה בדיקה: Hs04194366_g1   אזהרה: מכיל פרפורמלדהיד
TaqMan ביטוי גנים מאסטר מיקסיישומי ביוסיסטמס4369514

מקורות

  1. Sakaguchi, S. Regulatory T cells: history and perspective. Methods Mol.Biol. 707, 3-17 (2011).
  2. DeLeeuw, R. J., Kost, S. E., Kakal, J. A., Nelson, B. H. The prognostic value of FoxP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in cancer: A critical review of the literature. Clin Can Res. 18 (11), 3022-3029 (2012).
  3. Liu, C., Workman, C. J., Vignali, D. A. A. Targeting Regulatory T Cells in Tumors. FEBS J. , (2016).
  4. Trzonkowski, P., et al. First-in-man clinical results of the treatment of patients with graft versus host disease with human ex vivo expanded CD4+CD25+C. Clin. Immunol. 133, 22-26 (2009).
  5. Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117, 1061-1070 (2011).
  6. Di Ianni, M., et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood. 117, 3921-3928 (2011).
  7. Edinger, M., Hoffmann, P. Regulatory T cells in stem cell transplantation: strategies and first clinical experiences. Curr. Opin. Immunol. 23, 679-684 (2011).
  8. Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Transl Med. 7 (315), 189(2015).
  9. Haribhai, D., et al. A central role for induced regulatory T cells in tolerance induction in experimental colitis. J. Immunol. 182, 3461-3468 (2009).
  10. Haribhai, D., et al. A requisite role for induced regulatory T cells in tolerance based on expanding antigen receptor diversity. Immunity. 35, 109-122 (2011).
  11. Abbas, A. K., et al. Regulatory T cells: recommendations to simplify the nomenclature. Nat.Immunol. 14, 307-308 (2013).
  12. Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Natural and adaptive foxp3+ regulatory T cells: more of the same or a division of labor. Immunity. 30, 626-635 (2009).
  13. Huehn, J., Polansky, J. K., Hamann, A. Epigenetic control of FOXP3 expression: the key to a stable regulatory T-cell lineage. Nat. Rev. Immunol. 9, 83-89 (2009).
  14. Schmitt, E. G., Williams, C. B. Generation and function of induced regulatory T cells. Front Immunol. 4, 152(2013).
  15. Pillai, V., Ortega, S. B., Wang, C. K., Karandikar, N. J. Transient regulatory T-cells: a state attained by all activated human T-cells. Clin.Immunol. 123, 18-29 (2007).
  16. Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I. H., Huizinga, T. W., Toes, R. E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells. Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).
  17. Josefowicz, S. Z., Rudensky, A. Control of regulatory T cell lineage commitment and maintenance. Immunity. 30, 616-625 (2009).
  18. Sun, C. M., et al. Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid. J.Exp.Med. 204, 1775-1785 (2007).
  19. Coombes, J. L., et al. A functionally specialized population of mucosal CD103+ DCs induces Foxp3+ regulatory T cells via a TGF-beta and retinoic acid-dependent mechanism. J. Exp. Med. 204, 1757-1764 (2007).
  20. Kang, S. G., Lim, H. W., Andrisani, O. M., Broxmeyer, H. E., Kim, C. H. Vitamin A metabolites induce gut-homing FoxP3+ regulatory T cells. J. Immunol. 179, 3724-3733 (2007).
  21. Mucida, D., et al. Retinoic acid can directly promote TGF-beta-mediated Foxp3(+) Treg cell conversion of naive T cells. Immunity. 30, 471-472 (2009).
  22. Schmidt, A., Eriksson, M., Shang, M. -M., Weyd, H., Tegnér, J. Comparative Analysis of Protocols to Induce Human CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells by Combinations of IL-2, TGF-beta, Retinoic Acid, Rapamycin and Butyrate. PloS one. 11 (2), 0148474(2016).
  23. Furusawa, Y., Obata, Y. regulatory T cells. Nature. 504, 446-450 (2013).
  24. Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T-cell generation. Nature. 504, 451-455 (2013).
  25. Battaglia, M., et al. Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells of both healthy subjects and type 1 diabetic patients. J. Immunol. 177, 8338-8347 (2006).
  26. Hippen, K. L., et al. Massive ex vivo expansion of human natural regulatory T cells (T(regs)) with minimal loss of in vivo functional activity. Sci. Transl. Med. 3, 41(2011).
  27. Schmidt, A., et al. Human macrophages induce CD4(+)Foxp3(+) regulatory T cells via binding and re-release of TGF-β. Immunol cell biol. , (2016).
  28. Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).
  29. Schmidt, A., et al. Human regulatory T cells rapidly suppress T cell receptor-induced Ca(2+), NF-kappaB, and NFAT signaling in conventional T cells. Sci. Signal. 4, 90(2011).
  30. Ohkura, N., et al. T cell receptor stimulation-induced epigenetic changes and Foxp3 expression are independent and complementary events required for Treg cell development. Immunity. 37, 785-799 (2012).
  31. Hill, J. A., et al. Retinoic acid enhances Foxp3 induction indirectly by relieving inhibition from CD4+CD44hi Cells. Immunity. 29, 758-770 (2008).
  32. Yang, R., et al. Hydrogen Sulfide Promotes Tet1- and Tet2-Mediated Foxp3 Demethylation to Drive Regulatory T Cell Differentiation and Maintain Immune Homeostasis. Immunity. 43 (2), 251-263 (2015).
  33. Yue, X., Trifari, S., et al. Control of Foxp3 stability through modulation of TET activity. The Journal of experimental medicine. 213 (3), 377-397 (2016).
  34. Sasidharan Nair, V., Song, M. H., Oh, K. I. Vitamin C Facilitates Demethylation of the Foxp3 Enhancer in a Tet-Dependent Manner. J Immunol. 196 (5), 2119-2131 (2016).
  35. Geiger, T. L., Tauro, S. Nature and nurture in Foxp3 + regulatory T cell development, stability, and function. Hum Immunol. 73 (3), 232-239 (2012).
  36. Gu, J., et al. TGF-β-induced CD4+Foxp3+ T cells attenuate acute graft-versus-host disease by suppressing expansion and killing of effector CD8+ cells. J Immunol. 193 (7), 3388-3397 (2014).
  37. Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory T Cells. Immunol Invest. 36 (5-6), 607-628 (2007).
  38. McMurchy, A. N., Levings, M. K. Suppression assays with human T regulatory cells: a technical guide. Eur J immunol. 42 (1), 27-34 (2012).
  39. Mutis, T., et al. Human regulatory T cells control xenogeneic graft-versus-host disease induced by autologous T cells in RAG2-/-gammac-/- immunodeficient mice. Clin cancer res. 12 (18), 5520-5525 (2006).
  40. Tran, D. Q. In vitro suppression assay for functional assessment of human regulatory T cells. Meth mol biol. 979, 199-212 (2013).
  41. Oberle, N., Eberhardt, N., Falk, C. S., Krammer, P. H., Suri-Payer, E. Rapid Suppression of Cytokine Transcription in Human CD4+CD25 T Cells by CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells: Independence of IL-2 Consumption, TGF-beta, and Various Inhibitors of TCR Signaling. J. Immunol. 179, 3578-3587 (2007).
  42. Shevach, E. M., Thornton, A. M. tTregs, pTregs, and iTregs: similarities and differences. Immunol. Rev. 259, 88-102 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

T CD4TGF betaqRT PCRFOXP3Treg
במבחנה בידול של האדם CD4 + FOXP3 + מושרה תקינה בתאי T (iTregs) מ נאיבית CD4 + T תאים באמצעות פרוטוקול TGF-β-המכיל
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.