הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הפקה, התגבשות וקביעת מבנה

11.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55022

⸱

30 בדצמבר 2016

 ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry, University of Cologne

במאמר זה

סיכום

פרולין-פרולין אנדופפטידאז-1 (PPEP-1) הוא מטאלופרוטיאז מופרש ויעד תרופה מבטיח מהפתוגן האנושי קלוסטרידיום דיפיצילה. כאן אנו מתארים את כל השיטות הדרושות לייצור וקביעת המבנה של חלבון זה.

תקציר

יש צורך בטיפולים חדשים לטיפול בזיהומי קלוסטרידיום דיפיצילה המהווים איום משמעותי על בריאות האדם. C. difficile metalloprotease PPEP-1 הוא יעד לפיתוח עתידי של מעכבים להפחתת האלימות של הפתוגן. כדי לבצע אפיון ביופיזי ומבני כמו גם בדיקת מעכבים, יהיה צורך בכמויות גדולות של חלבון טהור ופעיל. פיתחנו פרוטוקול לייצור וטיהור יעיל של PPEP-1 על ידי שימוש ב-E. coli כמארח הביטוי המניב כמויות וטוהר מספיקים של חלבון להתגבשות וקביעת מבנה. בנוסף, באמצעות מיקרו-זריעה, ניתן לגדל גבישים משולבים מאוד של PPEP-1 לגבישים מסודרים היטב המתאימים לניתוח עקיפה של קרני רנטגן. השיטות יכולות לשמש גם לייצור חלבונים רקומביננטיים אחרים ולחקר המבנים של חלבונים אחרים המייצרים גבישים שגדלו זה בזה.

מבוא

Difficile Clostridium הוא אחד הגורמים העיקריים של זיהומי שלשולים אנטיביוטיים הקשורים nosocomial 1. גראם חיובי זה חיידק אנאירובי מועבר באמצעות טופס הנבג שלה באמצעות מחזור הצואה-פה. בעשור האחרון, החדשה '' המגפה '' או '' hypervirulent '' זנים (למשל BI / NAP1 / 027) גרמו לעלייה דרסטית זיהומים חדשים ושיעורי תמותה בצפון אמריקה ובאירופה 2. C. difficile מחל -associated (CDAD) הנה דלקת מעי גסת סכנת חיים עם שיעורי תמותה גבוהים 3. הסימפטומים נעו בין שלשול 4 קוליטיס pseudomembranous 5 ואת megacolon הרעיל לעתים קרובות הקטלן 6.

טיפול CDAD קשה כמו הזנים האלימים הם multidrug עמיד ושיעור ההישנות גבוה 7. באותו טיפול רגע כולל את metronidazole אנטיביוטיקה, fidaxomicin או ונקומיצין, או repetitiבמקרי vely חוזרים השתלת חיידקים בצואה. אסטרטגיות טיפוליות חדשות נדרשות 8 בדחיפות. התקדמות מסוימת זו נרשמת Bezlotoxumab נוגדנים חד שבטיים טיפולית, מיקוד הרעלן difficile ג B 9, עברה בהצלחה לאחרונה שלב III של הניסויים הקליניים ואת הוגש לאישורו עם ה- FDA ו- EMA. בנוסף, אנטיביוטיקות חדשות נבדקות כרגע בשלבים שונים של ניסויים קליניים 10.

כדי לפתח טיפול יעיל מטרות טיפוליות חדשות חייבות להיות מזוהות. שהתגלו לאחרונה C. difficile פרוטאז פרולין-פרולין endopeptidase-1 (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; EC 3.4.24.89) הוא יעד כזה מבטיח, כמו חוסר PPEP-1 זן נוק-אאוט פוחתת ארסיות של C . difficile in vivo 11. PPEP-1 הוא metalloprotease מופרש 12,13 ביקוע השני adhesins C. difficile ב C- הסופית שלהם 13 ובכך משחרר את bacter החסידIA מן האפיתל במעי האדם. לכן, הוא עוסק בשמירה על האיזון בין פנוטיפ הנייח ו ניע של difficile ג. כדי לפתח מעכבי סלקטיבית נגד PPEP-1 ו להבין איך היא מכירה מצעים שלה ידע אינטימי של מבנה תלת-ממדי שלו היא הכרחית. פתרנו את המבנה הגבישי הראשון של PPEP-1 לבד בקומפלקס עם פפטיד מצע 14. PPEP-1 הוא פרוטאז הראשון הידוע כי אג"ח המסלקת פפטיד סלקטיבי בין שתי שאריות פרולין 15. הוא נקשר המצע באופן פעמי מפותל ומייצב אותו דרך רשת אליפטיות-ארומטיים מורחבת של שאריות הממוקמות S-הלולאה המכסה את האתר הפעיל פרוטאז 14. מצב המצע מחייב זו הנו ייחודי PPEP-1 ולא נמצא פרוטאזות אדם עד כה. זה עושה את זה יעד תרופה הבטיח, ואת מחוץ יעד השפעות של מעכבים מאוד לא סבירים.

כדי לפתח מסך סלקטיבית Inh PPEP-1ibitors בעתיד כמות גדולה של חלבון טהור monodisperse PPEP-1 הוא זקוק. יתר על כן, על מנת לקבוע את המצב של עקדת המעכבים הראשונים, מבני שיתוף קריסטל עם PPEP-1 יצטרך להיקבע. בידיים שלנו PPEP-1 מייצר גבישים intergrown כל הזמן. לכן פתחנו הליך אופטימיזציה לייצר גבישים עקיפים באיכות יחידה של PPEP-1. בפרוטוקול זה אנו מתארים בפרוטרוט את הייצור, טיהור, פתרון התגבשות ומבנה PPEP-1 14. אנו משתמשים בביטוי תאי coli Escherichia של גרסה PPEP-1 חסרת רצף אות הפרשה, כרומטוגרפיה זיקת כרומטוגרפיה הדרת גודל עם הסרת תג הטיהור, ואחריו microseeding 16 אל תוך מרקע אופטימיזציה קביעת מבנה באמצעות פיזור יחיד גל אבץ האנומלי (אבץ-SAD) 17. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לקביעת ייצור ומבנה של חלבונים אחרים (למשל </ Em> metalloproteases) ובמיוחד עבור חלבונים לייצר גבישים intergrown. על פי בקשה, פלסמיד דנ"א של המבנה (pET28a-Nhis-rPPEP-1) ונתונים עקיפים יכולים להינתן למטרות חינוכיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. שיבוט ותכנון המבנה

  1. בצעו שיבוט של הרצף שעבר אופטימיזציית קודונים (עבור E. coli) של PPEP-1 מ-C. difficile ללא הפפטיד המסמן [חומצות אמינו 27-220, אשר יכונה להלן PPEP-1 רקומביננטי (rPPEP-1)11] אל תוך וקטור pET28a באמצעות אתרי הגבלה של NdeI ו-XhoI (איור 1) עם קודון עצירה בקצה ה-3' (הווקטור המתקבל הוא pET28a-NHis-rPPEP-1). תהליך זה יוצר חלבון בעל תג 6xHis בקצה ה-N (NHis-rPPEP-1) עם אתר ตัด של תרומבין המאפשר הסרה של התג במהלך הטיהור (איור 1). הפלסמיד מכיל קסטה לעמידות לקנמיצין לצורך סלקציה. הפריימרים ששימשו לשיבוט מתוארים במקום אחר14.

figure-protocol-1
איור 1: ייצוג סכמטי של הקונסטרוקט pET28a-NHis-rPPEP-1 וניתוח SDS-PAGE של הביטוי ושל כל שלבי הטיהור. (A) מפת וקטור של NHis-rPPEP-1 ששובט לתוך וקטור pET28a באמצעות NdeI/XhoI, שנוצרה באמצעות PlasMapper. (B) ייצוג סכמטי של קונסטרוקט NHis-rPPEP-1 (פאנל עליון) והקונסטרוקט הסופי לאחר שבירת thrombin של תג ה-6xHis, עם רצף ה-GSHM הנוסף שנוצר בקצה ה-N (פאנל תחתון). ניתוח SDS-PAGE (C) של הביטוי ב-BL21 (DE3) Star ב-37 °C למשך 4 שעות ו(D) של דגימות מכל שלבי הטיהור (M: מרקר למשקל מולקולרי). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

2. ביטוי וטיהור של rPPEP-1

  1. ביטוי של NHis-rPPEP-1
    1. הכינו ואוטוקלאביו מצע LB (lysogeny broth) (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl, כוונון ל-pH 7.5 באמצעות NaOH). הוסיפו kanamycin sulfate (50 µg/ml) רגע לפני השימוש (מצע LB/Kan).
    2. הדליקו תרבית לילה של 200 ml מ-E. coli שעברה טרנספורמציה טרייה במצע LB/Kan. גדלו במהלך הלילה ב-37 °C עם ניעור ב-220 rpm.
    3. בבוקר למחרת, בדקו את ה-OD600 (צפיפות אופטית באורך גל של 600 nm) של תרבית הלילה. הדליקו שני בקבוקי baffled בנפח 2.8 L המכילים כל אחד 1 L מצע LB/Kan באמצעות תרבית הלילה עד ל-OD600 של 0.1. הוסיפו שלוש טיפות של אמולסיית סיליקון מימית כדי למנוע היווצרות קצף מוגברת. גדלו את התאים ב-37 °C בניעור של 180 rpm עד שה-OD600 מגיע ל-0.6.
    4. קחו דגימה לפני אינדוקציה לצורך ניתוח SDS-PAGE (שווה ערך ל-1 ml מתרבית ב-OD600 = 1); הוסיפו IPTG לריכוז סופי של 0.5 mM כדי להשרות ביטוי של NHis-rPPEP-1. המשיכו לגדל ב-37 °C/180 rpm למשך 4 שעות.
    5. קבעו את ה-OD600 בדילול של 10x וקחו דגימת קציר (שווה ערך ל-1 ml מתרבית ב-OD600 = 1).
    6. אספו את התאים על ידי סנטריפוגציה למשך 20 דקות ב-7,000 x g וב-4 °C. כדי להסיר שאריות של מצע LB, השביו את משקעי התאים מ-1 L של תרבית ב-40 ml של באפר TBS (Tris-buffered saline: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl) והעבירו לשפופרת סנטריפוגה של 50 ml. אספו את התאים על ידי סנטריפוגציה למשך 10 דקות ב-10,000 x g וב-4 °C ואחסנו ב-80 °C- עד לשימוש. נתחו את הביטוי (ליזאטים כוללים ופראקציות מסיסות) באמצעות SDS-PAGE18.
  2. טיהור של rPPEP-1 ללא תג
    1. קחו דגימות של 50 µl מכל שלב של הטיהור לצורך ניתוח SDS-PAGE. השביו את משקע התאים מ-1 L של תרבית בבאפר TBS מועשר ב-10 µg/ml DNaseI. השתמשו ב-5 ml של TBS/DNaseI לכל גרם תאים.
      1. בצעו ליזיס לתאים על ידי סוניקציה על קרח/מים תוך שימוש ב-30% אמפליטודה למשך 15 דקות (פולסים של 2 שניות עם הפסקה של 2 שניות). הסירו פסולת על ידי סנטריפוגציה למשך 10 דקות ב-10,000 x g וב-4 °C והעבירו את supernatant לשפופרת אולטרסנטריפוגה. נקו את הליזאט באולטרסנטריפוגה למשך 30 דקות ב-165,000 x g וב-4 °C.
    2. עבדו בטמפרטורה של 4-6 °C. באמצעות משאבה פריסטלטית או מערכת כרומטוגרפיה, שווו 2 ml של שרף nickel-nitrilotriacetic acid (NiNTA) בעמודה מזכוכית עם באפר TBS מועשר ב-10 mM imidazole ב-pH 7.5. לחלופין, ניתן להשתמש בזרימה בכבידה.
      1. כווננו את הליזאט הנקי עם 1 M imidazole ב-pH 7.5 לריכוז סופי של 10 mM. העבירו את הליזאט לעמודה ושטפו בשלבים עם באפר TBS מועשר ב-10 mM וב-30 mM imidazole, בהתאמה, עד שבליעת ה-UV ב-280 nm מגיעה לקו הבסיס.
      2. בצעו אלוציה של החלבון עם באפר TBS בתוספת 250 mM imidazole. שווו מחדש את העמודה ל-TBS מועשר ב-10 mM imidazole ואחסנו למשך הלילה.
    3. קבעו את ריכוז החלבון ב-280 nm באמצעות מקדם האבליציה של 25,900 M-1 cm-1 או בכל שיטה אחרת (למשל, שיטת Bradford19). הוסיפו 2 יחידות של thrombin לכל mg חלבון ובצעו דיאליזה של תמיסת החלבון למשך הלילה ב-4 °C כנגד נפח של 50x TBS (פי 50 מנפח האלוציה של NiNTA).
      הערה: השתמשו בביקורת (blank) נכונה לקביעת ריכוז החלבון, כיוון ש-imidazole בולע חזק ב-280 nm.
    4. העבירו את תמיסת החלבון מעל שרף NiNTA ששווי כדי להסיר חלבון שלא נחתך. לאחר מכן, העבירו את אותו נפח של TBS מועשר ב-10 mM imidazole לעמודה כדי להשיב את כל החלבון שנחתך. כדי לנקות את העמודה, בצעו אלוציה לכל החלבון שנותר עם 250 mM imidazole. נתחו את הדגימות באמצעות SDS-PAGE (איור 1).
    5. רכזו את תמיסת החלבון ל-4 ml במרווחי זמן של 10 דקות ב-4,000 x g וב-4 °C באמצעות יחידת אולטרה-פילטרציה סנטריפוגית. ערבבו את החלבון המרוכז לאחר כל מרווח כדי למנוע שיקוע ואגרגציה. בשלב זה נצפה לעיתים שיקוע מסוים של rPPEP-1 למרות פעולת הערבוב.
      1. העבירו את החלבון המרוכז לעמודת כרומטוגרפיית הפרדה לפי גודל (size exclusion chromatography) ששוויה מראש (בבאפר TBS) ב-4-6 °C. בצעו אלוציה מהעמודה עם באפר TBS, אספו פראקציות של 1 ml והעבירו 5 µl מכל פראקציה שנייה לניתוח SDS-PAGE. rPPEP-1 יוצא באלוציה בשיא בודד המתאים למונומר (איור 2). לעיתים נצפה שיא משני במשקל מולקולרי גבוה יותר (fronting peak), המתאים לדימר של החלבון. התפוקה צפויה להיות סביב 50 mg של חלבון טהור לכל L של תרבית. נתחו את כל הדגימות באמצעות SDS-PAGE18 (איור 2).

figure-protocol-2
איור 2: ניתוח ייצוגי של rPPEP-1 באמצעות כרומטוגרפיית הֶחְלָפַת גודל (SEC) ו-SDS-PAGE. כרומטוגרמה של הֶחְלָפַת גודל (A280; בליעה ב-280 nm) של rPPEP-1 מטוהר ללא תג, באמצעות עמודה (16/600) ב-Tris-HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl ב-6 °C. בהתבסס על נפח האלוציה, rPPEP-1 נדלף כפי שצפוי עבור חלבון של 22 kDa, מה שמעיד על כך שהוא בעיקר מונומרי. לעיתים רחוקות מופיע פסגות קדמיות (fronting peak) מינוריות התואמות לדימר. (בתוך האיור) ניתוח SDS-PAGE של הפרקציות מכרומטוגרפיית הֶחְלָפַת הגודל (M; סולם משקלים מולקולריים). כל פרקציה שנייה נטענה. הפסים החלשים מתחת לפס הראשי של rPPEP-1 תואמים לזיהומים מינוריים המופיעים מדי פעם. אנא לחצו כאן להצגת גרסה מוגדלת של איור זה.

3. התגבשות ואופטימיזציה של גבישים באמצעות זריעה מיקרוסקופית (Microseeding)

הערה: rPPEP-1 מתגבש בתנאים המייצרים באופן קבוע גבישים שזורים מאוד שאינם מתאימים לניתוח דיפרקציית קרני X (איור 3). לכן, פותחה אסטרטגיית אופטימיזציה (איור 4) להשגת גבישים באיכות גבוהה (איור 5).

  1. סריקה ראשונית של rPPEP-1 באמצעות סריקות מסחריות
    הערה: בצעו ניסיונות התגבשות בפורמט של טיפה יושבת (sitting drop) תוך שימוש בסריקות סטנדרטיות הזמינות מסחרית וברובוט התגבשות.
    1. רכזו את החלבון המנוקה לריכוז של 12 mg/ml באמצעות מכשיר אולטרה-פילטרציה צנטריפוגלי במרווחי זמן של 5 דקות ב-4,000 x g וב-4 °C. ערבבו את החלבון המרוכז לאחר כל מרווח זמן כדי למנוע שיקוע ואגרגציה. קבעו את ריכוז החלבון ב-280 nm באמצעות מקדם האטילה (extinction coefficient) של 25,900 M-1 cm-1 או בכל שיטה אחרת (למשל, שיטת Bradford). השביחו את החלבון ל-20 °C. הסירו את כל החלקיקים והאבק באמצעות צנטריפוגציה למשך 10 min ב-16,000 x g וב-20 °C.
    2. השתמשו בלוחות התגבשות ממולאים מראש, אטומים ומאוחסנים ב-4 °C, או מלאו את בארי הרזרבואר של הלוחות ב-70 µl מכל תנאי התגבשות. השביחו את כל לוחות ההתגבשות ל-20 °C. עבדו במהירות, שכן הנפחים הקטנים מתייבשים במהירות. השתמשו בתא לחות סביב תחנת העגינה של הרובוט, במידת האפשר.
      הערה: השתמשו בסריקות הבאות כפרוצדורה סטנדרטית: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal, Wizard, PACT++, JCSG++.
    3. הקימו את הסריקה על ידי פיפטא של חלבון ורזרבואר לבארי המשנה 2-4. נפח הטיפה הוא 300 nl והיחסים (חלבון:רזרבואר) הם 200:100 (באר משנה 2), 150:150 (באר משנה 3) ו-100:200 (באר משנה 4) (ביחידות של nl). אטמו את הלוח מיד והניחו אותו בתא ב-20 °C.
    4. בדקו את המגשים מיד לאחר ההקמה, ולאחר מכן בדקו אותם מדי יום במהלך השבוע הראשון, ולאחר מכן בבדיקה שבועית.
  2. קו-קריסטליזציה (Co-crystallization) של rPPEP-1 עם ליגנדים
    1. לקו-קריסטליזציה של קומפלקסים של פפטיד-סובסטרט ו-rPPEP-1, ערבבו rPPEP-1 בריכוז 24 mg/ml ביחס של 1:1 (v/v) עם עודף מולרי של פי 7 של תמיסת פפטיד (אבקה ליאופיליזית של Ac-EVNPPVPD-NH2 המומסת בבופר TBS), מה שייתן ריכוז סופי של 12 mg/ml חלבון r-PPEP-1 ועודף מולרי של פי 7 של פפטיד ביחס ל-PPEP-1. הדגירו למשך 30 min ב-20 °C והסירו את כל החלקיקים והאבק באמצעות צנטריפוגציה למשך 10 min ב-16,000 x g וב-20 °C. המשיכו בהתגבשות תוך שימוש בפרוצדורת מיקרו-זרע (microseeding) כפי שמתואר עבור חלבון r-PPEP-1 שאינו קשור.

figure-protocol-3
איור 3: גבישים מייצגים מסריקות ראשוניות. גבישים שזורים מ-rPPEP-1 בריכוז 12 מג/מ"ל שגדלו בתנאי. (A(מסך גביש I/38 (1.4 M sodium citrate tribasic dehydrate, 0.1 M HEPES sodium pH 7.5; 200 nl:100 nl). (B) סריקת SaltRx/52 (אמוניום פוספט דיבסי 2.4 M, Tris 0.1 M pH 8.5; 100 nl:200 nl) ו(C(200 נ"ל:100 נ"ל).ד') סריקת SaltRx/96 (Tacsimate בריכוז 60% v/v pH 7.0, BIS-TRIS propane בריכוז 0.1 M pH 7.0; 200 nl:100 nl). סרגל קנה מידה = 0.2 מ"מ. יחסי הנפח הם תמיד חלבון:מאגר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-4
איור 4: הליך אופטימיזציה לקריסטליזציה של rPPEP-1. גבישים ראשוניים של rPPEP-1 בריכוז 12 mg/ml בעלי איכות דיפרקציה נמוכה וסריגים מרובים (צמיחה משולבת) שוכפלו במסך אופטימיזציה של 24 תנאים. שוב, נצפו גבישים משולבים בלבד בתנאים שהכילו 2.55 M ammonium phosphate dibasic. מלאי זריעה (seed stock) הוכן מגביש משולב בודד ודולל ביחס של 1:1,000 לאותו תנאי (מיקרו-זריעה). נפח של 0.5 µl ממלאי הזריעה המדולל הוסף לשאר הטיפות הצלולות, וגבישים בודדים צמחו כמעט בכל התנאים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

  1. אופטימיזציה של הגבישים באמצעות זריעה זעירה (microseeding)
    הערה: גבישים שזורים מאוד של rPPEP-1 מופיעים לאחר יומיים בתנאי הכולל 2.4 M ammonium phosphate dibasic, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 (מסך SaltRx, תנאי E4, בכל שלושת התאי המשניים) (איור 3). הוחל הליך אופטימיזציה באמצעות מסך סריגה (grid screen) סביב התנאי הראשוני בשילוב עם זריעה זעירה (איור 4).
    1. הכינו מסך סריגה (איור 4) הכולל 24 תנאים עם 1.8 - 2.55 M ammonium phosphate dibasic (במרווחים של 0.15 M) ו-0.1 M Tris-HCl pH 7.5-9.0 (במרווחים של 0.5 יחידות pH) מתמיסות אם מתאימות (בופרי 4 M ammonium phosphate ו-1 M Tris).
      הערה: השתמשו באפליקט Make Tray (http://hamptonresearch.com/make_tray.aspx) כדי לחשב את הנפחים ואת תכנית הפיפטור כדי להשיג 2 ml מכל תנאי, מה שמאפשר לבצע 10 מסכי אופטימיזציה. תמיסת האם של 4 M ammonium phosphate קשה להכנה. חממו את התמיסה תוך כדי ערבוב כדי להמיס את האבקה במים באופן מלא.
    2. פיפטו 200 µl מכל תמיסת מסך הסריגה אל תוך בארות של פלטה בעלת 24 בארות והמתינו להשגת שיווי משקל ב-20 °C.
    3. הכינו ידנית את פלטת ההתגבשות. נפח הטיפה הוא 3 µl והיחסים (חלבון:מאגר) הם 2:1, 1.5:1.5 ו-1:2 (ב-µl). בשלב זה, השתמשו בפיפט של דחיקה חיובית (positive displacement pipette) כדי למנוע היווצרות בועות אוויר. אטמו מיד את הפלטה והניחו אותה בתא ב-20 °C. הימנעו מהיווצרות בועות אוויר.
      הערה: לאחר יום אחד עד ארבעה ימים מופיעים גבישים שזורים מאוד בארבעת התנאים המכילים 2.55 M ammonium phosphate dibasic ו-0.1 M Tris-HCl pH 7.5 - 9.0 (איור 4). לא נוצרו גבישים ב-20 התנאים הנותרים עם ריכוזי ammonium phosphate נמוכים מ-2.55 M. הליך הזריעה הזעירה משמש להשגת גבישים בודדים של rPPEP-1 בתנאים אלו.
    4. הכינו מלאי זרעים זעירים על ידי איסוף גביש שזור בודד מאחד משני התנאים עם 2.55 M ammonium phosphate dibasic ו-0.1 M Tris-HCl pH 8.0 או 8.5. הגבישים עשויים להיות דבוקים למשטח הפלסטיק. עיוות זהיר של הפלסטיק שמסביב באמצעות מחט דיקור עוזר לנתק את הגבישים.
      1. העבירו 50 µl מתמיסת האם המתאימה לתוך מבחנה של 1.5 ml המכילה חרוץ זכוכית קטן ומלוטש מאוד (beads-for-seeds). באמצעות לולאת ניילון מורכבת, העבירו את הגביש לתוך 1 µl של תמיסת האם שהונחה על כיסוי זכוכית.
      2. העבירו את הנוזל המכיל את הגביש אל תוך המבחנה ובצעו ערבוב מהיר (vortex) במהירות גבוהה למשך 30 שניות. הכינו דילול של 1:1,000 ממלאי הזרעים לתוך מבחנה חדשה של 1.5 ml המכילה את אותו תנאי שהוכן טרי, וערבבו היטב ב-vortex למשך 5 שניות.
        הערה: ניתן לאחסן מלאי זרעים ב-80 °C- לשימוש מאוחר יותר.
    5. הסירו את האטימה של הפלטה המכסה את 20 התנאים עם הטיפות הצלולות ופיפטו 0.5 µl ממלאי הזרעים (דילול 1:1,000) לתוך הבארות. אטמו את הפלטה והניחו אותה בתא ב-20 °C. גבישים בודדים באיכות דיפרקציה גבוהה מופיעים תוך 2-7 ימים (איור 5).

figure-protocol-5
איור 5: גבישים מייצגים מסקר האופטימיזציה. גבישים בודדים של rPPEP-1 בריכוז 12 mg/ml שהוזרעו עם מלאי זרעים בדילול של 1:1,000 וגדלו בתנאים הבאים: (A) 2.1 M ammonium phosphate dibasic, 0.1 M Tris pH 7.5; יחס של 1.5 µl:1.5 µl; (B) 2.1 M ammonium phosphate dibasic, 0.1 M Tris pH 7.5; יחס של 2 µl:1 µl; (C) 2.25 M ammonium phosphate dibasic, 0.1 M Tris pH 8; יחס של 2 µl:1 µl; (D) 2.1 M ammonium phosphate dibasic, 0.1 M Tris pH 8; יחס של 1 µl:2 µl. (E) גביש המורכב בלולאת ניילון של 0.1-0.2 µm, שגדל ב-2.1 M ammonium phosphate dibasic, 0.1 M Tris pH 8 (יחס של 2 µl:1 µl) ועבר קריו-הגנה ב-2.1 M ammonium phosphate dibasic, 0.1 M Tris pH 8, 20% glycerol. סרגל קנה מידה = 0.2 mm ב-(A-D). יחסי הנפחים הם תמיד חלבון:מאגר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

4. הרכבת הגביש ואיסוף נתונים

הערה: כדי לקבל נתוני עקיפה באיכות המיטבית, יש להרכיב את הגבישים בשיא איכותם וגודלם. ניתן לאחסן גבישים בחנקן נוזלי עד לביצוע ניתוח עקיפת קרני X בטמפרטורה של 100 K. לכן, יש להתאים את התנאים שמהם הם הגיעו לתנאי קירור (cryo-conditions). ניתן להגן על גבישי rPPEP-1 מקפיאה (cryo-protection) על ידי הוספה של 20% glycerol או 30% sucrose (החלפת המים בתמיסת התנאים בחומר המגן).

  1. קיבוע הגבישים
    הערה: יש לבצע את כל שלבי הטיפול בגבישים תחת מיקרוסקופ סטריאו.
    1. בחרו את גודל לולאת הניילון האופטימלי עבור האורך המקסימלי של הגבישים שנבחרו. הציר הארוך הטיפוסי של גבישי rPPEP-1 הוא כ-100-200 µm (איור 5). הכינו זכוכית כיסוי ואת תנאי הקריו המתאימים (למשל> 2.1 M ammonium phosphate dibasic, 0.1 M Tris, pH 8.0, 20% glycerol).
      1. מלאו את מכלי הדואר מקצף בחנקן נוזלי, טענו את תפס המבחנות במבחנה וקררו אותה מראש במכל דואר מקצף של 800 ml ממולא בחנקן נוזלי. הניחו שרוול קריו ומחזיק קני קריו המסומנים במזהה מתאים בתוך מכל דואר מקצף של 2 L ממולא בחנקן נוזלי. טענו את המוט המגנטי בלולאת ניילון מורכבת.
        הערה: יש ללבוש ביגוד מגן (מגן עיניים/משקפיים, כפפות) בעבודה עם חנקן נוזלי. חפצים חמים שנטבלים בחנקן נוזלי עלולים לגרום להשפרצות.
    2. חתכו את סרט האיטום בעזרת סכין מנתחים חדה והסירו אותו בעזרת פינצטה. טפטפו בעזרת פיפטה 1 µl של תנאי הקריו על זכוכית הכיסוי (או לחלופין בבאר ריקה באותה פלטה) והוציאו את הגביש מהטיפה על ידי דייג עם לולאת הניילון המורכבת (איור 5). ניתן להפריד בקלות גבישים הדבקים לקרקעית על ידי עיוות הפלסטיק שסביבם בעזרת מחט דיקור.
      1. העבירו במהירות את הגביש לטיפת תנאי הקריו והניחו לו להגיע לשיווי משקל למשך 1 שנייה. דגו את הגביש החוצה במהירות האפשרית ובצעו הקפאה מהירה (plunge-freeze) בחנקן נוזלי.
      2. כאשר החנקן הנוזלי סביב הלולאה המורכבת מפסיק לרתוח, הניחו את הלולאה בתוך המבחנה. הניחו את המבחנה על מחזיק קני הקריו, וכאשר נטענו 6 מבחנות, הניחו שרוול קריו סביב המחזיק. אחסנו את הגבישים במכל ממולא בחנקן נוזלי עד לשימוש.
  2. איסוף נתונים
    הערה: ניתן לבצע את איסוף הנתונים בדיפרקטומיטר במעבדה, אם זמין, או בקו קרן של סינכרוטרון. עבור rPPEP-1, הנתונים נאספו בקו הקרן X06DA של ה-Swiss Light Source, Paul-Scherrer-Institute, Villigen, Switzerland, באמצעות גלאי ספירה פוטוני היברידי. ניתן לספק את הנתונים המקוריים ואת כל הקבצים ששימשו לקביעת המבנה על פי בקשה.
    1. הגדירו את אורך הגל של הקרן ל-1.282 Å (9,667 keV), שהוא אנרגיית סף בליעת קרני ה-x האופיינית (שיא) של יסוד האבץ. rPPEP-1 הוא מטלופרוטאז המכיל יחידת אבץ אחת למולקולה באתר הפעיל.
    2. אספו נתונים בטמפרטורה של 100 K במצב inverse-beam בפלחים של 10° לסך הכל 270° בכל כיוון. זמן החשיפה הוא 0.1 sec עם סיבוב של 0.1° לכל תמונה. הגדירו את התמסירות ל-14% (0.14).
    3. כדי לאסוף סט נתונים רגיל ברזולוציה גבוהה מגביש שני שמקורו באותם תנאי התגבשות, הגדירו את אורך הגל של הקרן ל-1.00 Å (12,398 keV). אספו נתונים בטמפרטורה של 100 K. זמן החשיפה הוא 0.1 sec עם סיבוב של 0.1° לכל תמונה. הגדירו את התמסירות ל-70% (0.7).

5. קביעת מבנה באמצעות Zinc-SAD

הערה: על מנת לקבוע את המבנה של rPPEP-1 באמצעות zinc-SAD, נדרשים ידע קריסטלוגרפי בסיסי וכן חבילות התוכנה XDS20, Phenix21 והתוכנה Coot22. לצורך ויזואליזציה של המבנים נדרשת התוכנה PyMOL23 או Chimera24. נתונים שנאספו באורך הגל המתאים לשיא של סף הבליעה של יסוד האבץ יכולים לשמש לפיזור אנומלי בנורך גל יחיד (SAD)25 כדי להשיג מידע על הפאזה שניתן להרחיב לכל אטומי החלבון.

  1. עיבוד נתונים
    1. עבדו את שני מערכי נתוני השיא (normal ו-inverse) באמצעות התוכנה XDS (לחלופין iMosflm או HKL3000) בחלילת סימטריה P212121 (חלילת סימטריה 19) תוך הפרדה של זוגות פרידל (נתונים אנומליים). פרמטרי תא היחידה צריכים להיות סביב a, b, c (Å) = 43.17, 71.68, 117.70 ו-α=β=γ (°) = 90. פעולה זו תניב שני קבצי HKL (קבצי רפלקציה).
    2. בחנו את הקובץ CORRECT.LP. השתמשו בנתונים עד לרזולוציה שבה ה-CC1/2 הוא לפחות 50%. בצעו סקיילינג (Scaling) משותף לשני מערכי הנתונים/קבצי הרפלקציה (קבצי HKL) באמצעות XSCALE. בחנו את הקובץ XSCALE.LP. בדקו עד לאן מגיע האות האנומלי (SigAno) וסמנו את הרזולוציה עם קורלציה אנומלית (Anomal Corr) של כ-30%, שהיא 2 Å במקרה של הנתונים המשמשים כאן שנאספו עד לרזולוציה של 1.67 Å. זוהי רזולוציית ה-cut-off עבור האות האנומלי המשמש ב-Phenix AutoSol.
    3. המירה את קובץ ה-HKL (המעובד) לקובץ רפלקציה בפורמט CCP4 (ששמו, לדוגמה, peak_anom.mtz) באמצעות XDSCONV, תוך יצירת תת-קבוצת Rfree של 5% ושמירה על הנתונים האנומליים (FRIEDEL'S_LAW=FALSE). בדקו את קובץ ה-mtz לעקביות באמצעות התוכנה mtzdmp תוך בדיקת פרמטרי תא היחידה, חלילת הסימטריה, קיומה של תת-קבוצת Rfree (תווית FreeRflag) והנתונים האנומליים (תוויות DANO/SIGDANO). הכינו גם קובץ mtz נוסף באמצעות XDSCONV ללא הפקת הנתונים האנומליים (FRIEDEL'S_LAW=TRUE; ששמו, לדוגמה, peak_native.mtz) לצורך זיקוק (refinement) בשלב מאוחר יותר.
  2. פתרון תת-מבנה (קביעת פאזה)
    1. הפעילו את Phenix AutoSol באמצעות קובץ הרפלקציה peak_anom.mtz. בחרו ב-SAD/MAD peak כסוג הנתונים ובחרו 2 אתרי אבץ (מכיוון שיש שני מולקולות ליחידה אסימטרית). בחרו בערכים הניסיוניים המדויקים יותר עבור פרמטרי f'/f'' (שנקבעו בסריקת פלואורסצנציה ב-beamline) או בערכים התאורטיים f' = -8.245 ו-f'' = 3.887. טענו גם את קובץ ה-FASTA המכיל את רצף חומצות האמינו של החלבון שהקריסטל).
    2. הגדירו את גבול הרזולוציה לרזולוציה שבה הקורלציה האנומלית (Anomal Corr) היא כ-30% (כפי שנקבע ב-5.1.2), במקרה זה 2 Å, ובחרו באפשרות "autobuild model". באמצעות הפאזות של שני אתרי האבץ שנמצאו על ידי Phenix HySS (חלק מתהליך העבודה של Phenix AutoSol), ניתן היה להסיק את הפאזות עבור החלבון כולו ולבנות את המודל (באמצעות Phenix RESOLVE) בתוך צפיפות האלקטרונים. המודל הטוב ביותר נקרא "overall_best.pdb".
  3. בניית מודל, זיקוק ותיקוף
    1. בחרו באפשרות "autobuild model" כדי לבנות את רוב מודל ה-rPPEP-1 באופן אוטומטי. בחנו את צפיפות האלקטרונים ברמת קונטור של 1.0 σ באמצעות התוכנה Coot (איור 6). היא צריכה להיות רציפה ומקיפה את אטומי המודל. באופן אידיאלי, יש לבנות במודל גם מספר מולקולות מים (ברזולוציה טובה מ-2.5 Å). מים חופשיים (החלל שבין המולקולות) לא צריכים להכיל צפיפות.
    2. בדקו אם המודל כולו מלא (כל חומצות האמינו בנויות בתוך צפיפות האלקטרונים). אם לא, בנו אותן ידנית באמצעות הכלים המסופקים ב-Coot. זקקו את המבנה על ידי הרצת סבבים איטרטיביים של Phenix Refine עם 5 סבבי זיקוק בכל פעם, תוך שימוש בקובץ המודל overall_best.pdb, קובץ הרפלקציה peak_native.mtz וקובץ רצף ה-FASTA; ובניית מודל ידנית ב-Coot.
    3. תקפו את איכות המודל המבני באמצעות הכלים המתאימים ב-Coot.

figure-protocol-6
איור 6: מפת צפיפות אלקטרונים ניסיונית ומודל של rPPEP-1 לאחר הרצת Phenix Autosol. צפיפות אלקטרונים בכחול ברמת קונטור של 1.0 σ המוצגת בתוכנת Coot. במפה ראשונית זו צפיפות האלקטרונים נפתרה היטב והמודל נבנה לתוך צפיפות האלקטרונים. התקריב מראה את השאריות His142 ו-Glu189, וכן מולקולת מים. אנא לחץ כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.

6. קביעת מבנה ברזולוציה גבוהה באמצעות החלפה מולקולרית

הערה: כדי להשיג מידע מבני ברזולוציה גבוהה לגבי rPPEP-1, נאסף סט נתונים טבעי (native dataset). לאחר מכן, בוצע הליך של החלפה מולקולרית (molecular replacement) באמצעות התוכנה Phaser26,27 (במסגרת חבילת התוכנה Phenix) מיושם תוך שימוש במבנה שנקבע באמצעות zinc-SAD כמודל. ניתן להשתמש בהליך זה גם מאוחר יותר בעת פתרון מבנים של rPPEP-1 תחושב עם מולקולות קטנות.

  1. כדי לקבל מבנה גבישי ברזולוציה גבוהה יותר (במקרה זה עד 1.4 Å), עבדו את מערך הנתונים הטבעי (native dataset) באמצעות התוכנה XDS (לחלופין iMosflm או HKL3000) בחלל סימטריה P212121 (חלל סימטריה 19). פרמטרי תא היחידה צריכים להיות בסביבות a, b, c (Å) = 43.17, 71.77, 117.80 ו-α=β=γ (°) = 90. פעולה זו תניב קובץ HKL אחד (קובץ רפלקציות).
  2. בחנו את הקובץ CORRECT.LP. השתמשו בנתונים עד לרזולוציה שבה ה-CC1/2 הוא לפחות 50%. המירו את קובץ ה-HKL לקובץ רפלקציות בפורמט CCP4 (שמו, לדוגמה, native.mtz) באמצעות XDSCONV, תוך יצירת תת-קבוצת Rfree של 5%. בדקו את עקביות קובץ ה-mtz באמצעות התוכנה mtzdmp, תוך בדיקת פרמטרי תא היחידה, חלל הסימטריה וקיומה של תת-קבוצת ה-Rfree (תחת התווית FreeRflag).
  3. הכינו את קובץ ה-PDB המכיל את המודל מתוך overall_best.pdb שנקבע קודם לכן, והסירו את כל מולקולות המים ואת כל הליגנדים (כלומר את אטום האבץ). טענו גם את קובץ ה-FASTA המכיל את רצף חומצות האמינו של החלבון שהגביש. הפעילו את Phaser בתוך Phenix תוך שימוש בקובץ הרפלקציות native.mtz. חפשו שתי מולקולות ליחידה אסימטרית אחת.
  4. לאחר פתרון מוצלח של המבנה (TFZ-score הגבוה מ-8; כאן 10.2), בחנו את המודל (ששמו native_phaser.1.pdb) ואת מפת צפיפות האלקטרונים ב-Coot. בנו ודייקו את המבנה על ידי הרצת סבבים חוזרים של Phenix Refine עם 5 סבבי דיוק בכל פעם, תוך שימוש בקובץ המודל native_phaser.1.pdb, בקובץ הרפלקציות native.mtz ובקובץ רצף ה-FASTA; ובמקביל בנייה ידנית של המודל ב-Coot.
  5. תקפו את איכות המודל המבני באמצעות הכלים המתאימים ב-Coot.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

rPPEP-1 מתבטא יתר על המידה בכמה זני E. coli, עם התשואה הגבוהה ביותר ב-E. coli BL21 (DE3) Star (איור 1C). לאחר שלב הכרומטוגרפיה הראשון של זיקה של NiNTA ניתן לנתק בהצלחה את תג 6xHis, מרוב החלבון, ובשלב השני של NiNTA ניתן להפריד לחלוטין חלבון לא מעוכל מחלבון מעוכל תרומבין (איור 1D). בעמודה S200 16/600, rPPEP-1 לא מתויג נודד כמונומר עם חזית מזדמנת המתאימה ככל הנראה למין הדימרי (איור 2A). החלבון טהור (איור 2B...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

קריסטלוגרפיית קרני X היא עדיין השיטה המהירה והמדויקת ביותר לקביעת מבנים תלת-ממדיים ברזולוציה קרובה לרמה האטומית של חלבונים28. עם זאת, היא דורשת גידול של גבישים בודדים בעלי סדר מבני גבוה. לעיתים קרובות קשה להשיג גבישים אלו, והמצב הגבישי הוא מלאכותי. למרות זאת, השוואה בין מבני חלבונים שנקבעו באמצעות קריסטלוגרפיית קרני X לאלו שנקבעו בשיטות אחרות, ובמיוחד NMR, מראה בדרך כלל התאמה טובה מאוד. במקרה של PPEP-1, מבנה NMR שפורסם לאחרונה29 מראה התאמה מצוינת למבנה הגבישי שקבענו14, כולל הניידות של ה-S...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לצוות בקו האלומה X06DA במקור האור השוויצרי, מכון פול-שרר, ויליג'ן, שווייץ על התמיכה במהלך איסוף נתוני הסינכרוטרון. אנו אסירי תודה למוניקה גומפרט על התמיכה הטכנית המצוינת. הפרויקט נתמך על ידי אוניברסיטת קלן ומענק INST 216/682-1 FUGG ממועצת המחקר הגרמנית. מלגת דוקטורט מבית הספר הבינלאומי לתארים מתקדמים בהתפתחות, בריאות ומחלות ל-C.P. מוכרת. המחקר שהוביל לתוצאות אלה קיבל מימון מתוכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית (FP7/2007-2013) במסגרת הסכם מענק מס' 283570 (BioStruct-X).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>גנים / וקטורים / זני תאים
pET28a וקטורMerck-Millipore69864תרומבין ניתנת לניתוק N-terminal His-tag
E. coli זן BL21 (DE3) StarThermoFisher ScientificC601003RNase H
גן מותאם לקודון חסר (עבור E. coli) של PPEP-1 (CD630_28300)חומצותמותאמות אישית27-220
שםCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
תמצית שמריםכל
טריפטון
אנטי קצף BSigma-AldrichA5757תחליב סיליקון מימי
Agarכל
Kanamycinכל
IPTGAppliChemA1008
Tris-HClAppliChemA1087דרגת חיץ
NaClכלמאגר
דרגת DNaseIAppliChemA3778
ImidazoleAppliChemA1073בדרגת חיץ
תרומביןסיגמא-אולדריץ'T4648
אמוניום פוספט דו-בסיסיסיגמא-אולדריץ'215996
גליצרול 100%כל
נוזל בדרגה הטהורה ביותר חנקןכללאחסון וקירור בהקפאה של גבישים
<חזק>שם<חזק>חברה><חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
><חזק>ציוד (כללי)
רועדכלטמפרטורות מספקת של 20 ° C - 37 ו-deg; C
כלי זכוכיתכלצלוחיות Erlenmeyer מבולבלות (50 מ"ל - 2.8 ליטר)
צנטריפוגה לנפחי תרבית גדוליםכלצנטריפוגה לנפחי עיבוד עד 12 ליטר
סוניקטור Vibra-Cell VCX500SonicsSO-VCX500או כל סוניקטור / משבש תאים אחר
אולטרה צנטריפוגהכלצנטריפוגה המספקת מהירויות של עד 150,000 x g
שרף NiNTA SuperflowQiagen
זכוכית ריקה Econo-ColumnBio-Rad7371007או כל עמודת זכוכית או פלסטיק ריקה אחרת
גודל אי הכללה עמודת כרומטוגרפיה HiLoad Superdex 200 16/600GE Healthcare28989335
מערכת כרומטוגרפיה Ä kta PurifierGE Healthcare28406264או כל מערכת כרומטוגרפיה אחרת
צינורות דיאליזה Spectra/Por 3Spectrum Labs132724
סגירת צינורות דיאליזה SpectrumLabs132738
יחידות אולטרה-סינון (רכזים) 10,000 NWCOכל
ספקטרופוטומטר
< חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי><חזק>הערות
<חזק>ציוד (קריסטלוגרפיה)
נמוך, פיפטה בנפח 0.1-10 ומיקרו; lכל
פיפטה תזוזה חיובית Microman M10GilsonF148501
רובוט התגבשותכל
לוחות התגבשות 96 בארות TTP IQ עם שלוש בארות חלבוןTTP4150-05810או כל צלחת התגבשות אחרת של 96 בארות 
24 בארות CombiClover Junior PlateJena BioscienceEB-CJR
סרט איטום קריסטל ברורהמפטון מחקרHR3-511
שקופיות כיסוי זכוכית סיליקון HamptonResearchHR3-225
מסכי התגבשות מסחריים: SaltRx, אינדקס, PEG/Ion, קריסטלהמפטון מחקרמגוונים
: אשף, PACT++, JCSG++JenaBioscienceמגוון
JBS חרוזים לזרעיםJena BioscienceCO-501
CrystalCap SPINE HT (לולאות ניילון)Hampton Researchמגוונים0.025 מ"מ - 0.5 מ"מ
בקבוקון CrystalCapHampton ResearchHR4-904
קצף קריוגני Dewar 800 מ"לHampton ResearchHR4-673
קצף קריוגני Dewar 2 LHampton ResearchHR4-675
מהדק בקבוקון, ישרHampton ResearchHR4-670
CrystalWand מגנטי, StraightHampton ResearchHR4-729
CryoCane 6 מחזיק בקבוקוןHampton ResearchHR4-711
CryoSleeveHampton ResearchHR4-708
CryoCane קודן צבע - WhiteHampton ResearchHR4-713
אזמלכל
מיקרו-מלקחיים ישריםכללמניפולציה של סרט איטום. etc.
מחט דיקור סיניanye. מבית מרקחת
מיקרוסקופ סטריאוכללבדיקת לוחות התגבשות והרכבה גבישית, הגדלה עד פי 160
אמינו של Geneart (Thermo Fisher Scientific) סוכרוז סיגמא-אולדריץ' 84097 UV-Vis מסכי התגבשות מסחריים גדלי לולאות

מקורות

  1. Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin Microbiol Infect. 18 (Suppl 6), 5-12 (2012).
  2. O'Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain. Gastroenterology. 136 (6), 1913-1924 (2009).
  3. Mitchell, B. G., Gardner, A. Mortality and Clostridium difficile infection: a review. Antimicrob Resist Infect Control. 1 (1), (2012).
  4. George, W. L., Sutter, V. L., Finegold, S. M. Antimicrobial agent-induced diarrhea--a bacterial disease. J Infect Dis. 136 (6), 822-828 (1977).
  5. George, R. H., et al. Identification of Clostridium difficile as a cause of pseudomembranous colitis. Br Med J. 1 (6114), 695(1978).
  6. Bartlett, J. G. Narrative review: the new epidemic of Clostridium difficile-associated enteric disease. Ann Intern Med. 145 (10), 758-764 (2006).
  7. Kelly, C. P., LaMont, J. T. Clostridium difficile--more difficult than ever. N Engl J Med. 359 (18), 1932-1940 (2008).
  8. Ünal, C. M., Steinert, M. Novel therapeutic strategies for Clostridium difficile infections. Expert Opin Ther Targets. 20 (3), 269-285 (2016).
  9. Kelly, C. P., et al. The Monoclonal Antibody, Bezlotoxumab Targeting C. difficile Toxin B Shows Efficacy in Preventing Recurrent C. difficile Infection (CDI) in Patients at High Risk of Recurrence or of CDI-Related Adverse Outcomes. Gastroenterology. 150 (4), S122(2016).
  10. Tsutsumi, L. S., Owusu, Y. B., Hurdle, J. G., Sun, D. Progress in the discovery of treatments for C. difficile infection: A clinical and medicinal chemistry review. Curr Top Med Chem. 14 (1), 152-175 (2014).
  11. Hensbergen, P. J., et al. Clostridium difficile secreted Pro-Pro endopeptidase PPEP-1 (ZMP1/CD2830) modulates adhesion through cleavage of the collagen binding protein CD2831. FEBS Lett. 589 (24), 3952-3958 (2015).
  12. Cafardi, V., et al. Identification of a novel zinc metalloprotease through a global analysis of Clostridium difficile extracellular proteins. PLoS One. 8 (11), e81306(2013).
  13. Hensbergen, P. J., et al. A novel secreted metalloprotease (CD2830) from Clostridium difficile cleaves specific proline sequences in LPXTG cell surface proteins. Mol Cell Proteomics. 13 (5), 1231-1244 (2014).
  14. Schacherl, M., Pichlo, C., Neundorf, I., Baumann, U. Structural Basis of Proline-Proline Peptide Bond Specificity of the Metalloprotease Zmp1 Implicated in Motility of Clostridium difficile. Structure. 23 (9), 1632-1642 (2015).
  15. Rawlings, N. D., Waller, M., Barrett, A. J., Bateman, A. MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors. Nucleic Acids Res. 42 (Release 10.0), D503-D509 (2014).
  16. Bergfors, T. Seeds to crystals. J Struct Biol. 142 (1), 66-76 (2003).
  17. Dauter, Z., Dauter, M., Dodson, E. Jolly SAD. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (Pt 3), 494-506 (2002).
  18. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  19. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  20. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 2), 125-132 (2010).
  21. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66, 213-221 (2010).
  22. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  23. The PyMOL Molecular Graphics System. , Schrödinger, LLC. (2002).
  24. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  25. Wang, B. C. Resolution of phase ambiguity in macromolecular crystallography. Methods Enzymol. 115, 90-112 (1985).
  26. McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  27. Zwart, P. H., et al. Automated structure solution with the PHENIX suite. Methods Mol Biol. 426, 419-435 (2008).
  28. Zheng, H., Handing, K. B., Zimmerman, M. D., Shabalin, I. G., Almo, S. C., Minor, W. X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery - where are we heading next? Expert Opin Drug Discov. 10 (9), 975-989 (2015).
  29. Rubino, J. T., et al. Structural characterization of zinc-bound Zmp1, a zinc-dependent metalloprotease secreted by Clostridium difficile. J Biol Inorg Chem. 21 (2), 185-196 (2016).
  30. Carson, M., Johnson, D. H., McDonald, H., Brouillette, C., Delucas, L. J. His-tag impact on structure. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63 (Pt 3), 295-301 (2007).
  31. Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. 571-607 (2005).
  32. Dummler, A., Lawrence, A. M., de Marco, A. Simplified screening for the detection of soluble fusion constructs expressed in E. coli using a modular set of vectors. Microb Cell Fact. 4, 34(2005).
  33. Stura, E. A., Wilson, I. A. Applications of the streak seeding technique in protein crystallization. J Crys Growth. 110 (1), 270-282 (1991).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

גיבוש חלבוניםטכניקת זריעה זעירה (Microseeding)עקיפת קרני רנטגןשיטת Zinc-SADהפקת חלבון רקומביננטיקביעת מבנה גבישיתנאי Ammonium PhosphatepH של בופר Trisהרכבה באמצעות לולאת ניילון
הפקה, התגבשות וקביעת מבנה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.