הפקה, התגבשות וקביעת מבנה C. difficile PPEP-1 באמצעות Microseeding ואבץ-SAD

Summary

פרולין-פרולין אנדופפטידאז-1 (PPEP-1) הוא מטאלופרוטיאז מופרש ויעד תרופה מבטיח מהפתוגן האנושי קלוסטרידיום דיפיצילה. כאן אנו מתארים את כל השיטות הדרושות לייצור וקביעת המבנה של חלבון זה.

Abstract

יש צורך בטיפולים חדשים לטיפול בזיהומי קלוסטרידיום דיפיצילה המהווים איום משמעותי על בריאות האדם. C. difficile metalloprotease PPEP-1 הוא יעד לפיתוח עתידי של מעכבים להפחתת האלימות של הפתוגן. כדי לבצע אפיון ביופיזי ומבני כמו גם בדיקת מעכבים, יהיה צורך בכמויות גדולות של חלבון טהור ופעיל. פיתחנו פרוטוקול לייצור וטיהור יעיל של PPEP-1 על ידי שימוש ב-E. coli כמארח הביטוי המניב כמויות וטוהר מספיקים של חלבון להתגבשות וקביעת מבנה. בנוסף, באמצעות מיקרו-זריעה, ניתן לגדל גבישים משולבים מאוד של PPEP-1 לגבישים מסודרים היטב המתאימים לניתוח עקיפה של קרני רנטגן. השיטות יכולות לשמש גם לייצור חלבונים רקומביננטיים אחרים ולחקר המבנים של חלבונים אחרים המייצרים גבישים שגדלו זה בזה.

Introduction

Difficile Clostridium הוא אחד הגורמים העיקריים של זיהומי שלשולים אנטיביוטיים הקשורים nosocomial ^1. גראם חיובי זה חיידק אנאירובי מועבר באמצעות טופס הנבג שלה באמצעות מחזור הצואה-פה. בעשור האחרון, החדשה '' המגפה '' או '' hypervirulent '' זנים (למשל BI / NAP1 / 027) גרמו לעלייה דרסטית זיהומים חדשים ושיעורי תמותה בצפון אמריקה ובאירופה ^2. C. difficile מחל -associated (CDAD) הנה דלקת מעי גסת סכנת חיים עם שיעורי תמותה גבוהים ^3. הסימפטומים נעו בין שלשול ⁴ קוליטיס pseudomembranous ⁵ ואת megacolon הרעיל לעתים קרובות הקטלן ^6.

טיפול CDAD קשה כמו הזנים האלימים הם multidrug עמיד ושיעור ההישנות גבוה ^7. באותו טיפול רגע כולל את metronidazole אנטיביוטיקה, fidaxomicin או ונקומיצין, או repetitiבמקרי vely חוזרים השתלת חיידקים בצואה. אסטרטגיות טיפוליות חדשות נדרשות ⁸ בדחיפות. התקדמות מסוימת זו נרשמת Bezlotoxumab נוגדנים חד שבטיים טיפולית, מיקוד הרעלן difficile ג B ^9, עברה בהצלחה לאחרונה שלב III של הניסויים הקליניים ואת הוגש לאישורו עם ה- FDA ו- EMA. בנוסף, אנטיביוטיקות חדשות נבדקות כרגע בשלבים שונים של ניסויים קליניים ^10.

כדי לפתח טיפול יעיל מטרות טיפוליות חדשות חייבות להיות מזוהות. שהתגלו לאחרונה C. difficile פרוטאז פרולין-פרולין endopeptidase-1 (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; EC 3.4.24.89) הוא יעד כזה מבטיח, כמו חוסר PPEP-1 זן נוק-אאוט פוחתת ארסיות של C . difficile in vivo ^11. PPEP-1 הוא metalloprotease מופרש ^12,13 ביקוע השני adhesins C. difficile ב C- הסופית שלהם ¹³ ובכך משחרר את bacter החסידIA מן האפיתל במעי האדם. לכן, הוא עוסק בשמירה על האיזון בין פנוטיפ הנייח ו ניע של difficile ג. כדי לפתח מעכבי סלקטיבית נגד PPEP-1 ו להבין איך היא מכירה מצעים שלה ידע אינטימי של מבנה תלת-ממדי שלו היא הכרחית. פתרנו את המבנה הגבישי הראשון של PPEP-1 לבד בקומפלקס עם פפטיד מצע ^14. PPEP-1 הוא פרוטאז הראשון הידוע כי אג"ח המסלקת פפטיד סלקטיבי בין שתי שאריות פרולין ^15. הוא נקשר המצע באופן פעמי מפותל ומייצב אותו דרך רשת אליפטיות-ארומטיים מורחבת של שאריות הממוקמות S-הלולאה המכסה את האתר הפעיל פרוטאז ^14. מצב המצע מחייב זו הנו ייחודי PPEP-1 ולא נמצא פרוטאזות אדם עד כה. זה עושה את זה יעד תרופה הבטיח, ואת מחוץ יעד השפעות של מעכבים מאוד לא סבירים.

כדי לפתח מסך סלקטיבית Inh PPEP-1ibitors בעתיד כמות גדולה של חלבון טהור monodisperse PPEP-1 הוא זקוק. יתר על כן, על מנת לקבוע את המצב של עקדת המעכבים הראשונים, מבני שיתוף קריסטל עם PPEP-1 יצטרך להיקבע. בידיים שלנו PPEP-1 מייצר גבישים intergrown כל הזמן. לכן פתחנו הליך אופטימיזציה לייצר גבישים עקיפים באיכות יחידה של PPEP-1. בפרוטוקול זה אנו מתארים בפרוטרוט את הייצור, טיהור, פתרון התגבשות ומבנה PPEP-1 ^14. אנו משתמשים בביטוי תאי coli Escherichia של גרסה PPEP-1 חסרת רצף אות הפרשה, כרומטוגרפיה זיקת כרומטוגרפיה הדרת גודל עם הסרת תג הטיהור, ואחריו microseeding ¹⁶ אל תוך מרקע אופטימיזציה קביעת מבנה באמצעות פיזור יחיד גל אבץ האנומלי (אבץ-SAD) ^17. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לקביעת ייצור ומבנה של חלבונים אחרים (למשל </ Em> metalloproteases) ובמיוחד עבור חלבונים לייצר גבישים intergrown. על פי בקשה, פלסמיד דנ"א של המבנה (pET28a-Nhis-rPPEP-1) ונתונים עקיפים יכולים להינתן למטרות חינוכיות.

Protocol

1. עיצוב שיבוט ובנייה

1. שכפל את הרצף המותאם לקודון (עבור E. coli) של C. difficile PPEP-1 ללא פפטיד האות [חומצות אמינו 27-220, להלן PPEP-1 רקומביננטי (rPPEP-1)¹¹] לתוך וקטור pET28a באמצעות אתרי הגבלה NdeI ו-XhoI (איור 1) עם קודון עצירה בקצה 3' (כתוצאה מכך וקטור pET28a-NHis-rPPEP-1). זה מייצר חלבון מתויג N-terminally 6xHis (NHis-rPPEP-1) עם אתר מחשוף תרומבין המאפשר הסרת התג במהלך הטיהור (איור 1). הפלסמיד מכיל קלטת עמידות לקנמיצין לבחירה. הפריימרים המשמשים לשיבוט מתוארים במקום אחר¹⁴.

איור 1: ייצוג סכמטי של ניתוח הביטוי pET28a-NHis-rPPEP-1 ו-SDS-PAGE של המבנה וכל שלבי הטיהור. (A) מפה וקטורית של NHis-rPPEP-1 משוכפלת לווקטור pET28a באמצעות NdeI/Xhoשיצרתי עם PlasMapper. (B) ייצוג סכמטי של מבנה NHis-rPPEP-1 (פאנל עליון) והמבנה הסופי לאחר מחשוף טרומבין של תג 6xHis, עם רצף ה-GSHM הנוסף שנוצר בקצה ה-N (הפאנל התחתון). ניתוח SDS-PAGE (C) של הביטוי ב-BL21 (DE3) כוכב ב-37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות ו-(D) של דגימות מכל שלבי הטיהור (M: סמן משקל מולקולרי). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

2. ביטוי וטיהור של rPPEP-1

1. ביטוי של NHis-rPPEP-1
   1. איפור וחיטוי LB (מרק ליזוגני) בינוני (10 גרם/ליטר טריפטון, 5 גרם/ליטר תמצית שמרים, 10 גרם/ליטר NaCl, התאם ל-pH 7.5 עם NaOH). יש ליטול תוסף עם קנמיצין סולפט (50 מק"ג/מ"ל) ממש לפני השימוש (מדיום LB/Kan).
   2. יש לחסן תרבית לילה של 200 מ"ל מ-E. coli טרי שעבר טרנספורמציה במדיום LB/Kan. גדל למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-220 סל"ד.
   3. למחרת בבוקר, בדוק את ה-OD₆₀₀ (צפיפות אופטית באורך גל של 600 ננומטר) של תרבית הלילה. חסנו שתי צלוחיות מבולבלות של 2.8 ליטר המכילות 1 ליטר מדיום LB/Kan כל אחת עם תרבית הלילה ל-OD₆₀₀ של 0.1. תוסף עם שלוש טיפות של תחליב סיליקון מימי כדי למנוע היווצרות קצף מוגזמת. לגדל תאים ב-37 מעלות צלזיוס, לרעוד ב-180 סל"ד עד שה-OD₆₀₀ מגיע ל-0.6.
   4. קח דגימת טרום אינדוקציה לניתוח SDS-PAGE (שווה ערך ל-1 מ"ל מתרבית ב-OD₆₀₀ = 1); הוסף IPTG לריכוז סופי של 0.5 מ"מ כדי לגרום לביטוי של NHis-rPPEP-1. המשך לגדול ב-37°C/180 סל"ד למשך 4 שעות.
   5. קבע את ה-OD₆₀₀ בדילול פי 10 וקח דגימת קציר (שווה ערך ל-1 מ"ל מתרבית ב-OD₆₀₀ = 1).
   6. אסוף תאים על ידי צנטריפוגה למשך 20 דקות בטמפרטורה של 7,000 x g ו-4 °C. כדי להסיר שאריות של מדיום LB יש להשהות כדורי תאים מ-1 ליטר תרבית במאגר TBS של 40 מ"ל (תמיסת מלח Tris-buffered: 20 מ"מ Tris-HCl, pH 7.5, 200 מ"מ NaCl) ולהעביר לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. אוספים תאים על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 10,000 x גרם ו-4 מעלות צלזיוס ומאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. נתח ביטוי (סך כל הליזטים ושברים מסיסים) באמצעות SDS-PAGE¹⁸.
2. טיהור rPPEP-1 לא מתויג
   1. קח דגימות של 50 מיקרוליטר מכל שלב טיהור לניתוח SDS-PAGE. השעו מחדש את כדור התא מ-1 ליטר תרבית במאגר TBS בתוספת 10 מיקרוגרם/מ"ל DNaseI. השתמש ב-5 מ"ל TBS/DNaseI לכל גרם תאים.
      1. לייז את התאים על ידי סוניקציה על קרח/מים באמצעות משרעת של 30% למשך 15 דקות (פולסים של 2 שניות עם הפסקה של 2 שניות). הסר פסולת על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-10,000 x g ו-4 °C והעבר סופרנטנט לצינור אולטרה-צנטריפוגה. ליזאט שקוף באולטרה-צנטריפוגה למשך 30 דקות ב-165,000 x גרם ו-4 מעלות צלזיוס.
   2. עבודה בטמפרטורה של 4-6 מעלות צלזיוס. בעזרת משאבה פריסטלטית או מערכת כרומטוגרפיה יש לאזן 2 מ"ל של שרף חומצה ניטרילוטריאצטית (NiNTA) בעמוד זכוכית עם מאגר TBS בתוספת 10 מ"מ אימידזול pH 7.5. לחלופין, השתמש בזרימת כוח הכבידה.
      1. התאם את הליזאט הנקי עם 1 M imidazole pH 7.5 לריכוז סופי של 10 מ"מ. מרחו את הליזאט על העמוד ושטפו צעד עם מאגר TBS בתוספת 10 מ"מ ו-30 מ"מ אימידזול, בהתאמה, עד שספיגת ה-UV ב-280 ננומטר הגיעה לקו הבסיס.
      2. יש לסלק את החלבון עם מאגר TBS בתוספת 250 מ"מ אימידזול. יש לאזן מחדש את העמודה ל-TBS בתוספת 10 מ"מ אימידזול ולאחסן למשך הלילה.
   3. קבע את ריכוז החלבון ב-280 ננומטר באמצעות מקדם ההכחדה של 25,900 ^M-1 ס"^מ-1 או בכל שיטה אחרת (למשל שיטת ברדפורד¹⁹). הוסף 2 יחידות תרומבין למ"ג חלבון ודיאליזה של תמיסת החלבון למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס כנגד נפח של פי 50 של TBS (פי 50 מנפח הפליטה של NiNTA).
      הערה: קח את הריק הנכון לקביעת ריכוז החלבון, מכיוון שאימידזול נספג חזק ב-280 ננומטר.
   4. העבירו את תמיסת החלבון על שרף NiNTA המאוזן כדי להסיר חלבון לא מאוזן. לאחר מכן, מרחו את אותו נפח של TBS בתוספת 10 מ"מ אימידזול על העמודה כדי לשחזר את כל החלבון השסוע. כדי לנקות את העמודה, יש להוציא את כל החלבון שנותר עם 250 מ"מ אימידזול. נתח דגימות באמצעות SDS-PAGE (איור 1).
   5. רכז את תמיסת החלבון ל-4 מ"ל במרווחים של 10 דקות ב-4,000 x g ו-4 °C באמצעות יחידת אולטרה-סינון צנטריפוגלית. מערבבים את החלבון המרוכז לאחר כל מרווח כדי למנוע משקעים וצבירה. בשלב זה מדי פעם נצפים משקעים מסוימים עבור rPPEP-1 למרות הליך הערבוב.
      1. החל את החלבון המרוכז על עמודת כרומטוגרפיה של אי הכללה בגודל מאוזן מראש (במאגר TBS) בטמפרטורה של 4-6 מעלות צלזיוס. הסר את העמודה עם מאגר TBS, אסוף שברים של 1 מ"ל והכפיף 5 מיקרוליטר מכל שבר שני לניתוח SDS-PAGE. rPPEP-1 נפלט בשיא יחיד המתאים למונומר (איור 2). מדי פעם נצפה שיא מינורי במשקל מולקולרי גדול יותר (שיא קדמי), המתאים לדימר של החלבון. התשואה צריכה להיות בסביבות 50 מ"ג חלבון טהור לליטר תרבית. נתח את כל הדגימות באמצעות SDS-PAGE¹⁸ (איור 2).

איור 2: כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל מייצג וניתוח SDS-PAGE של rPPEP-1. כרומטוגרמה של אי הכללת גודל (A280; ספיגה ב-280 ננומטר) של rPPEP-1 מטוהר לא מתויג באמצעות עמודה (16/600) ב-Tris-HCl, pH 7.5, 200 מ"מ NaCl ב-6 מעלות צלזיוס. בהתבסס על נפח הפליטה, rPPEP-1 נודד כצפוי עבור חלבון של 22 kDa, מה שמצביע על כך שהוא מונומרי בעיקר. לעתים רחוקות מופיעה פסגה קדמית קטנה המתאימה לדימר. (משובץ) ניתוח SDS-PAGE של השברים מכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (M; סמן משקל מולקולרי). כל שבר שני מוחל. הרצועות החיוורות מתחת לפס ה-rPPEP-1 הראשי תואמות לזיהומים קלים המתרחשים מדי פעם. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

3. התגבשות ואופטימיזציה של גבישים באמצעות מיקרו-זריעה

הערה: rPPEP-1 מתגבש מתנאים המייצרים כל הזמן גבישים מגודלים מאוד שאינם מתאימים לניתוח עקיפה של קרני רנטגן (איור 3). לכן, פותחה אסטרטגיית אופטימיזציה (איור 4) להשגת גבישים באיכות גבוהה (איור 5).

1. סינון ראשוני של rPPEP-1 באמצעות מסכים מסחריים
   הערה: בצע ניסויי התגבשות בפורמט טיפת ישיבה באמצעות מסכים סטנדרטיים זמינים מסחרית ורובוט התגבשות.
   1. רכז את החלבון המטוהר ל-12 מ"ג/מ"ל באמצעות מכשיר אולטרה-סינון צנטריפוגלי במרווחים של 5 דקות ב-4,000 x g ו-4 °C. מערבבים את החלבון המרוכז לאחר כל מרווח כדי למנוע משקעים וצבירה. קבע את ריכוז החלבון ב-280 ננומטר באמצעות מקדם ההכחדה של 25,900 ^M-1 ס"^מ-1 או בכל שיטה אחרת (למשל שיטת ברדפורד). יש לאזן את החלבון ל-20 מעלות צלזיוס. יש לנקות את כל החלקיקים והאבק על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 16,000 x גרם ו-20 מעלות צלזיוס.
   2. השתמש בלוחות התגבשות שכבר מולאו מראש אטומים ומאוחסנים ב-4 מעלות צלזיוס או מלא את בארות המאגר של הלוחות ב-70 מיקרוליטר מכל מצב התגבשות. אזנו את כל לוחות ההתגבשות ל-20 מעלות צלזיוס. עבדו במהירות, מכיוון שהנפחים הקטנים מתייבשים במהירות. השתמש בתא לחות סביב המזח של הרובוט, במידת האפשר.
      הערה: השתמש במסכים הבאים כהליך סטנדרטי: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal, Wizard, PACT++, JCSG++.
   3. הגדר את המסך על ידי פיפטינג חלבון ומאגר לבארות משנה 2-4. נפח הטיפה הוא 300 nl והיחסים (חלבון: מאגר) הם 200:100 (תת-באר 2), 150:150 (תת-באר 3) ו-100:200 (תת-באר 4) (ב-nl). אוטמים מיד את הצלחת ומניחים בתא בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.
   4. בדוק את המגשים מיד לאחר ההתקנה, ולאחר מכן בדוק כל יום במהלך השבוע הראשון ואחריו בדיקה שבועית.
2. התגבשות משותפת של rPPEP-1 עם ליגנדים
   1. לצורך התגבשות משותפת של קומפלקסים של פפטיד-rPPEP-1 במצע, מערבבים rPPEP-1 ב-24 מ"ג/מ"ל ביחס של 1:1 (v/v) עם עודף מולרי פי 7 של תמיסת פפטיד (Ac-EVNPPVPD-NH₂) אבקה ליופילית מסיסה במאגר TBS), מה שייתן ריכוז סופי של 12 מ"ג/מ"ל חלבון r-PPEP-1 ועודף מולרי פי 7 של פפטיד על פני PPEP-1. דגירה למשך 30 דקות ב-20 מעלות צלזיוס ונקה את כל החלקיקים והאבק על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-16,000 x גרם ו-20 מעלות צלזיוס. המשך בהתגבשות באמצעות הליך המיקרו-זריעה כמתואר עבור חלבון r-PPEP-1 הלא קשור.

איור 3: גבישים מייצגים ממסכים ראשוניים. גבישים משולבים מ-rPPEP-1 במינון של 12 מ"ג/מ"ל שגדלו במצב. (A) מסך קריסטל I/38 (1.4 M נתרן ציטראט tribasic dehydrate, 0.1 M HEPES נתרן pH 7.5; 200 nl:100 nl). (B) רשת SaltRx/52 (2.4 מיליון אמוניום פוספט דו-בסיסי, 0.1 M Tris pH 8.5; 100 nl:200 nl) ו-(C) (200 nl:100 nl). (D) מסך SaltRx/96 (60% v/v Tacsimate pH 7.0, 0.1 M BIS-TRIS פרופאן pH 7.0; 200 nl:100 nl). סרגל קנה המידה = 0.2 מ"מ. יחסי נפח הם תמיד חלבון: מאגר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: נוהל אופטימיזציה עבור התגבשות rPPEP-1. גבישים ראשוניים מ-rPPEP-1 ב-12 מ"ג/מ"ל באיכות עקיפה נמוכה ועם סריגים מרובים (משולבים) שוחזרו במסך אופטימיזציה של 24 תנאים. שוב, רק גבישים שגדלו זה בזה נצפו בתנאים המכילים 2.55 מיליון אמוניום פוספט דו-בסיסי. מלאי זרעים הוכן מגביש יחיד שגדל משולב ודולל 1:1,000 לאותו מצב (מיקרו-זריעה). נפח של 0.5 מיקרוליטר ממלאי הזרעים המדולל נוסף לטיפות השקופות הנותרות וגבישים בודדים גדלו כמעט בכל התנאים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

3. אופטימיזציה של גבישים באמצעות microseeding
   הערה: גבישים משולבים מאוד של rPPEP-1 מופיעים לאחר יומיים במצב המכיל 2.4 M אמוניום פוספט דו-בסיסי, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 (מסך SaltRx, מצב E4, כל שלושת בארות המשנה) (איור 3). יושם הליך אופטימיזציה באמצעות מסך רשת סביב המצב ההתחלתי בשילוב עם מיקרו-זריעה (איור 4).
   1. הכן מסך רשת (איור 4) המורכב מ-24 תנאים עם 1.8 - 2.55 M אמוניום פוספט דו-בסיסי (בשלבים של 0.15 M) ו-0.1 M Tris-HCl pH 7.5-9.0 (בשלבים של 0.5 יחידות pH) מתמיסות מלאי מתאימות (4 M אמוניום פוספט ו-1 M חוצץ Tris).
      הערה: השתמש ביישומון Make Tray (http://hamptonresearch.com/make_tray.aspx) כדי לחשב את אמצעי האחסון ואת ערכת הפיפטינג כדי לקבל 2 מ"ל מכל תנאי המאפשר לבצע 10 מסכי מיטוב. תמיסת מלאי אמוניום פוספט 4 M קשה להכנה. מחממים את התמיסה תוך כדי ערבוב כדי להמיס לחלוטין את האבקה במים.
   2. פיפטה 200 מיקרוליטר מכל תמיסת רשת לתוך הבארות של צלחת של 24 בארות ושיווי משקל ב-20 מעלות צלזיוס.
   3. הגדר ידנית את לוחית ההתגבשות. נפח הטיפה הוא 3 מיקרוליטר והיחסים (חלבון: מאגר) הם 2:1, 1.5:1.5 ו-1:2 (במיקרוליטר). כאן, השתמש בפיפטה תזוזה חיובית כדי למנוע היווצרות בועות אוויר. אוטמים מיד את הצלחת ומניחים בתא בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. הימנע מהיווצרות בועות אוויר.
      הערה: לאחר יום עד ארבעה ימים מופיעים גבישים משולבים מאוד בארבעת התנאים המכילים 2.55 M אמוניום פוספט דו-בסיסי ו-0.1 M Tris-HCl pH 7.5 - 9.0 (איור 4). לא נוצרים גבישים ב-20 התנאים הנותרים עם ריכוזי אמוניום פוספט מתחת ל-2.55 מ'. הליך המיקרו-זריעה משמש להשגת גבישים בודדים של rPPEP-1 בתנאים אלה.
   4. הכן מלאי מיקרו-זרעים על ידי קצירת גביש יחיד שגדל בשילוב מאחד משני התנאים עם 2.55 M אמוניום פוספט דו-בסיסי ו-0.1 M Tris-HCl pH 8.0 או 8.5. הגבישים עשויים להיות מחוברים למשטח הפלסטיק. עיוות זהיר של הפלסטיק שמסביב בעזרת מחט דיקור עוזר לנתק את הגבישים.
      1. העבירו 50 מיקרוליטר של משקה האם המתאים לצינור של 1.5 מ"ל המכיל חרוז זכוכית קטן ומלוטש מאוד (חרוזים לזרעים). בעזרת לולאת ניילון מותקנת, העבירו את הגביש ל-1 מיקרוליטר של משקה האם המונח על מגלשת כיסוי זכוכית.
      2. העבירו את הנוזל המכיל את הגביש לתוך הצינור והמערבולת במהירות גבוהה למשך 30 שניות. בצעו דילול של 1:1,000 של ציר הזרעים לתוך שפופרת חדשה של 1.5 מ"ל המכילה את אותו מצב טרי שהוכן ומערבולת ביסודיות למשך 5 שניות><. הערה: ניתן לאחסן מלאי זרעים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
   5. הסר את חותם הצלחת המכסה את 20 התנאים בטיפות שקופות ופיפטה 0.5 מיקרוליטר ממלאי הזרעים (דילול 1:1,000) לתוך הבארות. אוטמים את הצלחת ומניחים בתא בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. גבישים בודדים באיכות עקיפה גבוהה מופיעים תוך 2-7 ימים (איור 5).

איור 5: גבישים מייצגים ממסך אופטימיזציה. גבישים בודדים מ-rPPEP-1 ב-12 מ"ג/מ"ל זרעים עם מלאי זרעים בדילול של 1:1,000 שגדלו בתנאים הבאים: (A) 2.1 M אמוניום פוספט דו-בסיסי, 0.1 M Tris pH 7.5; 1.5 מיקרוליטר: 1.5 מיקרוליטר; (B) 2.1 מ' אמוניום פוספט דו-בסיסי, 0.1 מ' טריס pH 7.5; 2 מיקרוליטר: 1 מיקרוליטר; (C) 2.25 M אמוניום פוספט דו-בסיסי, 0.1 M Tris pH 8; 2 מיקרוליטר: 1 מיקרוליטר; (D) 2.1 M אמוניום פוספט דו-בסיסי, 0.1 M Tris pH 8; 1 מיקרוליטר: 2 מיקרוליטר (E) גביש מורכב בלולאת ניילון 0.1-0.2 מיקרומטר, גדל באמוניום פוספט דו-בסיסי 2.1 M, 0.1 M Tris pH 8 (2 מיקרוליטר: 1 מיקרוליטר) ומוגן בהקפאה ב-2.1 M אמוניום פוספט דו-בסיסי, 0.1 M Tris pH 8, 20% גליצרול. סרגל קנה המידה = 0.2 מ"מ אינץ' (A-D). מנת נפח היא תמיד חלבון: מאגר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

4. הרכבת גבישים ואיסוף נתונים

הערה: כדי להשיג את האיכות הטובה ביותר של נתוני עקיפה יש להרכיב גבישים בשיא איכותם וגודלם. ניתן לאחסן גבישים בחנקן נוזלי עד שהם נתונים לניתוח עקיפה של קרני רנטגן ב-100 K. לכן, יש להתאים את המצב ממנו הם נובעים לתנאי קריו. גבישי rPPEP-1 יכולים להיות מוגנים בהקפאה על ידי תוספת של 20% גליצרול או 30% סוכרוז (החלפת מים במצב על ידי מגן קריו).

1. קריסטל הרכבה
   הערה: יש לבצע את כל שלבי המניפולציה של הגביש תחת הסטריאומיקרוסקופ.
   1. בחר את הגודל האופטימלי של לולאת ניילון עבור האורך המקסימלי של הגבישים שנבחרו. הציר הארוך ביותר האופייני של גבישי rPPEP-1 הוא כ-100-200 מיקרומטר (איור 5). הכן שקופית כיסוי ואת מצב הקריו המתאים (למשל 2.1 M אמוניום פוספט דו-בסיסי, 0.1 M Tris, pH 8.0, 20% גליצרול).
      1. מלאו את חמצני הקצף בחנקן נוזלי, העמיסו את מהדק הבקבוקון בבקבוקון וקררו אותו מראש במלח קצף 800 מ"ל מלא בחנקן נוזלי. הנח שרוול קריו ומחזיק מקל קריו המסומן במזהה מתאים בקצף 2 ליטר מלא בחנקן נוזלי. טען את השרביט המגנטי עם לולאת ניילון מותקנת.
         הערה: ללבוש ביגוד מגן (מגן עיניים/משקפיים, כפפות) בעת עבודה עם חנקן נוזלי. חפצים חמים שצוללים בחנקן נוזלי עלולים לייצר נזילות.
   2. חותכים את סרט האיטום בעזרת אזמל חד ומסירים אותו בעזרת המלקחיים. פיפטה 1 מיקרוליטר של מצב הקריו מחליקה על המכסה (או לחילופין בבאר ריקה על אותה צלחת) ומסירה את הגביש מהטיפה על ידי דיג עם לולאת הניילון המותקנת (איור 5). ניתן לנתק בקלות גבישים מחוברים מהקרקע על ידי עיוות הפלסטיק שמסביב באמצעות מחט דיקור.
      1. העבירו במהירות את הגביש לטיפת מצב קריו ותנו לו להתייצב למשך שנייה אחת. דג את הגביש החוצה במהירות האפשרית וצלול להקפיא בחנקן נוזלי.
      2. כאשר החנקן הנוזלי סביב הלולאה המותקנת מפסיק לרתוח, הנח את הלולאה בבקבוקון. הנח את הבקבוקון על מחזיק מקל הקריו וכאשר הוא עמוס ב-6 בקבוקונים הנח שרוול קריו סביב המחזיק. אחסן את הגבישים במיכל מלא בחנקן נוזלי עד לשימוש.
2. איסוף נתונים
   הערה: איסוף נתונים יכול להתבצע בדיפרקטומטר הביתי, אם זמין, או בקו אלומה סינכרוטרוני. עבור rPPEP-1 נאספו נתונים בקו האלומה X06DA של מקור האור השוויצרי, מכון פול-שרר, ויליג'ן, שוויץ באמצעות גלאי ספירת פוטונים היברידי. ניתן לספק את הנתונים המקוריים ואת כל הקבצים המשמשים לקביעת המבנה על פי בקשה.
   1. הגדר את אורך הגל של הקרן ל-1.282 Å (9,667 keV), שהיא אנרגיית קצה ספיגת קרני הרנטגן האופיינית (שיא) של היסוד אבץ. rPPEP-1 הוא מטאלופרוטיאז המכיל אבץ בודד לכל מולקולה באתר הפעיל.
   2. אסוף נתונים ב-100 K במצב אלומה הפוכה בטריזים של 10° בסך הכל 270° לכל כיוון. זמן החשיפה הוא 0.1 שניות עם סיבוב של 0.1° לתמונה. הגדר את השידור ל-14% (0.14).
   3. כדי לאסוף מערך נתונים מקורי ברזולוציה גבוהה מגביש שני שמקורו באותו מצב התגבשות, הגדר את אורך הגל של האלומה ל-1.00 Å (12,398 keV). אסוף נתונים ב-100 K. זמן החשיפה הוא 0.1 שניות עם סיבוב של 0.1° לתמונה. הגדר את השידור ל-70% (0.7).

5. קביעת מבנה באמצעות אבץ-SAD

הערה: על מנת לקבוע את המבנה של rPPEP-1 באמצעות אבץ-SAD יש צורך בידע קריסטלוגרפי בסיסי כמו גם בחבילות התוכנה XDS²⁰, Phenix²¹ והתוכנית Coot²². לצורך הדמיה של מבנים יש צורך בתוכנית PyMOL²³ או Chimera²⁴. נתונים שנאספו באורך הגל המתאים לשיא בקצה הספיגה של היסוד אבץ יכולים לשמש לפיזור חריג באורך גל יחיד (SAD)²⁵ כדי לקבל מידע פאזה שניתן להרחיב עבור כל אטומי החלבון.

1. עיבוד נתונים
   1. עבד את שני מערכי הנתונים הגבוהים (נורמלי והפוך) באמצעות התוכנה XDS (לחלופין iMosflm או HKL3000) בקבוצת החלל P2_{12 1}1 (קבוצת חלל 19) המפרידה בין בני הזוג של פרידל (נתונים חריגים). פרמטרי תא היחידה צריכים להיות סביב a, b, c (Å) = 43.17, 71.68, 117.70 ו- α=β=γ (°) = 90. זה נותן שני קבצי HKL (קבצי השתקפות).
   2. בדוק את הקובץ CORRECT. ל.פ. השתמש בנתונים עד לרזולוציה שבה CC_1/2 הוא לפחות 50%. שנה את קנה המידה של שני מערכי הנתונים/קבצי ההשתקפות (קבצי HKL) באמצעות XSCALE. בדוק את הקובץ XSCALE. ל.פ. בדוק עד כמה האות החריג משתרע (SigAno) ושים לב לרזולוציה עם מתאם חריג (Anomal Corr) של כ-30%, שהוא 2 Å במקרה של הנתונים המשמשים כאן שנאספו ל-1.67 Å. זהו חתך הרזולוציה עבור האות החריג המשמש ב- Phenix AutoSol.
   3. המר את קובץ HKL (בקנה מידה) לקובץ השתקפות בפורמט CCP4 (בשם, למשל, peak_anom.mtz) באמצעות XDSCONV ליצירת תת-קבוצה_חופשית R של 5% ושמירה על הנתונים החריגים (FRIEDEL'S_LAW=FALSE). בדוק את קובץ ה-mtz-file אם הוא עקבי עם התוכנית mtzdmp הבודקת את הפרמטרים של תא היחידה, את קבוצת המרחב ואת קיומה של תת-הקבוצה_{החופשית} R (תווית FreeRflag) והנתונים החריגים (תוויות DANO/SIGDANO). הכן גם קובץ mtz נוסף עם XDSCONV מבלי לחלץ את הנתונים החריגים (FRIEDEL'S_LAW=TRUE; בשם, למשל, peak_native.mtz) לליטוש בשלב מאוחר יותר.
2. פתרון תשתית (קביעת פאזה)
   1. הפעל את Phenix AutoSol באמצעות קובץ ההשתקפות peak_anom.mtz. בחר שיא SAD/MAD כסוג נתונים ובחר 2 אתרי אבץ (מכיוון שיש שתי מולקולות ליחידה אסימטרית). בחר את ערכי הניסוי המדויקים יותר עבור הפרמטרים f'/f'' (שנקבעו בסריקת פלואורסצנטיות בקו האלומה) או את הערכים התיאוטיים f' = -8.245 ו- f'' = 3.887. טען גם את קובץ ה-FASTA המכיל את רצף חומצות האמינו של החלבון המגובש.
   2. הגדר את מגבלת הרזולוציה לרזולוציה עם מתאם חריג (Anomal Corr) של כ-30% (נקבע ב-5.1.2), במקרה זה 2 Å ובחר באפשרות "מודל בנייה אוטומטית". באמצעות השלבים של שני אתרי האבץ שנמצאו על ידי Phenix HySS (חלק מצינור Phenix AutoSol) ניתן היה להסיק את השלבים עבור החלבון כולו ולבנות את המודל (על ידי Phenix RESOLVE) לצפיפות האלקטרונים. הדגם הטוב ביותר נקרא "overall_best.pdb".
3. בנייה, ליטוש ואימות מודלים
   1. בחר באפשרות "מודל בנייה אוטומטית" כדי לבנות את רוב מודל rPPEP-1 באופן אוטומטי. בדוק את צפיפות האלקטרונים ברמת קווי המתאר של 1.0 σ באמצעות התוכנית Coot (איור 6). זה צריך להיות מחבר ומקיף את האטומים של הדגם. באופן אידיאלי גם כמה מולקולות מים צריכות להיות מובנות במודל (ברזולוציה טובה יותר מ-2.5 Å). מים בתפזורת (רווח בין המולקולות) לא צריכים להכיל צפיפות.
   2. בדוק אם המודל כולו שלם (כל חומצות האמינו המובנות בצפיפות האלקטרונים). אם לא, בנה אותם באופן ידני באמצעות הכלים שמספק קוט. צמצם את המבנה על ידי הפעלת סבבים איטרטיביים של Phenix Refine עם 5 סבבי חידוד כל אחד באמצעות קובץ המודל overall_best.pdb, קובץ ההשתקפות peak_native.mtz וקובץ הרצף FASTA; ובניית מודלים ידניים בקוט.
   3. אמת את איכות המודל המבני עם הכלים המתאימים ב-Coot.

איור 6: מפת צפיפות אלקטרונים ניסיונית ומודל של rPPEP-1 לאחר ריצת Phoenix Autosol.צפיפות אלקטרונים בכחול ברמת מתאר של 1.0 σ מוצגת בתוכנית Coot. במפה ראשונית זו צפיפות האלקטרונים נפתרת יפה והמודל נבנה לתוך צפיפות האלקטרונים. הזום מראה את השאריות His142 ו-Glu189, כמו גם מולקולת מים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

6. קביעת מבנה לרזולוציה גבוהה באמצעות החלפה מולקולרית

הערה: על מנת לקבל מידע מבני ברזולוציה גבוהה על rPPEP-1 נאסף מערך נתונים מקורי. לאחר מכן נעשה שימוש בהליך החלפה מולקולרי באמצעות התוכנה Phaser^26,27 (בתוך חבילת התוכנה של Phenix) תוך שימוש במבנה שנקבע באמצעות אבץ-SAD כמודל. ניתן להשתמש בהליך זה גם מאוחר יותר בעת פתרון מבנים של rPPEP-1 מורכבים עם מולקולות קטנות.

1. כדי להשיג מבנה גבישי ברזולוציה גבוהה יותר (במקרה זה עד 1.4 Å) עבד את מערך הנתונים המקורי באמצעות התוכנה XDS (לחלופין iMosflm או HKL3000) בקבוצת החלל P2_{12 1}2₁ (קבוצת חלל 19). פרמטרי תא היחידה צריכים להיות בסביבות a, b, c (Å) = 43.17, 71.77, 117.80 ו- α=β=γ (°) = 90. זה נותן קובץ HKL אחד (קובץ השתקפות).
2. בדוק את הקובץ CORRECT. ל.פ. השתמש בנתונים עד לרזולוציה שבה CC_1/2 הוא לפחות 50%. המר את קובץ HKL לקובץ השתקפות בפורמט CCP4 (בשם, לדוגמה, native.mtz) באמצעות XDSCONV ליצירת תת-קבוצה_חופשית של R של 5%. בדוק את קובץ ה-mtz-עקביות עם התוכנית mtzdmp הבודקת את הפרמטרים של תא היחידה, קבוצת המרחב וקיומה של תת-הקבוצה_{החופשית} R (תווית FreeRflag).
3. הכן את קובץ ה-PDB המכיל את המודל מ-overall_best.pdb שנקבע קודם לכן והסר את כל מולקולות המים ואת כל הליגנדים (כלומר אטום האבץ). טען גם את קובץ ה-FASTA המכיל את רצף חומצות האמינו של החלבון המגובש. הפעל את Phaser ב-Phenix באמצעות קובץ ההשתקפות native.mtz. חפש שתי מולקולות ליחידה אסימטרית.
4. לאחר פתרון מבנה מוצלח (ציון TFZ גדול מ-8; כאן 10.2) בדוק את המודל (בשם native_phaser.1.pdb) ואת מפת צפיפות האלקטרונים ב-Coot. בנה ושכלל את המבנה על ידי הפעלת סבבים איטרטיביים של Phenix Refine עם 5 סבבי חידוד כל אחד באמצעות קובץ המודל native_phaser.1.pdb, קובץ ההשתקפות native.mtz וקובץ הרצף FASTA; ובניית מודלים ידניים בקוט.
5. אמת את איכות המודל המבני עם הכלים המתאימים ב-Coot.

Results

rPPEP-1 מתבטא יתר על המידה בכמה זני E. coli, עם התשואה הגבוהה ביותר ב-E. coli BL21 (DE3) Star (איור 1C). לאחר שלב הכרומטוגרפיה הראשון של זיקה של NiNTA ניתן לנתק בהצלחה את תג 6xHis, מרוב החלבון, ובשלב השני של NiNTA ניתן להפריד לחלוטין חלבון לא מעוכל מחלבון מעוכל תרומבין (איור 1D). בעמודה S200 16/600, rPPEP-1 לא מתויג נודד כמונומר עם חזית מזדמנת המתאימה ככל הנראה למין הדימרי (איור 2A). החלבון טהור (איור 2B...

Discussion

קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן היא עדיין השיטה המהירה והמדויקת ביותר לקביעת מבנים תלת מימדיים ברזולוציה כמעט אטומית של חלבונים²⁸. עם זאת, זה דורש צמיחה של גבישים בודדים מסודרים היטב. לעתים קרובות קשה להשיג אותם והמצב הגבישי הוא מלאכותי. עם זאת, השוואה של מבני חלבון שנקבעו על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן עם אלה שנקבעו בשיטות אחרות, במיוחד NMR, מראה בדרך כלל הסכמה טובה מאוד. במקרה של PPEP-1, מבנה NMR שפורסם לאחרונה²⁹ מראה התאמה מצוינת עם מבנה הגביש שלנו¹⁴, כולל הניידות של לולאת S.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<חזק>גנים / וקטורים / זני תאים
pET28a וקטור	Merck-Millipore	69864	תרומבין ניתנת לניתוק N-terminal His-tag
E. coli זן BL21 (DE3) Star	ThermoFisher Scientific	C601003	RNase H
גן מותאם לקודון חסר (עבור E. coli) של PPEP-1 (CD630_28300)	חומצות	מותאמות אישית	27-220
שם	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
תמצית שמרים	כל
טריפטון
אנטי קצף B	Sigma-Aldrich	A5757	תחליב סיליקון מימי
Agar	כל
Kanamycin	כל
IPTG	AppliChem	A1008
Tris-HCl	AppliChem	A1087	דרגת חיץ
NaCl	כל		מאגר
דרגת DNaseI	AppliChem	A3778
Imidazole	AppliChem	A1073	בדרגת חיץ
תרומבין	סיגמא-אולדריץ'	T4648
אמוניום פוספט דו-בסיסי	סיגמא-אולדריץ'	215996
גליצרול 100%	כל
נוזל בדרגה הטהורה ביותר חנקן	כל		לאחסון וקירור בהקפאה של גבישים
<חזק>שם	<חזק>חברה	><חזק>מספר קטלוגי	<חזק>הערות
><חזק>ציוד (כללי)
רועד	כל		טמפרטורות מספקת של 20 ° C - 37 ו-deg; C
כלי זכוכית	כל		צלוחיות Erlenmeyer מבולבלות (50 מ"ל - 2.8 ליטר)
צנטריפוגה לנפחי תרבית גדולים	כל		צנטריפוגה לנפחי עיבוד עד 12 ליטר
סוניקטור Vibra-Cell VCX500	Sonics	SO-VCX500	או כל סוניקטור / משבש תאים אחר
אולטרה צנטריפוגה	כל	צנטריפוגה המספקת מהירויות של עד 150,000 x g
שרף NiNTA Superflow	Qiagen
זכוכית ריקה Econo-Column	Bio-Rad	7371007	או כל עמודת זכוכית או פלסטיק ריקה אחרת
גודל אי הכללה עמודת כרומטוגרפיה HiLoad Superdex 200 16/600	GE Healthcare	28989335
מערכת כרומטוגרפיה Ä kta Purifier	GE Healthcare	28406264	או כל מערכת כרומטוגרפיה אחרת
צינורות דיאליזה Spectra/Por 3	Spectrum Labs	132724
סגירת צינורות דיאליזה Spectrum	Labs	132738
יחידות אולטרה-סינון (רכזים) 10,000 NWCO	כל
ספקטרופוטומטר
< חזק>שם	<חזק>חברה	<חזק>מספר קטלוגי	><חזק>הערות
<חזק>ציוד (קריסטלוגרפיה)
נמוך, פיפטה בנפח 0.1-10 ומיקרו; l	כל
פיפטה תזוזה חיובית Microman M10	Gilson	F148501
רובוט התגבשות	כל
לוחות התגבשות 96 בארות TTP IQ עם שלוש בארות חלבון	TTP	4150-05810	או כל צלחת התגבשות אחרת של 96 בארות
24 בארות CombiClover Junior Plate	Jena Bioscience	EB-CJR
סרט איטום קריסטל ברור	המפטון מחקר	HR3-511
שקופיות כיסוי זכוכית סיליקון Hampton	Research	HR3-225
מסכי התגבשות מסחריים: SaltRx, אינדקס, PEG/Ion, קריסטל	המפטון מחקר	מגוונים
: אשף, PACT++, JCSG++Jena	Bioscience	מגוון
JBS חרוזים לזרעים	Jena Bioscience	CO-501
CrystalCap SPINE HT (לולאות ניילון)	Hampton Research	מגוונים	0.025 מ"מ - 0.5 מ"מ
בקבוקון CrystalCap	Hampton Research	HR4-904
קצף קריוגני Dewar 800 מ"ל	Hampton Research	HR4-673
קצף קריוגני Dewar 2 L	Hampton Research	HR4-675
מהדק בקבוקון, ישר	Hampton Research	HR4-670
CrystalWand מגנטי, Straight	Hampton Research	HR4-729
CryoCane 6 מחזיק בקבוקון	Hampton Research	HR4-711
CryoSleeve	Hampton Research	HR4-708
CryoCane קודן צבע - White	Hampton Research	HR4-713
אזמל	כל
מיקרו-מלקחיים ישרים	כל		למניפולציה של סרט איטום. etc.
מחט דיקור סיני	any		e. מבית מרקחת
מיקרוסקופ סטריאו	כל		לבדיקת לוחות התגבשות והרכבה גבישית, הגדלה עד פי 160