במאמר זה, אנו מדווחים על פרוטוקול המתאר שיטה in vivo למדידת חוסר יציבות דינמית של מיקרו-צינורות בתאי סרטן שד עמידים לדוסטקסל (MCF-7TXT). בשיטה זו משתמשים במערכת הדמיה של מיקרוסקופיה דה-קונבולוציה כדי לזהות את הביטוי של GFP-tubulin בתאי מטרה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמיה חיה לחקר חוסר יציבות microtubule דינמי סרטן השד עמיד taxane
במאמר זה
סיכום
תקציר
טקסאנים כגון דוסטקסל שייכים לקבוצה של חומרים מכווני מיקרו-צינוריות (MTAs) שבדרך כלל מסתמכים עליהם לטיפול בסרטן. עם זאת, עמידות לטקסאן בתאים סרטניים מפחיתה באופן דרסטי את יעילות השימוש ארוך הטווח בתרופות. עדויות מצטברות מצביעות על כך שהמנגנונים העומדים בבסיס עמידות לטקסאן כוללים הן מנגנונים כלליים, כגון התפתחות עמידות לתרופות מרובות עקב ביטוי יתר של חלבוני פליטת תרופות, והן מנגנונים ספציפיים לטקסן, כגון אלה הכוללים דינמיקה של מיקרו-צינורות.
מכיוון שטקסנים מכוונים למיקרו-צינורות תאים, מדידת חוסר יציבות דינמית של מיקרו-צינורות היא צעד חשוב בקביעת מנגנוני העמידות לטקסנים ומספקת תובנה כיצד להתגבר על עמידות זו. בניסוי נעשה שימוש בשיטת in vivo למדידת אי יציבות דינמית של מיקרו-צינורות. α-טובולין מתויג GFP בא לידי ביטוי ושולב במיקרו-צינורות בתאי MCF-7, מה שמאפשר הקלטה של דינמיקת המיקרו-צינורות על ידי קיטועי זמן באמצעות מצלמה רגישה. התוצאות הראו כי בניגוד לתאי MCF-7CC ההורים שאינם עמידים, הדינמיקה המיקרו-צינורית של תאי MCF-7TXT עמידים לדוסטקסל אינה רגישה לטיפול בדוסטקסל, מה שגורם לעמידות למעצר מיטוטי ואפופטוזיס המושרה על ידי דוסטקסל. מאמר זה יתאר את שיטת in vivo למדידת אי יציבות דינמית של מיקרו-צינורות.
מבוא
הגורם המוביל לתמותה מסרטן השד הוא באמצעות גרורות 1, 2. Taxanes, כגון docetaxel ו- paclitaxel, משמש כיום כקו ראשון משטר לטיפול בסרטן השד גרורתי 2, 3, 4, 5, 6. הם חלק מהקבוצה של סוכני מיקוד-microtubule (MTAs) משבשי דינמיקת microtubule. עם זאת, אחד האתגרים הגדולים ביותר באמצעות taxanes בטיפול מרפא הוא הפיתוח של התנגדות taxane בתאים סרטניים, אשר מובילה למחלות ישנות 7. עמידות לתרופות ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת תאים עבור הדמיה חיה
- תרבות זריעת תאים
- השתמש תאי סרטן השד MCF-7 נבחרו להתנגדות docetaxel (MCF-7 TXT) וקו תא ההורים שאינם העמיד שלהם (CC MCF-7). תהליך הבחירה מפורט לאפיון שורות תאים שנבחרו אלה תוארו בעבר 24.
- לגדול כל תאים בצלחות תרבות 10 ס"מ על 37 מעלות צלזיוס במדיום מורכב 90% של המדיום של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) ו -10% בסרום שור ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות הפרוטוקול המובא כאן, חקרנו את ההשפעות של docetaxel על הדינמיקה microtubule של הנורמה (CC MCF-7) ו- docetaxel עמיד (MCF-7 TXT) תאי סרטן השד. שני סטים של תמונות להראות את ההשפעות של docetaxel (0.5 מיקרומטר) על צמיחה microtubule וקיצור ב CC MCF-7 ו MCF-7 תאים TXT (איור 1 א).
אנחנו גם.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ישנן שתי שיטות עיקריות למדידת חוסר יציבות microtubule דינמי: במבחנה in vivo. בשיטה במבחנה, טובולין מטוהר משמש למדידת חוסר יציבות microtubule דינמית עם מיקרוסקופיה מחשב משופר זמן לשגות הפרש התערבות ניגודיות. בשיטת in vivo, microinjected טובולין ניאון, או הביע GFP-טובולין, הוא שולב microtubules. הדינמיקה (צמיחה וקיצור) של microtubules נרשמת לאחר מכן על ידי זמן לשגות באמצעות מצלמה רגישה באזור הפריפריה של תאים שלב 10,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי מימון מ-CBCF (ל-ZW).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| חומצות אמינו לא חיוניות | Life Technologies, Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Gibco, Invitrogen | 12483 | |
| Anti-Anti (100x) | Life Technologies, Invitrogen | 15240-062 | |
| docetaxel | Sigma-Aldrich | 01885-5mg-F | |
| DMEM פנול ללא אדום | Gibco, Invitrogen | 21063 | |
| CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin | ThermoFisher Scientific | C10613 | מגיב מפתח לביטוי GFP tubulin בתאים |
| מגיב CellLight *BacMam 2.0* GFP | ThermoFisher Scientific | B10383 | בקרת |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | סיגמא-אולדריץ'+B9:AA9 | 472301 | להסרת decetaxel |
| 22 מ"מ זכוכית coveslip | Fisher Scientifics | 12-545-101 | |
| צלחת תרבית 6 בארות | Greiner Bio-One International | 6 Well Celi Culture Plate | |
| DeltaVision Microscopy Imaging Systems | GE Health | מערכת זו מצוידת בתחנת מזג אוויר לבקרת טמפרטורה ו-CO2. הוא מצויד גם בתוכנת Worx לדה-קונבולוציה ובקרת זמן-lapse. | |
| טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדום | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| סט המציטומטר בקו בהיר, Hausser Scientific | Hausser Scientific, מופץ על ידי VWR | מס' ספק: 1492 VWR מס': 15170-172 |
מקורות
- Kamangar, F., Dores, G. M., Anderson, W. F. Patterns of cancer incidence, mortality, and prevalence across five continents: defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world. J Clin Oncol. 24 (14), 2137-2150 (2006).
- Yardley, D. A.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
