הדמיה חיה לחקר חוסר יציבות microtubule דינמי סרטן השד עמיד taxane

Summary

במאמר זה, אנו מדווחים על פרוטוקול המתאר שיטה in vivo למדידת חוסר יציבות דינמית של מיקרו-צינורות בתאי סרטן שד עמידים לדוסטקסל (MCF-7_TXT). בשיטה זו משתמשים במערכת הדמיה של מיקרוסקופיה דה-קונבולוציה כדי לזהות את הביטוי של GFP-tubulin בתאי מטרה.

Abstract

טקסאנים כגון דוסטקסל שייכים לקבוצה של חומרים מכווני מיקרו-צינוריות (MTAs) שבדרך כלל מסתמכים עליהם לטיפול בסרטן. עם זאת, עמידות לטקסאן בתאים סרטניים מפחיתה באופן דרסטי את יעילות השימוש ארוך הטווח בתרופות. עדויות מצטברות מצביעות על כך שהמנגנונים העומדים בבסיס עמידות לטקסאן כוללים הן מנגנונים כלליים, כגון התפתחות עמידות לתרופות מרובות עקב ביטוי יתר של חלבוני פליטת תרופות, והן מנגנונים ספציפיים לטקסן, כגון אלה הכוללים דינמיקה של מיקרו-צינורות.

מכיוון שטקסנים מכוונים למיקרו-צינורות תאים, מדידת חוסר יציבות דינמית של מיקרו-צינורות היא צעד חשוב בקביעת מנגנוני העמידות לטקסנים ומספקת תובנה כיצד להתגבר על עמידות זו. בניסוי נעשה שימוש בשיטת in vivo למדידת אי יציבות דינמית של מיקרו-צינורות. α-טובולין מתויג GFP בא לידי ביטוי ושולב במיקרו-צינורות בתאי MCF-7, מה שמאפשר הקלטה של דינמיקת המיקרו-צינורות על ידי קיטועי זמן באמצעות מצלמה רגישה. התוצאות הראו כי בניגוד לתאי MCF-7_CC ההורים שאינם עמידים, הדינמיקה המיקרו-צינורית של תאי MCF-7_TXT עמידים לדוסטקסל אינה רגישה לטיפול בדוסטקסל, מה שגורם לעמידות למעצר מיטוטי ואפופטוזיס המושרה על ידי דוסטקסל. מאמר זה יתאר את שיטת in vivo למדידת אי יציבות דינמית של מיקרו-צינורות.

Introduction

הגורם המוביל לתמותה מסרטן השד הוא באמצעות גרורות ^{1, 2.} Taxanes, כגון docetaxel ו- paclitaxel, משמש כיום כקו ראשון משטר לטיפול בסרטן השד גרורתי ^{2, 3, 4, 5, 6.} הם חלק מהקבוצה של סוכני מיקוד-microtubule (MTAs) משבשי דינמיקת microtubule. עם זאת, אחד האתגרים הגדולים ביותר באמצעות taxanes בטיפול מרפא הוא הפיתוח של התנגדות taxane בתאים סרטניים, אשר מובילה למחלות ישנות ^7. עמידות לתרופות ....

Protocol

1. הכנת תאים עבור הדמיה חיה

1. תרבות זריעת תאים
   1. השתמש תאי סרטן השד MCF-7 נבחרו להתנגדות docetaxel (MCF-7 _TXT) וקו תא ההורים שאינם העמיד שלהם _(CC MCF-7). תהליך הבחירה מפורט לאפיון שורות תאים שנבחרו אלה תוארו בעבר ^24.
   2. לגדול כל תאים בצלחות תרבות 10 ס"מ על 37 מעלות צלזיוס במדיום מורכב 90% של המדיום של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) ו -10% בסרום שור ....

Results

באמצעות הפרוטוקול המובא כאן, חקרנו את ההשפעות של docetaxel על הדינמיקה microtubule של הנורמה _(CC MCF-7) ו- docetaxel עמיד (MCF-7 _TXT) תאי סרטן השד. שני סטים של תמונות להראות את ההשפעות של docetaxel (0.5 מיקרומטר) על צמיחה microtubule וקיצור ב _CC MCF-7 ו MCF-7 תאים _TXT (איור 1 א).

אנחנו גם.......

Discussion

ישנן שתי שיטות עיקריות למדידת חוסר יציבות microtubule דינמי: במבחנה in vivo. בשיטה במבחנה, טובולין מטוהר משמש למדידת חוסר יציבות microtubule דינמית עם מיקרוסקופיה מחשב משופר זמן לשגות הפרש התערבות ניגודיות. בשיטת in vivo, microinjected טובולין ניאון, או הביע GFP-טובולין, הוא שולב microtubules. הדינמיקה (צמיחה וקיצור) של microtubules נרשמת לאחר מכן על ידי זמן לשגות באמצעות מצלמה רגישה באזור הפריפריה של תאים שלב ^10,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796
חומצות אמינו לא חיוניות	Life Technologies, Invitrogen	11140-050
FBS	Gibco, Invitrogen	12483
Anti-Anti (100x)	Life Technologies, Invitrogen	15240-062
docetaxel	Sigma-Aldrich	01885-5mg-F
DMEM פנול ללא אדום	Gibco, Invitrogen	21063
CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin	ThermoFisher Scientific	C10613	מגיב מפתח לביטוי GFP tubulin בתאים
מגיב CellLight *BacMam 2.0* GFP	ThermoFisher Scientific	B10383	בקרת
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	סיגמא-אולדריץ'+B9:AA9	472301	להסרת decetaxel
22 מ"מ זכוכית coveslip	Fisher Scientifics	12-545-101
צלחת תרבית 6 בארות	Greiner Bio-One International	6 Well Celi Culture Plate
DeltaVision Microscopy Imaging Systems	GE Health		מערכת זו מצוידת בתחנת מזג אוויר לבקרת טמפרטורה ו-CO2. הוא מצויד גם בתוכנת Worx לדה-קונבולוציה ובקרת זמן-lapse.
טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדום	ThermoFisher Scientific	25200056
סט המציטומטר בקו בהיר, Hausser Scientific	Hausser Scientific, מופץ על ידי VWR	מס' ספק: 1492 VWR מס': 15170-172