הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הקמת תאי tetraploid Proliferative מ Nontransformed אדם פיברובלסטים

6.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55028

⸱

8 בינואר 2017

 , 
1Division of Morphological Science, Biomedical Research Center, Saitama Medical University, 2Department of Pathology, International Medical Center, Saitama Medical University

במאמר זה

סיכום

למרות שתאים פוליפלואידים מתרבים נחוצים לניתוח חוסר יציבות כרומוזומלית של תאים פוליפלואידים, יצירת תאים כאלה מתאים אנושיים שלא עברו טרנספורמציה אינה קלה. הדו"ח הנוכחי מתאר הליכים פשוטים יחסית להקמת תאים טטרפלואידים מתרבים ללא אוכלוסייה דיפלואידית מפיברובלסטים אנושיים רגילים.

תקציר

תאים פוליפלואידים (בעיקר טטרפלואידים) נצפים לעתים קרובות בנגעים פרה-ניאופלסטיים של רקמות אנושיות וחוסר היציבות הכרומוזומלית שלהם נחשב כאחראי לסרטן ברקמות כאלה. למרות שתאים פוליפלואידים מתרבים נדרשים לניתוח אי יציבות כרומוזומלית של תאים פוליפלואידים, יצירת תאים כאלה מתאים אנושיים שלא עברו טרנספורמציה היא מאתגרת למדי. אינדוקציה של טטרפלואידים על ידי חומרים כימיים מביאה בדרך כלל לתערובת של אוכלוסיות דיפלואידיות וטטרפלואידיות, ורוב המחקרים השתמשו במיון או שיבוט תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה על ידי הגבלת דילול כדי להפריד בין תאים טטרפלואידים לתאים דיפלואידים. עם זאת, הליכים אלה גוזלים זמן ומייגעים. הדו"ח הנוכחי מתאר פרוטוקול פשוט יחסית לגרימת תאים טטרפלואידים מתרבים מפיברובלסטים אנושיים רגילים עם זיהום מינימלי על ידי תאים דיפלואידים. בקצרה, הפרוטוקול מורכב מהשלבים הבאים: עצירת תאים במיטוזה על ידי דמקולצין (DC), איסוף תאים מיטוטיים לאחר ניעור, דגירה של תאים שנאספו עם DC למשך 3 ימים נוספים, ודגירת תאים בתווך נטול תרופות (הם מחדשים את התפשטותם כתאים טטרפלואידים תוך מספר ימים). בהתאם לסוג התא, ניתן להשמיט את אוסף התאים המיטוטיים על ידי ניעור. פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה ומעשית להקמת תאים טטרפלואידים מתרבים מפיברובלסטים אנושיים רגילים. תאים טטרפלואידים שהוקמו בשיטה זו יכולים להוות מודל שימושי לחקר חוסר יציבות הכרומוזומים והפוטנציאל האונקוגני של תאים אנושיים פוליפלואידים.

מבוא

Polyploidy נצפתה לא רק ברקמות מקצועיות של מינים יונקים אלא גם במגוון של מצבים פתולוגיים, כגון סרטן ומחלות ניווניות. תאים polyploid (בעיקר tetraploid) הם נצפו לעתים קרובות בנגעים preneoplastic של רקמות אנושיות, כגון נגעים intraepithelial 1,2 או קשקש ושט בארט של 3,4 צוואר הרחם, ואת כבר נחשב כמקור לתאי aneuploid ממאיר ברקמות אלו 5 , 6. למרות זאת הוא הציע מרה של tetraploid לתאי aneuploid יכולה להיות אירוע מכריע בשלבים המוקדמים של tumorigenesis, המנגנונים המעורבים בתהליך זה אינם מובנים במלואם. זה גם בגלל שאין מודל במבחנה כבר זמין שבו תאים אנושיים polyploid nontransformed יכול להפיץ.

ישנם חוקרי מושרה tetraploidy בתאי אפיתל אדם nontransformed באמצעות דור של תאי binucleated ידי Inhibiting cytokinesis 7-9. בשיטה זו, לעומת זאת, תאים דיפלואידי מיותר חייבים להתבטל על ידי מיון תא מופעל פלואורסצנטי (FACS) 7,8 או שיבוט על ידי הגבלת דילול 9. בגלל הליכים אלה הם מייגע ולא קלים לביצוע, שיטות פשוטות יותר להקים תאי tetraploid nontransformed הם רצויים עבור מחקר בתחום זה.

בדו"ח הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול להקים תאי tetraploid שגשוג מן fibroblasts אדם נורמלי או פיברובלסטים אדם הנציח טלומרז ידי נהלים פשוטים יחסית. הנהלים להשתמש demecolcine רעל כישור (DC) לעצור תאי דיפלואידי ב מיטוזה, ותאי mitotic שנאספו על ידי מנערים מטופלים נוספים עם DC. תאי mitotic דיפלואידי שטופלו DC עבור זמן ממושך להמיר תאי G1 tetraploid, ותאים אלה להתרבות תאי tetraploid כמו לאחר מעצרו צמיחה במשך כמה ימים לאחר הסרת תרופה. פרוטוקול זה מספקשיטה יעילה ליצירת מודל שימושי כדי לחקור את הקשר בין אי יציבות כרומוזום והפוטנציאל בשעור של תאים אנושיים polyploid.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תרבית תאים

  1. להשיג את התאים כדי לגרום tetraploidy. נכון להיום זה כבר אישר כי טכניקה זו יכולה להיות מיושם על שורות תאים פיברובלסטים האדם TIG-1, ב"ג, IMR-90 ו טלומרז-הנציח TIG-1 (TIG-HT).
  2. לגדל תאים בינוניים מינימום הכרחי עם שינוי α או בכל מדיום תרבית תאים אחר מתאים לסוג התא להיחקר בתוספת 10% (v / v) בסרום שור עובר חום מומת (FBS) על ידי דוגרי 5% (v / v) CO 2 אווירה על 37 מעלות צלזיוס. תאים מעבר כל 3 או 4 ימים לא יעלו על צפיפות subconfluent.
    הערה: רמת הכפלת אוכלוסייה (PDL) יש לחשב כל פעם passaging להעריך צמיחת תאים וגיל התא. PDL ניתן לחשב את מספר הסלולרי זורעים לתוך צלחת (N1) ואת מספר הסלולרי שנקטפו על passaging הבא (N2) באמצעות הנוסחה הבאה (X הוא PDL הראשוני). PDL = X + (יומן N1 - יומן N2) / log 2

2. אינדוקציה אסטהblishment של תאים tetraploid מ דיפלואידי פיברובלסטים

  1. להשרות tetraploidy ללא פעמי לרעוד.
    הערה: זני תא מסוימים (למשל ב TIG-1) יכולה להיות כמעט לחלוטין tetraploid ידי טיפול רציף עם demecolcine (DC) כדלקמן.
    1. תאי המעבר לתוך צלחות 100 מ"מ אחד או שניים ביום לפני הטיפול כדי לגרום tetraploidy. בדרך כלל, להכין 5 x 10 5 כדי 1 x 10 6 תאים לכל צלחת לזירוז של תאים tetraploid.
    2. פנק את התאים גדלו באופן אקספוננציאלי עם מדיום המכיל 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר DC במשך 4 ימים.
    3. החלף DC-המכיל בינוני עם בינוני נקי מסמים דגירה תאים באווירה 5% (v / v) CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. תאים בדרך כלל לחדש התפשטות בתוך 1 בשבוע.
  2. להשרות tetraploidy עם פעמי לרעוד.
    הערה: רוב התאים להיות תערובת של אוכלוסיות דיפלואידי ו tetraploid כתוצאה של טיפול פשוט עם DC שתוארו לעיל (2.1). לכן, כמה שינויים של procedure לחסל אוכלוסייה דיפלואידי נחוצה כדלקמן (איור 1).
    1. תאי מעבר לכמה T75 צלוחיות יום לפני הטיפול כדי לגרום tetraploidy. בדרך כלל, להכין לפחות 5 x 10 6 תאים (1 x 10 6 תאים לכל בקבוק) לזירוז של תאים tetraploid.
    2. פנק את התאים גדלו באופן אקספוננציאלי עם מדיום המכיל 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר DC עבור 16 - 18 שעות כדי לעצור תאי מיטוזה. כמה הזמן נדרש לעצור תאי מיטוזה יכול להיות תלוי בתאי יעד צריך להיקבע על ידי ניסויים ראשוניים להשיג כמה שיותר תאי mitotic ככל האפשר. לדוגמא, תאים גדלו לאט ומחייבים DC במשך זמן ארוך יותר מאשר תאים גדלו מהר.
      הערה: אם תאי מטופלים במשך זמן רב מדי בשלב זה, הם עלולים לעבור חלקת mitotic ו לדבוק פני הצלחת, כך שלא ניתן לאסוף תאי mitotic בשל רעידה פעמית בשלב הבא.
    3. איסוף תאים mitotic נעצר DC בשיטת שייק פעמי, ב ש"שich רופף דבקה התאים mitotic נאספים על ידי רעד עדין של צלוחיות ושטיפה עם המדיום ואחריו צנטריפוגה (300 XG, 5 דק '). ספירת מספר סלולארי על ידי שיטה מתאימה בשלב זה.
    4. Reseed התאים mitotic שנאספו לתוך הכלים תרבות 60 מ"מ לטפל בתאים עם 0.1 מיקרוגרם / מ"ל ​​DC עבור 3 ימים נוספים. זרעים יותר מ 1 x 10 6 תאים mitotic לכל צלחת, כי פחות מ -10% של התאים יכולים לשרוד את הטיפול הזה.
    5. חלף DC-המכיל בינוני עם בינוני נקי מסמים ולחכות תאים לחדש התפשטות, אשר מתרחשת בדרך כלל בתוך 1 בשבוע.
  3. תאי מעבר דומה לתאי דיפלואידי מקוריים.

בחינת 3. DNA ploidy

הערה: זהו הליך ומבוסס מדריך טכני יש להפנות עבור נהלים מפורטים ועצות טכניות.

  1. קציר תאים (5 x 10 5 - 1 x 10 6) על ידי תאים דוגרים עם קון פתרון0.05% taining טריפסין 0.02% EDTA במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ולנטרל טריפסין על ידי בינוני המכיל 10% FBS.
  2. צנטריפוגה התאים בינוני לשטוף אותם על ידי resuspending ב 5 מ"ל של תמיסת מלח שנאגרו פוספט (PBS) ואחריו צנטריפוגה (300 XG, 5 דק ').
  3. כן תאים לניתוח ה- DNA על ידי אחד משתי השיטות הבאות
    1. שיטה לניתוח תאים מבולבלים 10
      הערה: שיטה זו יכולה להתבצע באמצעות ערכה זמינה מסחרי עבור ניתוח מחזור התא. דוגמאות שהוכנו בשיטה זו יש לנתח מיד, כי התאים אינם קבועים בהליך ומוכתמת גרעינים חשוף לנזק לאורך זמן.
      1. שטפו תאים עם חיץ ציטראט 40 מ"מ המכיל סוכרוז 250 מ"מ. בהמשך לטיפול בתאים עם 250 μL של 0.1% (v / v) P40 Nonidet ו -30 מיקרוגרם / מ"ל ​​טריפסין ב 200 μL של חיץ ציטראט 40 מ"מ המכיל 250 סוכרוז מ"מ במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
      2. הוספת 200 μL של 0.5 מיקרוגרם / Inh טריפסין מ"לibitor ו -0.1 מיקרוגרם / מ"ל ​​RNase א '40 מ"מ חיץ ציטראט המכילים סוכרוז 250 מ"מ, ו דגירה התאים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
      3. הוספת 200 μL של 0.4 מ"ג / מ"ל ​​יודיד propidium (PI) במאגר ציטראט 40mm המכיל סוכרוז 250 מ"מ, ו דגירה התאים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר להכתים גרעין התא.
    2. שיטה לניתוח תאים קבועים
      1. תקן תאים עם 80% אתנול על ידי השעיית התאים 1 מ"ל של PBS, הוספת 4 מ"ל של dropwise 100% EtOH תוך ערבוב ההשעיה תא ולהשאיר אותו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. תאים מקבעים זה יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות.
      2. שטפו תאים על ידי resuspending אותם 5 מ"ל של PBS ואחריו צנטריפוגה (300 XG, 5 דק '). פנקו את התאים עם 0.5 מ"ג / מ"ל ​​RNase A ו- להכתים אותם עם 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​יודיד propidium (PI) (475 μL של 0.5 מ"ג / מ"ל ​​RNase A ו- 25 μL של 1 מ"ג / מ"ל ​​PI) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. לנתח את תוכן ה- DNA של tהוא התאים באמצעות cytometer זרימה עם לייזר 488 ננומטר מסנן פליטה במסלול האדום (ארוכה לעבור> 610 ננומטר). לנתח מדגם התייחסות מוכן מתאי דיפלואידי אמיתי בעת ובעונה אחת כדי להעריך ploidy של התאים היעד.
    1. לחלופין, להוסיף חרוזים תקן הקרינה להעריך את יחס עוצמת הקרינה של תאים דיפלואידי מול חרוזים. השתמש 'גובה הדופק לעומת רוחב דופק' אפשרות של זרימת cytometer להפלות בין תאים tetraploid יחיד גושים של תאים דיפלואידי 11.

בחינת 4. רוזני כרומוזום וניתוח קריוטיפ

הערה: כל אלה הם הליכים ומבוססים מדריך טכני או הפרוטוקולים של היצרן יש להפנות עבור נהלים מפורטים ועצות טכניות.

  1. פנקו את התאים גדל באופן אקספוננציאלי עם 0.1 מיקרוגרם / מ"ל ​​DC עבור 4 שעות לעצור תאים metaphase.
  2. כן שקופיות כרומוזום.
    1. קציר תאים (לפחות 5 x 10 5 תאים) על ידי trypsinization ו להשעות במדיום המכיל FBS.
    2. צנטריפוגה תאים במדיום (300 XG, 5 דק ') ולטפל עם פתרון hypotonic (5 מ"ל של 0.075 KCl M) על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    3. תיקון ו להשעות תאים המקבעים של Carnoy (מתנול: חומצה אצטית = 3: 1).
    4. מורחים תאים על גבי זכוכית נושאת על ידי הטלת בנפח קטן (25 - 35 μL) של ההשעיה תא. צעדים נוספים כמו חשיפת אדים חמים עשויים להיות נחוצים כדי לשפר את כרומוזום מתפשטים.
  3. כתם תאים עבור ספירת כרומוזום או ניתוח קריוטיפ או קרינת ססגוניות הכלאה באתרו (mFISH).
    1. ספירת כרומוזום.
      1. הכתם התאים עם 5% Giemsa פתרון (או 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​לצרכן המכיל 0.5 מ"ג / A מ"ל RNase עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי) במשך 15 - 20 דקות.
      2. דיגיטלי לצלם לפחות 50 תאי metaphase.
      3. ספירת מספר כרומוזום לכל תא באמצעות Softwa ניתוח תמונהמחדש לאחר הפרדה ידנית של נגיעת חופפים הכרומוזומים באמצעות תוכנה לעריכת תמונות. למרות מספר כרומוזום יכול להיות בקיע באופן ידני, בקיע ממוחשב מומלץ.
    2. ניתוח קריוטיפ
      הערה: ניתוח זה צריך להתבצע על ידי טכנאי מיומן או חברה מקצועית.
      1. תאים כתמים על פי טכניקת G-banding תקן 12.
      2. לנתח הכרומוזומים לעשות karyograms תקן 12.
    3. mFISH
      הערה: שלב זה הוא אופציונלי צריך להתבצע במידת הצורך.
      1. תאי כתם באמצעות בדיקות FISH ססגוניות עבור כרומוזומים אנושיים על פי הפרוטוקול של היצרן 13.
      2. לנתח הכרומוזומים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסננים מתאימים תוכנה לניתוח mFISH 13.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מניסיוננו, תאים TIG-1 יכול להתבצע כמעט tetraploid לחלוטין על ידי טיפול רציף פשוט עם 0.1 מיקרוגרם / מ"ל DC במשך 4 ימים (איור 2 א). לעומת זאת, זנים פיברובלסטים אחרים, כגון ב"ג או IMR-90, ותאי TIG-HT, הפכו תערובת של דיפלואידי ואוכלוסיות tetraploid הבאים אותו הטיפול, ובידוד של תאי mitotic בשיטה שייק פעמי יש צורך במהלך טיפול DC (בדרך כלל 16 - 18 שעות לאחר תחילת הטיפול) (2B הדמוי, C). לאחר טיפול נוסף עם DC במשך...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אחת הבעיות העיקריות אינדוקציה של tetraploidy מתאי דיפלואידי ידי חומרים כימיים, בין אם על ידי מעכבי cytokinesis או על ידי מעכבי ציר, הוא שתאי הופכים לרוב תערובת של אוכלוסיות דיפלואידי ו tetraploid, ותאי tetraploid יש להפריד בין תאי דיפלואידי. רוב הגישות הנפוצות לבידוד תרמי של אוכלוסייה tetraploid ללא תאים דיפלואידי להשתמש FACS או שיבוט על ידי הגבלת דילול. עם זאת, נהלים אלה הם מייגע ולא קלים לביצוע. בדו"ח זה, אנו מציגים פרוטוקול חדש להקים תאים tetraploid שגשוג ללא אוכלוסייה דיפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרס כלכלי מתחרים.

תודות

אנו מודים לגברת מטסומוטו על הסיוע הטכני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
MEM-ואלפא;Sigma-AldrichM8042-500ML
Trypsin-EDTASigma-AldrichT4174
FBSSigma-Aldrich172012-500ML
תמיסת דמקולצין (10 μ g/mL in HBSS)Sigma-AldrichD1925-10ML
BD CycleTES Plus DNA Reagent ערכות BDBiosciences#340242לבדיקת פלואידיה של DNA על ידי זרימה ציטומטריית
כרומוזום אנושי רב צבעוני FISH בדיקה 24XCyteMetaSystems#D-0125-060-DIיש צורך בערכת מסננים מיוחדת ותוכנה לניתוח mFISH
מערכת הדמיה של Isis עם תוכנת mFISH יש צורך בערכת בדיקה מיוחדתMetaSystems
של

מקורות

  1. Rabinovitch, P., et al. Predictors of progression in Barrett's esophagus III: baseline flow cytometric variables. Am. J. Gastroenterol. 96 (11), 3071-3083 (2001).
  2. Galipeau, P., et al. NSAIDs modulate CDKN2A, TP53, and DNA content risk for progression to esophageal adenocarcinoma. PLoS Med. 4 (2), e67(2007).
  3. Olaharski, A., et al. Tetraploidy and chromosomal instability are early events during cervical carcinogenesis. Carcinogenesis. 27, 337-343 (2006).
  4. Liu, Y., et al. p53-independent abrogation of a postmitotic checkpoint contributes to human papillomavirus E6-induced polyploidy. Cancer Res. 67, 2603-2610 (2007).
  5. Davoli, T., de Lange, T. The causes and consequences of polyploidy in normal development and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).
  6. Fox, D., Duronio, R. Endoreplication and polyploidy: insights into development and disease. Development. 140, 3-12 (2013).
  7. Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437, 1043-1047 (2005).
  8. Ganem, N., et al. Cytokinesis failure triggers hippo tumor suppressor pathway activation. Cell. 158 (4), 833-848 (2014).
  9. Kuznetsova, A., et al. Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells. Cell cycle. 14 (17), 2810-2820 (2015).
  10. Vindeløv, L., Christensen, I. Detergent and proteolytic enzyme-based techniques for nuclear isolation and DNA content analysis. Methods Cell Biol. 41, 219-229 (1994).
  11. Darzynkiewicz, Z., Juan, G. DNA content measurement for DNA ploidy and cell cycle analysis. Curr Protoc Cytom. , Chapter 7: Unit 7.5(2001).
  12. Knutsen, T., Bixenman, H., Lawce, H., Martin, P. Chromosome analysis guidelines preliminary report. Cancer Genet Cytogenet. 52 (1), 11-17 (1991).
  13. Liehr, T., et al. Multicolor FISH probe sets and their applications. Histol. Histopathol. 19 (1), 229-237 (2004).
  14. Ohshima, S., Seyama, A. Formation of bipolar spindles with two centrosomes in tetraploid cells established from normal human fibroblasts. Hum. Cell. 25 (3), 78-85 (2012).
  15. Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Front. Oncol. 3, 198(2013).
  16. Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from telomerase-immortalized normal human fibroblasts. Genes, Chromosome Cancer. 55 (6), 522-530 (2016).
  17. Di Leonardo, A., et al. DNA rereplication in the presence of mitotic spindle inhibitors in human and mouse fibroblasts lacking either p53 or pRb function. Cancer Res. 57, 1013-1019 (1997).
  18. Andreassen, P., Lohez, O., Lacroix, F., Margolis, R. Tetraploid state induces p53-dependent arrest of nontransformed mammalian cells in G1. Mol. Biol. Cell. 12, 1315-1328 (2001).
  19. Vogel, C., et al. Crosstalk of the mitotic spindle assembly checkpoint with p53 to prevent polyploidy. Oncogene. 23, 6845-6853 (2004).
  20. Aylon, Y., Oren, M. p53: Guardian of ploidy. Mol. Oncol. 5 (4), 315-323 (2011).
  21. Uetake, Y., Sluder, G. Cell cycle progression after cleavage failure : mammalian somatic cells do not possess a "tetraploidy checkpoint". J. Cell Biol. 165, 609-615 (2004).
  22. Ganem, N., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131, 437-440 (2007).
  23. Ho, C., Hau, P., Marxer, M., Poon, R. The requirement of p53 for maintaining chromosomal stability during tetraploidization. Oncotarget. 1 (7), 583-595 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Shake offDNA
הקמת תאי tetraploid Proliferative מ Nontransformed אדם פיברובלסטים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.