פרוטוקול זה מספק שיטה לאיסוף תאי גזע עוברי בעכבר (המסקלין) בינוני -conditioned (המסקלין-CM) נגזר סרום (נסיוב שור עוברי, FBS) - ומזין (פיברובלסטים עובריים בעכבר, MEFs) תנאים -חינם עבור תא גישת -חינם. זה עשוי להיות רלוונטי לטיפול הזדקנות ומחלות הקשורות להזדקנות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
אוסף של Serum- ומזין ללא עכבר גזע עובריים בינוני מותנה-Cell לגישה Cell-חינם
במאמר זה
סיכום
תקציר
היכולת של תאי גזע עובריים (ESCs) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) לייצר סוגי תאים שונים פתחה אפיקים חדשים בתחום הרפואה הרגנרטיבית. עם זאת, למרות היתרונות שלהם, הפוטנציאל הגידולי של תאי גזע גזעיים ו-iPSCs מהווה מזה זמן רב מחסום ליישומים קליניים. מעניין לציין כי הוכח כי תאי גזע גזעיים מייצרים מספר גורמים מסיסים שיכולים לקדם התחדשות רקמות ולעכב את הזדקנות התאים, מה שמצביע על כך שניתן להשתמש ב-ESCs ו-iPSCs גם כשיטת התערבות נטולת תאים. לכן, השיטה לקצירת מדיום מותנה של תאי גזע עובריים של עכברים (mESC) (mESC-CM) עם זיהום מינימלי של רכיבי סרום (סרום בקר עוברי, FBS) ותאי הזנה (פיברובלסטים עובריים של עכברים, MEFs) הייתה מבוקשת מאוד. כאן, המחקר הנוכחי מדגים שיטה אופטימלית לאיסוף mESC-CM בתנאים נטולי סרום ומזין ולאפיון mESC-CM באמצעות קריאות מרובות הקשורות להזדקנות. פרוטוקול זה יספק שיטה לאיסוף גורמי הפרשה טהורים ספציפיים ל-mESC ללא זיהום בסרום ובמזין.
מבוא
מטרת פרוטוקול זה היא לאסוף עכבר בתאי גזע עובריים (המסקלין) בינוני -conditioned (המסקלין-CM) מן התנאים תרבות serum- ומזין ללא ולאפיין תפקודים ביולוגיים שלה.
באופן כללי, תאי גזע עובריים (ESCs) יש פוטנציאל גדול עבור רפואה רגנרטיבית וטיפול התא עקב מגוונת" ויכולתן עבור התחדשות עצמית 1-3. עם זאת, ההשתלה הישירה של תאי גזע יש מספר מגבלות, כגון דחייה חיסונית גידול היווצרות 4,5. לכן, גישת תא ללא עשויה לספק אסטרטגיה טיפולית חלופית עבור רפואת רגנרטיבית והתערבויות הזדקנות 6,7.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: סכמטי של serum- ופרוטוקול אוסף מזין ללא CM מוצג באיור 1.
1. חומרים (הכנת MEFs, בינוני, צלחות, ופתרונות)
- הכן 500 מ"ל של מדיום לתרבת את MEFs. מוסף בינוני של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% FBS (איכות ESC), 50 יחידות / פניצילין מ"ל, ו -50 מ"ג / מ"ל סטרפטומיצין.
- לבודד MEFs מעובר בעקבות פרוטוקול שגרתי הוקם 13 ולתחזק אותם במדיום MEF.
- הכן 500 מ"ל של מדיום לתרבת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
במקור, mESCs נשמרות על מזין MEF במדיום המסקלין עם FBS ותוספי מזון אחרים (איורים 1 א ו 2 א). CM נאסף mESCs ב מופחתת מדיה סרום ללא שכבת מזין, FBS, או תוספי מזון אחרים (1B דמויות 2B). מצב התרבות זה מאפשר לנו לאסוף המסקלין ספציפי מותנה בינוני ללא אפשרות של זיהום על ידי הגורמים ממזין, FBS, או תוספי מזון אחרים. המדיום המלא נאסף באותם תנאי התרבות, בלי mESCs.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
עבור האוסף המוצלח של serum- ומזין ללא המסקלין-CM, את ההצעות הבאות צריכות להילקח בחשבון. הגורם הקריטי ביותר הוא באמצעות mESCs הפרקים המוקדמים לאיסוף המסקלין-CM. בעבר, הוכח כי מוקדם מעבר המסקלין-CM יש השפעות אנטי אייג'ינג טוב יותר לעומת mESCs מעבר מאוחר. מספר חלוף mESCs דווח להשפיע הפוטנציאל ההתפתחותי 16 ו pluripotency 17.
בעוד מחקר נוסף נדרש כדי לנתח את הגורמים הספציפיים של secretome המסק.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
מחקר זה מומן על ידי תכנית המחקר במדעי יסוד (2013R1A1A2060930) ותכנית המרכז למחקר הרפואית (2015R1A5A2009124) באמצעות קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF), הממומן על ידי משרד המדע, ICT, ותכנון לעתיד. מחקר זה נתמך גם על ידי חברת סטארט-אפ הפעלה מענק מטעם בית החולים לילדים (HK סונג). ברצוננו להודות לורה Barwell ושרה JS קים לעזרה שלהם מעולה בעריכת כתב היד הזה וד"ר אנדרס Nagy למתן הקו G4 המסקלין.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | #11960-044 | |
| FBS | Invitrogen | #30044333 | 20%, איכות תאי ES |
| פניצילין וסטרפטומיצין | Invitrogen | #15140 | 50 יחידות/מ"ל פניצילין ו-50 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין |
| L-גלוטמין | Invitrogen | #25030 | 2 mM |
| חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA) | Invitrogen | #11140 | 100 ומיקרו; M |
| β-מרקפטואתנול | סיגמא | #M3148 | 100 ומיקרו; |
| M גורם מעכב לוקמיה | Millipore | #ESG1107 | 100 יחידות/מ"ל |
| OPTI-MEM | Invitrogen | #22600 | |
| X-gal | סיגמא | #B4252 | 1 מ"ג/מ"ל |
| פרפורמלדהיד (PFA) | סיגמא | P6148 | 3.70% |
| דימתילפורממיד (DMF) | סיגמא | #D4551 | |
| אשלגן פריציאניד | אולדריץ' | #455946 | 5 מ"מ |
| אשלגן פרוציאניד | אולדריץ | '#455989 | 5 מ"מ |
| NaCl | סיגמא | #S7653 | 150 מ"מ |
| MgCl2 | Sigma | #M2393 | 2 מ"מ |
| מיטומיצין C | סיגמא | #M4287 | 10 ומיקרו; גרם/מ"ל |
| פרופידיום יודיד | סיגמא | #P4170 | 50 ומיקרו; g/ml |
| TRIzol | Ambion | #15596018 | |
| M-MLV reverse transcript-tase | Promega | #M170B | |
| Power SYBR Green PCR master mix | יישומי ביוסיסטם | #4367659 | |
| HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast | LONZA | #CC-2511 | |
| מסנן בקבוק עליון | קורנינג | #430513 | 0.2 μ מ |
מקורות
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Lavasani, M., et al. Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
