מאמר שיטה

אוסף של Serum- ומזין ללא עכבר גזע עובריים בינוני מותנה-Cell לגישה Cell-חינם

DOI:

10.3791/55035

⸱

8 בינואר 2017

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology and Smart-aging Convergence Research Center, College of Medicine, Yeungnam University, 2Physiology and Experimental Medicine Program, The Hospital for Sick Children Research Institute, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק שיטה לאיסוף תאי גזע עוברי בעכבר (המסקלין) בינוני -conditioned (המסקלין-CM) נגזר סרום (נסיוב שור עוברי, FBS) - ומזין (פיברובלסטים עובריים בעכבר, MEFs) תנאים -חינם עבור תא גישת -חינם. זה עשוי להיות רלוונטי לטיפול הזדקנות ומחלות הקשורות להזדקנות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת של תאי גזע עובריים (ESCs) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) לייצר סוגי תאים שונים פתחה אפיקים חדשים בתחום הרפואה הרגנרטיבית. עם זאת, למרות היתרונות שלהם, הפוטנציאל הגידולי של תאי גזע גזעיים ו-iPSCs מהווה מזה זמן רב מחסום ליישומים קליניים. מעניין לציין כי הוכח כי תאי גזע גזעיים מייצרים מספר גורמים מסיסים שיכולים לקדם התחדשות רקמות ולעכב את הזדקנות התאים, מה שמצביע על כך שניתן להשתמש ב-ESCs ו-iPSCs גם כשיטת התערבות נטולת תאים. לכן, השיטה לקצירת מדיום מותנה של תאי גזע עובריים של עכברים (mESC) (mESC-CM) עם זיהום מינימלי של רכיבי סרום (סרום בקר עוברי, FBS) ותאי הזנה (פיברובלסטים עובריים של עכברים, MEFs) הייתה מבוקשת מאוד. כאן, המחקר הנוכחי מדגים שיטה אופטימלית לאיסוף mESC-CM בתנאים נטולי סרום ומזין ולאפיון mESC-CM באמצעות קריאות מרובות הקשורות להזדקנות. פרוטוקול זה יספק שיטה לאיסוף גורמי הפרשה טהורים ספציפיים ל-mESC ללא זיהום בסרום ובמזין.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת פרוטוקול זה היא לאסוף עכבר בתאי גזע עובריים (המסקלין) בינוני -conditioned (המסקלין-CM) מן התנאים תרבות serum- ומזין ללא ולאפיין תפקודים ביולוגיים שלה.

באופן כללי, תאי גזע עובריים (ESCs) יש פוטנציאל גדול עבור רפואה רגנרטיבית וטיפול התא עקב מגוונת" ויכולתן עבור התחדשות עצמית 1-3. עם זאת, ההשתלה הישירה של תאי גזע יש מספר מגבלות, כגון דחייה חיסונית גידול היווצרות 4,5. לכן, גישת תא ללא עשויה לספק אסטרטגיה טיפולית חלופית עבור רפואת רגנרטיבית והתערבויות הזדקנות 6,7.

ההזדקנות נתפסת עמיתו הסלולר הזדקנות רקמות ואיברים, המאופיינת במצב מתמיד של מעצר צמיחה, פיזיולוגית תא שהשתנתה ולאחר התנהגויות. הזדקנות היא גרם הסיכון העיקרי למחלות נפוצות כולל הסרטן, מחלות לב וכלי דם, type 2 סוכרת, ניוון מוחיים 8. אחד המאפיינים הברורים של הזדקנות היא ירידת פוטנציאל ההתחדשות של רקמות, אשר נגרם על ידי הזדקנות תאי גזע ותשישות 9. מחקרים רבים הראו משמעותי מולקולות תרופתיות, כגון rapamycin 9, רזברטרול 10, ומטפורמין 11, וגורמים מערכתיים שמקורן בדם, כלומר GDF11 12, שיש להם את היכולת לעכב הזדקנות בעקביות להאריך את תוחלת חיים.

במחקר הנוכחי, המסקלין-CM נקצר ללא בסרום (בסרום שור עוברי, FBS) ומזין (פיברובלסטים עובריים בעכבר, MEFs) שכבות כדי לשלול את הזיהום של גורמים בסרום וגורם הפרשה מן MEFs. תנאים אלה אפשרו CM serum- והמזין ללא ושכתוצאה מכך אפשר זיהוי המדויק של גורמי פרשת המסקלין ספציפיים.

פרוטוקול מוצע זה יעיל ביותר, יחסית חסכוני, וקללהפעיל. טכניקה זו מספקת תובנה על האפיון של גורמים מסיסים הנגזרות המסקלין שיכול לתווך אפקט אנטי-הזדקנות, אשר עשוי לשמש לפיתוח גישה טיפולית בטוחה יתרון פוטנציאלי ללא תא כלפי התערבויות למחל הזדקנות קשורה ומבריא אחר טיפולים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: סכמטי של serum- ופרוטוקול אוסף מזין ללא CM מוצג באיור 1.

1. חומרים (הכנת MEFs, בינוני, צלחות, ופתרונות)

  1. הכן 500 מ"ל של מדיום לתרבת את MEFs. מוסף בינוני של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% FBS (איכות ESC), 50 יחידות / פניצילין מ"ל, ו -50 מ"ג / מ"ל ​​סטרפטומיצין.
  2. לבודד MEFs מעובר בעקבות פרוטוקול שגרתי הוקם 13 ולתחזק אותם במדיום MEF.
  3. הכן 500 מ"ל של מדיום לתרבת את mESCs. DMEM הוא השלים עם FBS 15% ו -2 מ"מ L- גלוטמין, 100 מיקרומטר חומצות האמינו הלא-חיוניות (NEAA), 100 מיקרומטר β-mercaptoethanol, 100 יחידות / גורם מעכבות לוקמיה מ"ל (LIF), 50 יחידות / פניצילין מ"ל, ו -50 מ"ג / מ"ל ​​סטרפטומיצין.
  4. הכן את צלחות gelatinized (5 צלחות gelatinized / 1 צלחת המסקלין) על ידי ציפוי צלחות תרבית תאים 10 ס"מ עם 5 מ"ל של תמיסת הג'לטין 0.1%. דגירה של 10 דקות לפחות בטמפרטורת החדר.
  5. כן 500 מיליליטר של מופחתת סרום בינוני עבור מצב סרום ללא mESCs. תוספת מופחתת סרום מדיה עם 1.2 גרם של סודיום ביקרבונט (pH 7.0). סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר בקבוק עליון.
  6. הכן את β-galactosidase הקשורים-הזדקנות (SA β-gal) פתרון מכתים עבור זיהוי של תאים מזדקנים: 1 מ"ג / מ"ל ​​X-gal (מומס dimethylformamide, DMF), 40 מ"מ חומצת לימון / חיץ פוספט נתרן (pH 6.0) , 5 ferricyanide אשלגן מ"מ, 5 פרוציאני אשלגן מ"מ, 150 מ"מ NaCl, ו -2 מ"מ MgCl 2 14.
    זהירות: (המסוכן) DMF הוא פתרון רעיל מאכל. ללבוש ביגוד מגן אישי (למשל, כפפות ניטריל או לטקס, חלוק מעבדה, ומשקפי) בעת טיפול פתרון. השתמש במנדף.
  7. הכן 500 מ"ל של מדיום כדי fibroblasts עורי האנושי תרבות (HDFs, NHDF-אד-דר-פיברובלסטים). מוסף DMEM עם 10 FBS% ו -100 יחידות / פניצילין מ"ל ו 100 מ"ג / מ"ל ​​סטרפטומיצין.
jove_title "> 2. והתרבות של תאי עכבר גזע עובריים (איור 1 א ו 2 א)

הערה: ביצוע כל הצעדים במנדף בטיחות ביולוגית תרבית תאים.

  1. פנקו את MEFs עם 20 מ"ל של מדיום MEF המכיל 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​של mitomycin C בצלחת תרבית תאים 15 ס"מ. דגירה עבור שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  2. לשאוב את המדיום MEFs. שוטפים את התאים עם שלוש פעמים PBS. הוסף 3 מ"ל של טריפסין EDTA (TE, 1x) דגירה במשך 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לאחר 3 דקות, לנטרל את TE עם 6 מ"ל של מדיום צנטריפוגות MEF 3 דקות ב 300 x ז.
  3. Resuspend ב 5 מ"ל של מדיום MEF. לקבוע את מספר הסלולרי ההשעיה התא וכתוצאה מכך באמצעות מכתים trypan כחול ו hemocytometer. פלייט MEFs מומת (מזין) בצפיפות של 2 x 10 6 תאים לכל צלחת תרבית תאים של 10 ס"מ במדיום MEF. דגירה של 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  4. החלף את המדיום MEF עם המדיום המסקלין 24 שעות לאחר ציפוי מזין (עלהיום למחרת).
  5. פלייט mESCs (בתאי גזע עובריים היברידית F1 G4) בצפיפות של 2 x 10 6 תאים על מזין עם המדיום המסקלין. דגירה של 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
    הערה: אפקט אנטי אייג'ינג של המסקלין-CM הוא חזק סביר כאשר mESCs מספר מעבר נמוך משמשים 15-17. רכשנו קו G4 המסקלין מד"ר אנדרש Nagy ב לוננפלד-טננבאום מכון המחקר, בי"ח הר סיני, 25 אורד רחוב, טורונטו, ON, M5T 3H7, קנדה.
  6. שמור את התאים בצפיפות ומעבר יחסית גבוהים בכל מדינת 70-80% משנה ומחוברת. חלף בינוני עם בינוני המסקלין טרי מדי יום.

אוסף 3. Serum- ומזין ללא בינוני אלף (איור 1B ו -2)

הערה: ביצוע כל הצעדים במנדף בטיחות ביולוגית תרבית תאים.

  1. יש לשטוף את צלחת המסקלין עם 5 מ"ל של PBS. הוסף 1 מ"ל של TE (2.5x) דגירה במשך 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לאחר 3 דקות, לנטרל את TE עם 2 מ"ל של המסקלין mediuמ 'ו צנטריפוגות במשך 3 דקות ב 300 x גרם.
  2. Resuspend ב 5 מ"ל של המסקלין בינוניים צלחת 1 מ"ל לתוך כל מנה תרבות ג'לטין מצופה (5 צלחות gelatinized / 1 צלחת המסקלין) במדיום המסקלין. תרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד 80-85% confluency הוא הגיע.
  3. לשטוף mESCs עם PBS מספיק כדי לכסות את התאים (8 מ"ל לכל צלחת 10 ס"מ) למשך 10 דקות לכל לשטוף, עבור סכום כולל של שלושה שוטף. מדגירים סרום בינוני מופחת עבור 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
    הערה: שלב הכביסה חשוב על מנת למנוע זיהום FBS. חשוב לבצע את זמן הדגירה 18,19.
  4. אסוף המסקלין-CM לתוך צינור צנטריפוגות חרוטי 50 מ"ל במשך 20 דקות ב 2500 x ז. לאסוף את הפתרון supernatant (CM) לאחר צנטריפוגה. סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר בקבוק עליון.

4. השפעות של עכבר גזע עובריים בינוני מותנה-Cell (המסקלין-CM)

הערה: האפקטים של המסקלין-CM אומתו על ידי מספר שיטות, כגוןassay β-gal SA, ניתוח מחזור התא, qRT-PCR.

  1. Β-gal SA Assay (איור 3 א)
    1. HDFs זרע בצפיפות של 2 x 10 4 תאים לכל היטב צלחות 6-היטב במדיום HDF. דגירה לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO 2.
    2. בעקבות דגירת לילה, חצי שנזרק של מדיום HDF ולהוסיף המסקלין-CM ובינוני שליטה. דגירה של 72 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. בינוני בקרה נגזר סרום ללא בינוני (Reduced מדיה סרום) בצלחת מצופה ג'לטין בהעדר mESCs.
    3. שוטפים את התאים עם PBS מספיק כדי לכסות את התאים (2 מ"ל לכל צלחת 6-היטב) למשך 30 שניות לכל לשטוף, עבור סכום כולל של שני שוטף. להוסיף 3.7% paraformaldehyde (PFA) עבור קיבעון. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      זהירות: (המסוכן) Paraformaldehyde הוא פתרון רעיל מאכל. ללבוש ביגוד מגן אישי (למשל, כפפות ניטריל או לטקס, חלוק מעבדה, ומשקפי) בעת טיפול הפתרון.השתמש במנדף.
    4. לשאוב את פתרון הקיבעון. לשטוף את התאים הקבועים עם PBS פעמים, כמתואר בשלב 4.1.3.
    5. מוסיפים את פתרון מכתים SA β-gal (1-2 מ"ל לכל היטב צלחת 6-היטב). דגירה של 17.5 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: זה לא כדי להיות מודגרות ב CO 2 באינקובטור.
    6. לשאוב את הפתרון מכתים SA β-gal לשטוף את התאים עם PBS פעמיים, כמתואר בשלב 4.1.3.
    7. מוסיפים את פתרון Eosin למדיניות נגד מכתים. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שוטפים את התאים עם PBS פעמיים, כמתואר בשלב 4.1.3.
    8. תאי תמונה בהגדלת 100X באמצעות תמונות מיקרוסקופ לכידת אור באמצעות מצלמה דיגיטלית מחוברת לניתוח שלאחר מכן.
      הערה: המספר הכולל של תאים ניתן לספור באופן עיוור באחוז התאים הכחולים חיוביים β-gal SA ניתן לחשב.
  2. Cell Cycle Analysis (איור 3 ב)
    1. HDFs זרע בצפיפות של8 x 10 4 תאים לכל טוב בצלחת תרבית תאים 6 ס"מ במדיום HDF. דגירה לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO 2.
    2. בעקבות דגירת לילה, חצי שנזרק של מדיום HDF ולהוסיף המסקלין-CM ובינוני שליטה. דגירה של 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
    3. Trypsinize את התאים, כמו צעד מתואר 3.1, ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב g 300 x. שוטפים את התאים עם פתרון PBS קר (PBS עם 0.5 מ"מ CaCl 2 ו -2% FBS, 1 מ"ל לכל צינור 1.5 מ"ל) פעמיים ו צנטריפוגות במשך 3 דקות ב g x 2,500. Resuspend ב 100 μl של פתרון PBS קר.
    4. תקן את התאים על ידי הטלת 200 μl של אתנול קר תוך vortexing. חנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 1 שעה.
    5. שוטפים את התאים עם פתרון PBS קר פעמיים, כמתואר בשלב 4.2.3.
    6. Resuspend התאים 250 μl של חיץ נתרן ציטרט (1.12%, pH 8.5) המכיל RNase 50 מיקרוגרם / מ"ל. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
    7. הוסף 250 μl של נתרן ציטרטמאגר המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​propidium יודיד. דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    8. מדוד את 10,000 תאי מדגם זה באמצעות זרימת cytometry 20.
  3. qRT-PCR (איור 3 ג)
    1. HDFs זרע ולהוסיף המסקלין-CM, כמתואר בשלבים 4.1.1 ו 4.1.2.
    2. לבודד RNA סך מן HDFs באמצעות ערכת חילוץ RNA על פי הפרוטוקול של היצרן. לכמת את סך RNA חילוץ באמצעות ספקטרופוטומטר 21.
    3. לסנתז cDNA על ידי הוספת 1 מיקרוגרם של רנ"א הכל על 20 μl של תערובת התגובה המכיל אוליגו (DT) פריימרים ו transcriptase M-MLV הפוכה, על פי פרוטוקול של היצרן 20.
    4. מדוד את הגברה של cDNA עם מכונת PCR בזמן אמת, באמצעות שילוב הורים גרין PCR ו פריימרים גן ספציפי (טבלה 1 מוסף). לנרמל את הנתונים עם ביטוי GAPDH. השתמש בפרוטוקול PCR הבא: דה הראשוניתnaturation במשך 10 דקות ב 95 מעלות צלזיוס; 45 מחזורים במשך 15 שניות על 95 מעלות צלזיוס, 20 שניות על 55 מעלות צלזיוס ו -35 שניות על 72 מעלות צלזיוס; והשלב העקום ההתכה במשך 15 שניות על 95 מעלות צלזיוס, 1 דקות ב 60 מעלות צלזיוס, 30 שניות על 95 מעלות צלזיוס, ו -5 שניות על 60 מעלות צלזיוס 15.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במקור, mESCs נשמרות על מזין MEF במדיום המסקלין עם FBS ותוספי מזון אחרים (איורים 1 א ו 2 א). CM נאסף mESCs ב מופחתת מדיה סרום ללא שכבת מזין, FBS, או תוספי מזון אחרים (1B דמויות 2B). מצב התרבות זה מאפשר לנו לאסוף המסקלין ספציפי מותנה בינוני ללא אפשרות של זיהום על ידי הגורמים ממזין, FBS, או תוספי מזון אחרים. המדיום המלא נאסף באותם תנאי התרבות, בלי mESCs.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבור האוסף המוצלח של serum- ומזין ללא המסקלין-CM, את ההצעות הבאות צריכות להילקח בחשבון. הגורם הקריטי ביותר הוא באמצעות mESCs הפרקים המוקדמים לאיסוף המסקלין-CM. בעבר, הוכח כי מוקדם מעבר המסקלין-CM יש השפעות אנטי אייג'ינג טוב יותר לעומת mESCs מעבר מאוחר. מספר חלוף mESCs דווח להשפיע הפוטנציאל ההתפתחותי 16 ו pluripotency 17.

בעוד מחקר נוסף נדרש כדי לנתח את הגורמים הספציפיים של secretome המסק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי תכנית המחקר במדעי יסוד (2013R1A1A2060930) ותכנית המרכז למחקר הרפואית (2015R1A5A2009124) באמצעות קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF), הממומן על ידי משרד המדע, ICT, ותכנון לעתיד. מחקר זה נתמך גם על ידי חברת סטארט-אפ הפעלה מענק מטעם בית החולים לילדים (HK סונג). ברצוננו להודות לורה Barwell ושרה JS קים לעזרה שלהם מעולה בעריכת כתב היד הזה וד"ר אנדרס Nagy למתן הקו G4 המסקלין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DMEMInvitrogen#11960-044
FBSInvitrogen#3004433320%, איכות תאי ES
פניצילין וסטרפטומיציןInvitrogen#1514050 יחידות/מ"ל פניצילין ו-50  מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין
L-גלוטמיןInvitrogen#250302  mM
חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA)Invitrogen#11140100  ומיקרו; M
β-מרקפטואתנול סיגמא#M3148100  ומיקרו;
M גורם מעכב לוקמיה Millipore#ESG1107100 יחידות/מ"ל
OPTI-MEMInvitrogen#22600
X-gal סיגמא#B42521 מ"ג/מ"ל
פרפורמלדהיד (PFA)סיגמאP61483.70%
דימתילפורממיד (DMF)סיגמא#D4551
אשלגן פריציאנידאולדריץ'#4559465 מ"מ
אשלגן פרוציאנידאולדריץ'#4559895 מ"מ
NaClסיגמא#S7653150 מ"מ
MgCl2Sigma#M23932 מ"מ
מיטומיצין Cסיגמא#M428710  ומיקרו; גרם/מ"ל
פרופידיום יודיד סיגמא#P417050  ומיקרו; g/ml
TRIzolAmbion#15596018
M-MLV reverse transcript-tasePromega#M170B
Power SYBR Green PCR master mix יישומי ביוסיסטם#4367659
HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast LONZA#CC-2511
מסנן בקבוק עליוןקורנינג#4305130.2 μ מ

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  2. Lavasani, M., et al. Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model. Nat Commun. 3, 608(2012).
  3. Woo, D. H., et al. Direct and indirect contribution of human embryonic stem cell-derived hepatocyte-like cells to liver repair in mice. Gastroenterology. 142, 602-611 (2012).
  4. Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
  5. Moon, S. H., et al. A system for treating ischemic disease using human embryonic stem cell-derived endothelial cells without direct incorporation. Biomaterials. 32, 6445-6455 (2011).
  6. Tongers, J., Roncalli, J. G., Losordo, D. W. Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia: microvascular therapies coming of age. Circulation. 118, 9-16 (2008).
  7. Lazarous, D. F., et al. Basic fibroblast growth factor in patients with intermittent claudication: results of a phase I trial. J Am Coll Cardiol. 36, 1239-1244 (2000).
  8. Adams, P. D. Healing and hurting: molecular mechanisms, functions, and pathologies of cellular senescence. Mol Cell. 36, 2-14 (2009).
  9. Harrison, D. E., et al. Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice. Nature. 460, 392-395 (2009).
  10. Baur, J. A., Ungvari, Z., Minor, R. K., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. Are sirtuins viable targets for improving healthspan and lifespan. Nat Rev Drug Discov. 11, 443-461 (2012).
  11. Martin-Montalvo, A., et al. Metformin improves healthspan and lifespan in mice. Nat Commun. 4, 2192(2013).
  12. Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153, 828-839 (2013).
  13. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
  14. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
  15. Bae, Y. U., Choi, J. H., Nagy, A., Sung, H. K., Kim, J. R. Antisenescence effect of mouse embryonic stem cell conditioned medium through a PDGF/FGF pathway. FASEB J. 30, 1276-1286 (2016).
  16. Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8424-8428 (1993).
  17. Li, X. Y., et al. Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation. Cell Tissue Res. 327, 607-614 (2007).
  18. Mbeunkui, F., Fodstad, O., Pannell, L. K. Secretory protein enrichment and analysis: an optimized approach applied on cancer cell lines using 2D LC-MS/MS. J Proteome Res. 5, 899-906 (2006).
  19. Makridakis, M., Vlahou, A. Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers. J Proteomics. 73, 2291-2305 (2010).
  20. Kim, K. S., et al. Regulation of replicative senescence by insulin-like growth factor-binding protein 3 in human umbilical vein endothelial cells. Aging Cell. 6, 535-545 (2007).
  21. Kim, K. S., et al. Induction of cellular senescence by insulin-like growth factor binding protein-5 through a p53-dependent mechanism. Mol Biol Cell. 18, 4543-4552 (2007).
  22. Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int J Dev Biol. 52, 353-363 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PCRRNAReal time PCR

מאמרים קשורים