מאמר שיטה

ניתוח בידוד תזרים Cytometric של האדם תאים האנדוצרוויקאלית גמא דלתא T

DOI:

10.3791/55038

⸱

6 בפברואר 2017

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Miller School of Medicine, University of Miami, 2Division of Infectious Diseases, Miller School of Medicine, University of Miami

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים כאן שיטת בידוד להשגת לימפוציטים תוך-אפיתליאליים אנדו-צוואריים אנושיים לניתוח תאי T גמא דלתא תוך-אפיתליים. ניתן להרחיב פרוטוקול זה לטיהור תאי T גמא דלתא אנדו-צוואריים על ידי חרוזים מגנטיים או על ידי מיון תאים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באיברי הרבייה הנקביים (FRT) הרירית מערכת החיסון משמש כקו ההגנה הראשון. להכיר טוב יותר את רירית איברי המין ולכן הוא חיוני להבנת פתוגניות של פתוגנים שונים כולל איידס. דלתא גמא (GD) ותאי T הם האבטיפוס של "בלתי שגרתיים" תאי T והם מייצגים קבוצה קטנה יחסית של תאי T מוגדר על ידי הביטוי שלהם של קולטני תאי T heterodimeric (TCRs) מורכב שרשראות גמא דלתא. זה שמבדיל אותם מתאי הקלסיים הרבה יותר טוב ידוע CD4 + T מסייע תאי CD8 + T ציטוטוקסיים המוגדרים על-ידי TCRs בטא-אלפא. תאי GD T לעתים קרובות להראות לוקליזציה רקמות ספציפיות ומועשרים ב האפיתל. תאי GD T לתזמר תגובה חיסונית דלקת, מעקב גידול, מחלות זיהומיות, אוטואימוניות.

כאן, אנו מציגים שיטה לבודד reproducibly ולנתח לימפוציטים GD T האנדוצרוויקאלית האדם intraepithelial. אנו חהve דגימות cytobrush האנדוצרוויקאלית בשימוש מנשים שהשתתפו במחקר זיהום נשים בין-HIV (WIHS). יש ידע על אינטראקציות תאי GD T במהלך תנאים שבם יש עלבון הרירי בנרתיק יכול להיות מיושם על כל ניסוי קליני נוסף בו פגיעות ריריות הופנה, כולל הפיתוח בנוסף microbicides.In נרתיק, ידע על תגובות תא הרירי GD T פוטנציאל היישום של טיפול החיסוני מבוסס תאי GD T בטיפול במחלות זיהומיות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתחנו מתודולוגיה של שימוש בדגימות מברשת האנדוצרוויקאלית להעריך תאים GD T intraepithelial. התעלה האנדוצרוויקאלית מצופה בשכבה אחת של אפיתל עמודי. לימפוציטים intraepithelial מייצגים לימפוציטים חזית המתגוררים בתוך שכבת האפיתל שיכול ליזום תגובה חיסונית במהירות כשנתקלה 7 חיידקים פתוגניים, 8. הבנת האירועים אימונולוגיים של תא האנדוצרוויקאלית intraepithelial חשוב בעיצוב של אסטרטגיות אפקטיביות כדי למנוע זיהומים, כולל איידס.

השיטה שלנו יכול להיות מיושם על דגימות האנדוצרוויקאלית אדם טרי שנאספו כמו גם תאים אנדוצרוויקאלי קפוא כדי להמשיך לחקור את התפקיד של תאי T GD intraepithelial בנשים עם זיהום HIV או בסיכון הידבקות ב- HIV. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לגלות אירועים אימונולוגיים רומן תא intraepithelial האנדוצרוויקאלית וכדי evaluatדואר GD תגובות תא T כסמן של פגיעות ריריות בנשים עם זיהום HIV.

הפערים המשמעותיים בידע סביב חסינות FGT נובעים בחלקם הקושי לאסוף בהצלחה ועיבוד דגימות ריריות. יתר על כן, ההטרוגניות המורכבות של תאים חיסוניים ריריים, ואת הקשרים הפנימיים שלהם אחד עם השני, הם אתגרים מרכזיים לזיהוי מדידות רלוונטיות קליני המשקפים המדינה ואת היכולת של המערכת החיסונית. פתחנו שיטה להשיג תאים מטוהרים intraepithelial מאוד GD T שיכול להיות עוד יותר לנתח באמצעות טכנולוגיות מרובבות ביותר, תא בודד שעשויה להיות קריטי לזיהוי המנגנונים של חסינות FRT.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פעילויות המחקר התקיים באוניברסיטת יחידת המחקר מיאמי HIV בשיתוף עם לחקר בין-HIV נשים מיאמי (WIHS) והמרכז מיאמי לאיידס מחקר (וכפר) המועצה לביקורת .Institutional (אוניברסיטת מיאמי מילר מבית הספר לרפואה) התקבל אישור מראש לגיוס וכל נהלים בנושא הערכה או מחקר.

1. אוסף דוגמאות האנדוצרוויקאלית מברשת

הערה: משתתפים עברו בדיקת גינקולוגית מבוצעת על ידי MD המאומן או גינקולוג וגבייה לימפוציטים intraepithelial בוצעו תחת בחינת ספקולום ידי החדרת cytobrush.

  1. מאפיינים משתתפים
    1. לגייס משתתפי נשים בגילי 18 עד 45 שנים של גיל, פעילים מינית, לא בהריון ולא על תרופות מניעות או עם התקן תוך רחמים.
    2. לפני בדיקת גינקולוגית, המשתתפים צריכים לעבור לקיחת דם 10 מ"ל בירוק vacutainers הפרין העליון עבור תא דם היקפיים mononuclear (PBMC) בידוד. כדי לשמש כביקורת לניתוח 9 intraepithelial האנדוצרוויקאלית.
  2. אוסף של דגימות האנדוצרוויקאלית
    1. הכנס ספקולום סטרילי בגודל המתאים לנרתיק ללא שימון. השתמש במים חמים כדי להקל על הכניסה של ספקולום גזה סטרילי כדי לנקות את הריר. עמדת ספקולום מאפשרת להדמיה מלאה של מערכת ההפעלה ectocervix.
    2. הכנס מברשת האנדוצרוויקאלית לתוך תעלת האנדוצרוויקאלית עד שרק הזיפים קרובים מצד גלויים. סובב עם כיוון השעון מברשת 360 °. מעבירים את המברשת לתוך צינור 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של מדיום IMDM.
    3. מיד לאחר איסוף, במקום צינור המכיל cytobrush על הקרח. כדי להשיג כדאיות גבוהה של תאים intraepithelial שנאספו, לספק את cytobrush למעבדה תהליך בתוך 1 שעות.

"Jove_title"> 2. האנדוצרוויקאלית עיבוד מדגם Cytobrush

  1. צינור וורטקס המכיל cytobrush האנדוצרוויקאלית החלת 4 משייכות קצרות (10 שניות).
  2. צנטריפוגה הצינור, המכיל cytobrush, במשך 10 דקות ב 250 x גרם.
  3. מוציאים בזהירות את cytobrush מהצינור (לא להפריע את הכדור בחלק התחתון של הצינור) ולהוסיף 1 מ"ל של התקשורת IMDM ולמקם את הצינור על הקרח.
  4. מניחים את cytobrush על מסננת תא 100 מ"מ על החלק העליון של הצינור 50 מ"ל.
  5. שטפו את cytobrush עם IMDM 20 מ"ל.
  6. צינור צנטריפוגה במשך 10 דקות ב g 250 x.
  7. למזוג supernatant ותאי pelleted resuspend ב 1 מ"ל IMDM ולשלב עם גלולה מחדש תלויה כבר המתואר 2.3.
  8. ספירת התאים באמצעות דלפק תא אוטומטי 10 או לספור את התאים באמצעות hemocytometer על ידי שילוב 10 μL של השעית התא עם 10 μL של צבע כחול trypan. בעדינות pipet למעלה ולמטה עשר פעמים כדי לערבב את התאים לצבוע. טען 10 μLשל התערובת לתוך הפתח של אחד משני תאי hemocytometer. לספור את כל התאים בחמשת תחומי הרשת. שמור ספירה נפרדת של תאי קיימא ושאינו קיימא. לקבוע את כדאיות התא באמצעות הנוסחא הבאה: תאי חי% = ללא קיימא תאים x 100 / תאים מספר תאים כוללים.
    קבע את ריכוז התא עוקב לכל מיליליטר (ואת המספר הכולל של תאים) באמצעות החישובים הבאים. תאים סה"כ לכל מ"ל = תאים הכולל x נספר (גורם לדילול / מספר מרובע נספר) x 10,000 תאים / מ"ל.
  9. להקפיא תאים האנדוצרוויקאלית מבודדים באמצעות מדיום הקפאה המכיל 10% DMSO ו -90% FBS.

3. Cytometry זרימה

  1. Re- להשעות 1-3 x 10 5 תאים אנדוצרוויקאלי ב 100 חיץ μL FACS (PBS המכיל אלבומין בסרום שור 1%
  2. הוסף 1 μL / 10 6 חי / מת ניתן לתקן ערכת כתם Cell מלח צהובה ונוגדנים עבור סמני משטח בריכוזים המתוארים בטבלת 1.
  3. דגירת התאים למשך 30 דקות ב +4 ° C, מוגן מפני אור.
  4. הוסף 1 מ"ל חיץ FACS והתאים וצינורות צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 350 XG
  5. Re- להשעות תא גלולה ב 300 paraformaldehyde 1% μL.
  6. כן שולט פיצוי באמצעות חרוזים ונוגדנים המשמשים מכתים ידי הוספת 100 μL של חיץ FACS וטיפה אחת של חרוזי הריכוז הזהה של הנוגדנים המשמשים מכתים מדגם.
  7. רוכשת חרוזים ודוגמאות מוכתם על cytometer זרימה, מצויד 405 ננומטר, 488 ננומטר, ו 635 nm לייזרים.

4. בידוד תא האנדוצרוויקאלית גמא דלתא T

  1. בידוד חרוז מגנטי
    1. Re- להשעות תא גלול אנדוצרוויקאלי (≤10 7 תאים בסך הכל), מתואר 2.6, ב 40 μL של החיץ הכלול בערכת microbead דלתא גמא TCR בהפניה של טבלת החומרים ריאגנטים.
    2. פעל בהתאם להוראות ערכה עבור פרוטוקול מכתים שני שלבים: הראשון, שנינותדלתא גמא אנטי TCR h hapten-נוגדן והשני, עם אנטי hapten microbeads-FITC
    3. לאחר דגירה של 15 דקות ב 4-8 מעלות צלזיוס, לשטוף את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של חיץ צנטריפוגות ב XG 300 במשך 10 דקות. למזוג supernatant על ידי היפוך הצינור, והקש יבש בעזרת פיסת נייר.
    4. Re- להשעות את התא הגלול ב 500 μL של חיץ הניתן ולהכין בעמודה המגנטית על ידי צבת אותו מפריד מגנטי מתאים על פי הפרוטוקול של הספק.
    5. החל ההשעיה התא על עמודה ולאסוף תאים ללא תווית שעוברים ולשטוף טור 3x עם הכמות המתאימה של חיץ (500 μL). בצע שלבי כביסה ידי הוספת חיץ שלוש פעמים, בכל פעם פעם מאגר הטור ריק. אסוף בשפכים הכולל. זהו שבריר התא ללא תווית, שלילי
    6. הסר את העמודה מהווים את מפריד מגנטי פיפטה 1 מ"ל של חיץ על הטור ומיד לשטוף את השבר עם התווית מגנטיתאד תאים על ידי החלת הבוכנה מסופקת עם הטור בתקיפות.
      הערה: תאי T דלתא גמא מבודד כבר מגואלות fluorescently לניתוח זרימה cytometric מאז microbeads מתויג מגנטית אנטי hapten הם מצומדות עם FITC צבע פלואורסצנטי.
  2. מיון תא
    1. עבור מיון תא, תאי האנדוצרוויקאלית תווית עם למות כדאיות ולוח נוגדן כמתואר בסעיף 3.
    2. הגדרת שערים אלקטרוניים על חי, CD45 + CD3 + ו דלתא גמא תאים חיוביים ולבצע מיון התא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחרונה, ניתחנו תאים GD T intraepithelial האנדוצרוויקאלית והיינו הראשון לדווח על הפסד של תאי T דלתא גמא אנדוצרוויקאלי בנשים הנגועים באיידס 9, 11. כאן אנו מתארים פרוטוקול לבודד ולנתח את המשנה של תאי T דלתא גמא האנדוצרוויקאלית. כפי שניתן לראות בתרשים 1, תאי GD T ניתן לאתר בקלות את דגימות תאי האנדוצרוויקאלית אדם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערכת הפגיעות ריריות בדרכי נשית תחתונות איברי מין היא מרכיב חיוני של מחקרים קליניים פונים סיכון רכישת HIV ושידור. בדרך כלל פגיעות FGT מפני הדבקה ב- HIV מוערכות על ידי מדידת מאפננים חיסוניים מסיסים הפרשות איברי מין (ציטוקינים, chemokines ופפטידים מיקרוביאלית) 12, 13. עם זאת, סמנים אלה מצביעים רק של דלקת בנרתיק, הם מושפעים מאירועים פיזיולוגיים ופתולוגיים, ואינם מייצגים תמיד נזק הרירית ישיר. על מנת לשפר את הבנתנו כיצד גורמים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחברים אין עמותה מסחרית או אחרת שעלולים להציב ניגוד העניינים (למשל, בעלות על מניות תרופות, ייעוץ, חברות בועדה מייעצות, פטנטים רלוונטיים, או למימון מחקר).

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים משתתפי המחקר מיאמי WIHS על נכונותם להשתתף בעבודה זו. נתונים בכתב היד הזה היו שנאספו במסגרת פרויקט HIV Interagency של מיאמי נשים (WIHS). התכנים של פרסום זה הם באחריות בלעדית של הכותבים ואינם מייצגים את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב (NIH). עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות ולימוד זיהום HIV Interagency לנשים (WIHS) [AI103397 U01 מספר מענק], המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, המכון הלאומי לבריאות [מספר מענק P30AI073961], המרכז הלאומי לקידום מדעי translational לבין המכון הלאומי לבריאות המיעוט ופערים הבריאות, המכון הלאומי לבריאות [מספר מענק UL1TR000460 ו 1KL2TR000461], המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם, המכון הלאומי לבריאות [K23HD074489 מספר מענק].

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ציטומברשת פלוס GT (CareFusion, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב
IMDM, המדיום של Dulbecco המותאם של Iscove ThermoFisher Scientific12440061
בקמן קולטר מונה תאים אוטומטי (מנתח כדאיות התאים מסדרת Vi-CELLבקמן קולטר496178
DMSO, דימתיל סולפוקסיד סיגמא אולדריץ' D2650
FBS, סרום בקר עובריInvitrogen, Gibco26140-079
PBSInvitrogen, Gibco10010023
BSASigma AldrichA-9647
LIVE/DEAD ערכת כתמי תאים מתים צהובים לתיקון Life Technologies,L349S9
1% פרפורמלדהידסיגמא אולדריץ' D6148
ציטומטר זרימה של פורטסה Becton Dickinson
UltraComp eBeadseBioscience01-2222-42
ArC אמין חרוזי פיצוי תגובתיים (Life Technologies, גרנד איילנד, ניו יורק, ארה"ב)Life TechnologiesA10346
Anti-TCR גמא/דלתא MicroBead Kit Milteny Miltenyi Biotec Inc.130-050-701
עמודת103-042-201
מפריד4124
MS MACS

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaul, R., et al. The genital tract immune milieu: an important determinant of HIV susceptibility and secondary transmission. J Reprod Immunol. 77, 32-40 (2008).
  2. Haase, A. T. Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission. Nature. 464, 217-223 (2010).
  3. Hayday, A. C. gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection. Ann Rev Immunol. 18, 975-1026 (2000).
  4. Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes and infection / Institut Pasteur. 9, 251-258 (2007).
  5. Autran, B., et al. T cell receptor gamma/delta+ lymphocyte subsets during HIV infection. Clin Exp Immunol. 75, 206-210 (1989).
  6. Pauza, C. D., Poonia, B., Li, H., Cairo, C., Chaudhry, S. gammadelta T Cells in HIV Disease: Past, Present, and Future. Front Immunol. 5, 687(2014).
  7. Hayday, A. C., Spencer, J. Barrier immunity. Sem Immunol. 21, 99-100 (2009).
  8. Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Rev Immunol. 11, 445-456 (2011).
  9. Strbo, N., et al. Loss of Intra-Epithelial Endocervical Gamma Delta (GD) 1 T Cells in HIV-Infected Women. AJRI. 75, 134-145 (2016).
  10. Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration measurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab Hematol. 10, 109-111 (2004).
  11. Alcaide, M. L., et al. Bacterial Vaginosis Is Associated with Loss of Gamma Delta T Cells in the Female Reproductive Tract in Women in the Miami Women Interagency HIV Study (WIHS): A Cross Sectional Study. PloS one. 11, e0153045(2016).
  12. Masson, L., et al. Defining genital tract cytokine signatures of sexually transmitted infections and bacterial vaginosis in women at high risk of HIV infection: a cross-sectional study. Sex Transm Dis. 90, 580-587 (2014).
  13. Fichorova, R. N., et al. Interleukin (IL)-1, IL-6, and IL-8 predict mucosal toxicity of vaginal microbicidal contraceptives. Biol Reprod. 71, 761-769 (2004).
  14. Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. JoVE. , (2014).
  15. McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, e85675(2014).
  16. Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391, 133-145 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

TCR Gamma DeltaCD45CD3

מאמרים קשורים