מאמר שיטה

שימוש Assay מונוציטים חד שכבתי להערכת Fcγ קולטן בתיווך Phagocytosis

19.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55039

⸱

2 בינואר 2017

 , 
1Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 2Centre for Innovation, Canadian Blood Services

במאמר זה

סיכום

בדיקת המונוציטים החד-שכבתית (MMA) היא בדיקה במבחנה המשתמשת במונוציטים ראשוניים מבודדים המתקבלים מדם מלא היקפי של יונקים כדי להעריך פגוציטוזיס בתיווך קולטן Fcγ (FcγR).

תקציר

למרות שפותחה במקור לחיזוי תוצאות עירוי של דם שאינו תואם סרולוגית, בדיקת מונוציטים חד-שכבתית (MMA) היא בדיקה רב-תכליתית במבחנה הניתנת לשינוי כדי לבחון היבטים שונים של פגוציטוזיס בתיווך נוגדנים וקולטני Fcγ (FcγR) הן במסגרות מחקריות והן במסגרות קליניות. הבדיקה משתמשת במונוציטים דבקים מתאים חד-גרעיניים בדם היקפי שבודדו מדם מלא של יונקים. MMA תואר לשימוש הן בבני אדם והן בחקירות עכברים. מונוציטים אלה מבטאים FcγRs (למשל, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB ו-FcγRIIIA) המעורבים בתגובות חיסוניות. ה-MMA מנצל את המנגנון של אינטראקציות בתיווך FcγR, במיוחד פגוציטוזיס, כאשר תאי דם אדומים רגישים לנוגדנים (RBCs) נצמדים ו/או מפעילים FcγRs ולאחר מכן עוברים פגוציטוזציה על ידי המונוציטים. in vivo, בעיקר מקרופאגים רקמתיים הנמצאים בטחול ובכבד מבצעים פגוציטוזיס בתיווך FcγR של RBCs אופסוניים נוגדנים, וגורמים להמוליזה חוץ-וסקולרית. על ידי הערכת רמת הפגוציטוזיס באמצעות ה-MMA, ניתן לחקור היבטים שונים של התהליך המתווך FcγR in vivo. חלק מהיישומים של ה-MMA כוללים חיזוי הרלוונטיות הקלינית של נוגדנים אלו-או נוגדנים עצמיים בסביבה של עירוי, הערכת תרופות מועמדות המקדמות או מעכבות פגוציטוזיס, ושילוב הבדיקה עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או אימונובלוטינג מערבי מסורתי כדי לחקור את השפעות האיתות במורד הזרם של תרופות או נוגדנים המעורבים ב-FcγR. חלק מהמגבלות כוללות את העמלנות של טכניקה זו, שנמשכת יום שלם מתחילתה ועד סופה, והדרישה לאישור אתיקה מחקרית על מנת לעבוד עם דם יונקים. עם זאת, עם חריצות ואימונים נאותים, ניתן להשיג את תוצאות ה-MMA תוך זמן תחלופה של 24 שעות.

מבוא

בדיקת מונוציטים חד-שכבתית (MMA) היא בדיקה חוץ גופית שפותחה במקור כדי לחזות טוב יותר את תוצאות עירוי הדם בחולים עם נוגדנים עצמיים או אלו-נוגדנים לתאי דם אדומים (RBCs)1-5. על ידי הערכת ההשפעה של נוגדנים נגד RBC בתיווך פגוציטוזיס בתיווך קולטן Fcγ (FcγR) באמצעות בדיקת מבחנה זו, ניתן לחזות את התוצאה הקלינית in vivo. ואכן, ה-MMA שימש בהצלחה כדי למנוע הרס חיסוני של תאי דם אדומים הקשורים לנוגדנים, למרות עירוי של דם שאינו תואם סרולוגית5. ההליך הטיפוסי לפני עירוי לבדיקת תאימות, המכונה גם crossmatching, כולל שיטות סרולוגיות הכוללות הקלדת דם המטופל לאנטיגנים ABO ו-Rh ובדיקת נוכחות נוגדנים נגד RBC בחולה6. נבחר דם המותאם ל-ABO/Rh, ואם קיימים נוגדנים, נעשה ניסיון לזהות אותם כך שניתן יהיה לבחור דם לעירוי נוסף כדי להימנע מאנטיגנים אלה. תוצאת הצלבה אידיאלית מתרחשת כאשר כל דם התורם תואם סרולוגית לדם המטופל, מה שמפחית את הסיכון להמוליזה לאחר עירוי7. עם זאת, מערכת זו נופלת מקבוצה קטנה של חולים שהפכו מחוסנים לאחר עירוי חוזר או הריון. חולים אלה מייצרים נוגדנים אלו-נוגדנים כנגד אנטיגנים ספציפיים של RBC. חלקם מייצרים נוגדנים לאנטיגנים בשכיחות גבוהה מאוד באוכלוסייה הכללית, ולכן קשה יותר ויותר להצליב8,9. בנוסף למורכבות, לא כל האלונוגדנים הם משמעותיים מבחינה קלינית; במילים אחרות, קשירה של נוגדן אלו-נוגדן ל-RBCs שזוהו בבדיקה סרולוגית אינה גורמת בהכרח להמוליזה כאשר מועבר דם חיובי לאנטיגן שאינו תואם. ה-MMA פותח במקור כדי להעריך את המשמעות הקלינית הפוטנציאלית של דם שאינו תואם סרולוגית במסגרת עירוי1-5.

מכיוון שידוע כי המוליזה חוץ-וסקולרית של RBCs הקשורים לנוגדנים מתווכת על ידי מערכת הפגוציטים החד-גרעינית, מונוציטים/מקרופאגים ראשוניים משמשים בפיתוח מבחני אבחון. הבדיקה הראשונה לחקר האינטראקציה בין מונוציטים, תאי דם אדומים ונוגדנים פורסמה בשנת 1975, אך התנאים הלא אופטימליים בהם נעשה שימוש הובילו רק להיווצרות שושנה (קשירת RBCs לפריפריה של המונוציטים), ולא נצפתה פגוציטוזיס10. שינויים משמעותיים בבדיקה נעשו על ידי מספר קבוצות, מה שהוביל לבדיקה שעבורה ניתן לתאם את רמת הפגוציטוזיס של RBCs הקשורים לנוגדנים לתוצאה הקלינית של המוליזה1-5. לאחרונה, נבדקו תנאי האחסון האופטימליים של דגימות קליניות ואופטימיזציה נוספת של תנאי הבדיקה כדי לשפר את התועלת של התאמה צולבת MMA קלינית באמצעות דגימות מטופלים אוטולוגיות11.

שלוש טכניקות אבחון נוספות שימשו בנוסף ל-MMA בחיזוי תוצאות עירוי: מבחן שחרור 51Cr, מבחן רוזטה ומבחן כימילומינסנציה (CLT). בבדיקת שחרור 51Cr, המטופל מוזרק עם 51RBCs תורמים המסומנים ב-Cr, ומחצית החיים של ה-RBCs המסומנים מנוטרת ומנבאת הישרדות או פינוי לאחר עירוי12,13. מכיוון ששיטה זו משתמשת בחומרים רדיואקטיביים, היא מבוצעת לעתים רחוקות יותר. בדיקת הרוזטה כוללת ערבוב ודגירה של מונוציטים עם תאי דם אדומים וכימות רמת היווצרות הרוזטה (ללא פגוציטוזיס)14. המשמעות הקלינית של נוגדנים in vivo כוללת פגוציטוזיס פעיל על ידי מקרופאגים הנמצאים בטחול ו/או בכבד; לפיכך, שיטה זו אינה מספקת קריאה רלוונטית של פגוציטוזיס. ה-CLT משתמש בלומינול כדי לנטר את התפרצות החמצון במהלך פגוציטוזיס מונוציטים של RBC, מכיוון שלומינול זוהר כחול כאשר הוא מתחמצן בפאגוזום15. שיטה זו טובה, אך זיהום על ידי נויטרופילים יכול לבלבל את הקריאה. נערכו השוואות מקבילות כדי להעריך את הרגישות, המעשיות ויכולת השחזור של ארבע השיטות הזמינות, וגם ה-CLT וגם ה-MMA דורגו במקוםה-16. עם זאת, ה-CLT שימש בעיקר להערכת מחלה המוליטית של העובר והיילוד (HDFN), וה-pH האופטימלי של הבדיקה של 8.0 עלול לפגוע ברמת הפגוציטוזיס11.

בנוסף לתועלת האבחנתית והקלינית שלו, ה-MMA שונה למטרות מחקר אחרות. ואכן, ה-MMA יכול לשמש לא רק כבדיקה פונקציונלית לטיפול בפערים בין סרולוגיה לביולוגיה, הוא גם שימש לחקירה רטרוספקטיבית של הגורם להמוליזה לאחר טיפול באימונוגלובולין תוך ורידי (IVIG)17. הוא שימש גם לבחינת המבנה-תפקוד של מעכבים כימיים של פגוציטוזיס18-20 בתיווך FcγR ולחקר האיתות במורד הזרם של פגוציטוזיס21 בתיווך FcγR. במעבדה שלנו, בנוסף לשימוש ב-MMA אנושי, אנו מפתחים MMA עכברי באמצעות תאים חד-גרעיניים ראשוניים של דם היקפי של עכבר (PBMCs) ו-RBCs אוטולוגיים. הרציונל הוא לסנן נוגדנים שיכולים לגרום לפגוציטוזיס בתיווך FcγR כמתווך לפיתוח מודל עכברי של אנמיה המוליטית אוטואימונית (AIHA) in vivo (נתונים שלא פורסמו). השינויים השונים מתמקדים בהיבטים שונים של נוגדן IgG ואינטראקציה של FcγR הגורמים לפגוציטוזה.

פרוטוקול

לקבל אישור לשימוש דגימות אנושיות על ידי ועדות האתיקה במחקר הלוח / מוסדיות, וליצור הסכמה חתומה מכל תורמי האדם. MMA יכול גם להתבצע באמצעות PBMCs העכבר באופן דומה כמו assay אדם, לאחר אישור אתיקה השימוש בבעלי חיים. MMA מנצל טכניקות בתרבית רקמה ספטית.

הערה: ראה איור 1.

הערה: למרות שאנו ממליצים שימוש ארון biocontainment רמת 2 במהלך assay לשמור טכניקה מזוהמת, כשיטה היא רק שיטת תרבות "לטווח קצר", אין באמת מספיק זמן לחיידקים לזהם את assay. לכן, אם ארון biocontainment רמה 2 אינה קיימת, ולא לקנות אחד רק עבור assay זה, assay יכול להתבצע מחוץ לארון biocontainment, על ספסל פתוח. השימוש 37 ° C חממה עם 5% CO 2, לעומת זאת, היא לא אופציה וחייב לשמשתוצאות אופטימליות.

1. בידוד תא הדם ההיקפי mononuclear

  1. השג דם אדם שלם מתורם בריא או חולה באמצעות venipuncture באמצעות vacutainers המכילים חומצה-ציטרט דקסטרוז (ACD) קרישה (צינורות צהוב-top).
    הערה: כל הדם ניתן לאחסן ACD בטמפרטורת החדר (18-22 מעלות צלזיוס) במשך עד 36 שעות לפני שתמשיך לשלב הבא 11. בדרך כלל, 1-2 10 מ"ל צינורות Vacutainer של דם מלא מספיקים עבור assay.
  2. לדלל את הדם כולו 1: 1 v / v במדיום חמים RPMI להשלים (RPMI-1640 בתוספת 10% בסרום שור עוברית, 20 HEPES מ"מ, ו 0.01 מ"ג / מ"ל ​​גנטמיצין).
  3. לבודד תאי הדם היקפיים mononuclear (PBMCs) מהדם המדולל השלם באמצעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות, כפי שהומלץ על ידי היצרן (ראה רשימה של חומרים). שכבה בדם מדולל מאוד לאט מעל שיפוע צפיפות (מחומם לטמפרטורת החדר, 18-22 מעלות צלזיוס).
    הערה: יקטין את כמות mixing על הממשק עבור ההפרדה האופטימלית של דם על ידי שכבות תערובת הדם בזהירות באופן dropwise או באמצעות פיפטה.
    1. אפשר תערובת הדם לשכבה לאט מעל מפל הצפיפויות ידי צבת קצה pipet הקרוב מפל הצפיפויות, בכך שהיא מאפשרת את תערובת הדם לרוץ במורד הצד של הצינור מאוד לאט.
    2. בהתאם בסולם של הניסוי, שכבת 10 מ"ל של תערובת דם על גבי 3 מ"ל של שיפוע צפיפות (בתוך שפופרת 15 מ"ל) או שכבת 35 מ"ל של תערובת דם על גבי 15 מ"ל של שיפוע צפיפות (בתוך 50 מ"ל צינור). בדרך כלל, 10 מיליליטר של דם מלא מניב 10 מיליון PBMCs, עם כמה הבדלים תורמים אל התורם.
      הערה: חשוב מאוד כי אין ערבוב של תערובת הדם עם שיפוע הצפיפות. תערובת הדם צריכה שכבה במשך מפל הצפיפויות לעלות לאט עד שכל הדם הוא על גבי שיפוע הצפיפות.
    3. צנטריפוגה תערובת שכבתית ב 700 XG במשך 30 דקות ללא בלמים. centrתערובת ifuged צריך להפריד לתוך 5 שכבות (מלמעלה למטה): פלזמה, מעיל באפי (המכיל PBMCs), חומר שיפוע צפיפות, גרנולוציטים, ו RBCs.
    4. הסר וזורקים את רוב הפלזמה ובזהירות לאחזר את המעיל באפי תוכן (PBMC) לתוך צינור חדש 15 מ"ל בעזרת פיפטה פסטר נורה יניקה.
      הערה: הסרת שכבת מעיל באפי נעשה ביעילות על ידי יישום יניקה על פיפטה פסטר תוך ביצוע תנועה מעגלית סביב החלק החיצוני של השכבה, עם קצה פיפטה נגד הצינור.
  4. לשטוף שלוש פעמים PBMCs המבודד מלוחים pH 7.3 שנאגר פוספט (PBS) על ידי צנטריפוגה ב XG 350 במשך 10 דקות (עם בלמים מלאים) ב בין השוטף. מחדש גלולת PBMC במדיום RPMI מלא. בהתאם לגודל של הגלולה, 3-7 מיליליטר של מדיום מספיק.
  5. ספירת PBMC באמצעות trypan כחול ו hemocytometer. רק לספור אותם תאים שאינם מוכתמים על ידי trypan הכחול. Reconstitut.ה PBMCs כדי 1,750,000 תאים / מ"ל ​​במדיום RPMI מלאה.
  6. זרע 400 μL (700,000 תאים) לבאר כל שקופית 8-קאמרית. דגירה את השקופית תרבות חממה humidified 37 ° C רקמה, מלא (בתוספת 5% CO 2) עבור h 1 לאפשר מונוציטים / מאקרופאגים לדבוק.

2. טיפול מקדים של דבקה מונוציטים

הערה: שלב זה הכרחי רק אם מחפשים דרכים לעכב או לשפר phagocytosis.

  1. טרום לטפל דבקה מונוציטים עם כל תרופה (ים) או תרכובת (ים) של עניין. לשקם את התרופה (ים) או חומר בדיקה אחר לריכוז הרצוי באמצעות מדיום RPMI להשלים.
    הערה: לדוגמה, 200 מיקרוגרם / מ"ל ​​של IVIG משמש בדרך כלל כדי להניב עיכוב 95-100% של phagocytosis בעת שימוש מונוציטים האדם.
  2. לשאוב וזורקי supernatant המכיל את כל תאים שאינם חסידים משקופית 8 הקאמרי לאחר דגירת 1-ח (לאחר שלב 1.6). להחליף אותו עם 400μL של תרופה או טיפול אחר דגירה של 1 ש 'על 37 מעלות צלזיוס.
    1. כאשר aspirating והחלפת פתרונות בשקופית 8-הקאמרית, הקפד לשלוט על זרימת הנוזלים כך תאים דבקים חלש לא להמריא. כמו כן, לעבוד עם רק 2-3 בארות ריקות בכל פעם למנוע התייבשות הבארות.
      הערה: בדרך כלל, כל טיפול מתבצע triplicates הטכנית.

3. Opsonization של R 2 כדוריות הדם האדומות R 2

הערה: R R 2 2 משמש כאן מתקבלת המרכז לאיסוף הדם (שירותי דם קנדיים), אבל הם גם זמינים מסחריים. RBCs R 2 R 2 Opsonized משמשים כביקורת חיובית עבור phagocytosis בתיווך FcγR. R 2 נאיבית R 2 יש לאחסן פתרון של Alsever (כדי להאריך את חיי המדף) בשעה 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש 1. הפתרון של Alsever נעשה ללא צורך במיקור חוץ מורכב 0.8% W / ציטראט Trisodium נ (מימית), 1.9% w / דקסטרוז נ, 0.42% w / v נתרן כלורי, ו 0.05% w / v חומצת לימון (מונוהידראט). אם R 2 R 2 תאים אינם זמינים, תאים Rh-phenotyped אחרים, כגון R 1 R 2, R 1 R 1, R 1 r, או R 2 R, ניתן להשתמש.

  1. לשטוף R 2 R 2 (CDE / CDE) כדוריות דם אדומות PBS בסך הכל שלוש פעמים באמצעות צנטריפוגה ב XG 350 במשך 5 דקות כל אחד.
    הערה: כמות RBCs הצורך תלוי בגודל הניסיוני יכולה להיות גב מחושב. תמיד לשטוף סכום עודף של RBCs, מאז RBCs הם איבדו במהלך כל שטיפה בשל תמוגה או במהלך הסרת supernatant. לדוגמה, בניסוי עם 5 טיפולים 2 שולטת, כולם בשפה triplicates טכנית, יש בסך הכל 21 בארות. 21 בארות עם 400 μL / טוב של תערובת 1.25% RBC מציין כי 105 μL של ארז, opsonized RBC נדרשים. 200 μL של RBC יש לשטוף בתחילה 150 & #181; L צריך להיות opsonized על מנת להבטיח כי יש כמות מספקת של RBCs עבור השלב phagocytosis.
  2. Opsonize גלולה R 2 R 2 נשטף עם 1: 1 v / נוגדנים אנטי D polyclonal נ מ נסיוב אדם דגירה של 1 ש 'על 37 מעלות צלזיוס, עם ערבוב לסירוגין.
    הערה: אם נוגדנים נגד D polyclonal אינם זמינים, ניתן להשתמש נוגדנים אנטי D חד שבטיים, אשר זמינים באופן מסחרי, או-D אנטי משמש בדרך כלל עבור טיפול מונע חיסוני Rh, אשר ניתן להשיג מבנקי דם או עירוי שירותים. בדיקות אופטימיזציה צריכה להתנהל בהתחלה, בעת הגדרת assay, ובכל פעם מיתוג המון נוגדנים polyclonal-titered האו"ם או מעבר נוגדן חד-שבטי. זאת על מנת לזהות את הריכוז או נפח האופטימלי של אנטי D דרוש לצורך בדיקת antiglobulin (IAT) תוצאה של בין 3+ ו 4+ וגם תוצאת phagocytosis של בין 70-90 RBCs phagocytosed ל -100 מונוציטים נספרו.
  3. שטפו את opsonizeR ד 2 R 2 בסך הכל שלוש פעמים PBS באמצעות צנטריפוגה ב XG 350 במשך 5 דקות כל אחד.
    הערה: מוצלח opsonization של R 2 R 2 יכולה להיות מאושרת על ידי ביצוע IAT עקיף. בקצרה, נוגדנים אנטי אנושיים polyclonal משני מתווספים לאגד נוגדני opsonizing עיקריים על משטחי RBC, ואת האות המוגבר ניתן להבחין בצורת hemagglutination. פרוטוקול יצרן מפורט ניתן למצוא בקובץ חומרים המשלים.
  4. מחדש גלולת R 2 R 2 שטף ל -1.25% v / v באמצעות מדיום RPMI להשלים.
    הערה: R opsonized העודף 2 R 2 ניתן לאחסן הפתרון של Alsever ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.

4. Fc קולטן בתיווך Phagocytosis

  1. לשאוב את התרופה או supernatant בינוני משקופית 8 קאמרית ולהוסיף 400 μL של התערובת 1.25% v / v R 2 R 2. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
  2. אָחוֹראה 2 שעות של דגירה, להסיר את התאים באמצעות המתאמים של היצרן. טובלים את R R 2 עודף 2 על מגבת נייר. ודא כי את השקופית לא להתייבש.
  3. ממלאים כוס 100 מ"ל עם PBS. לצלול ולשטוף את השקופית על ידי העברת השקופית לאט קדימה ואחורה (סביב 30-40 משיכות) כדי להסיר את רוב R un-phagocytosed R 2 2.
  4. להסיר את השקופית מן PBS. טובלים את PBS עודף באמצעות מגבת נייר או רקמות ואוויר-לייבש את השקופיות.
  5. תקן את השקופית אוויר יבש מתנול 100% במשך 45 שניות. לאחר מכן, אוויר יבש השקופית הקבועה.
    הערה: שקופיות ניתן קבוע בשיטה אחרת כי היא תואמת יותר עבור מכתים במורד הזרם, כמו כתם גרונוולד-Giemsa 21 או רייט Giemsa כתם 22.
  6. הר השקופיות באמצעות הרכבה בינונית ללא צורך במיקור חוץ מתוצרת elvanol (או אחר בינוני הרכבה זמין מסחרי) ולהוסיף coverslips.
    הערה: הרכבה בינונית Elvanol מורכב 15% w / v polyvinyl שרף אלכוהול 30% גליצרין v / v ב PBS. התערובת מחוממת עד שכל השרף נמס ואת גליצרין הוא מעורב homogenously. זה יכול להיות מוחלף עם מדיום גובר זמין מסחרי אחר.
  7. אפשר בהר לייבוש למשך הלילה לפני כימות.

5. כימות Phagocytosis

  1. באמצעות מיקרוסקופ שלב בניגוד ועדשה 40X אובייקטיבית, לכמת את הכמות ידנית של אירועי phagocytic ידי ספירה לפחות 200 מונוציטים ומספר R R 2 phagocytosed 2 בתוך מונוציטים אלה. יש מונה אחד בכל יד לכמת את מספר זמנית של מונוציטים ומספר R 2 R phagocytosed 2.
  2. השג את מדד phagocytic הממוצע על ידי חלוקת מספר R R 2 phagocytosed 2 במספר מונוציטים ומכפילים אותו 100. אקספרס הנתונים כממוצע (מדד phagocytic הממוצע) ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM).

תוצאות

על ידי ביצוע השלבים המכריעים איור 1 ו ההליך המתואר לעיל, MMA יכול להתבצע reproducibly. IVIG שימש כדוגמה עבור עיכוב של phagocytosis באיור 2. IVIG ידוע להיקשר ולחסום את קולטני Fc, ובכך מעכב את התוצאה במורד הזרם של phagocytosis. על ידי titrating את כמות IVIG בשימוש, עיכוב תלויי מינון הוא ציין, שבו ריכוזים מעל 200 מיקרוגרם / מ"ל הביא קרוב ל -100% עיכוב וריכוזי מתחת ל -0.5 מיקרוגרם / מ"ל לא לעכב בכלל (איור 2 א). כאשר המדדים phagocytic הופכים ו מנורמל שליטה חיובית R 2 R 2 0% עיכוב, עקומת עיכוב עם IC 50 של 3 מיקרוגרם / מ"ל ניתן לקבוע (איור 2 ב).

בנוסף ביצוע assay בעקביות, quantification של assay יכול לפעמים להיות קשה. איור 3 הוא אוסף של תמונות מיקרוסקופ שלב בניגוד שקופיות MMA שונים. עם ניסיון מיקרוסקופיה, ניתן להבחין מונוציטים מתוך RBC זיהום (איור 3D), או vacuole מתוך RBC phagocytosed (איור 3 ב). אשכולות צפופים של תאים ו / או פסולת יש להימנע במהלך (3E הדמוי ו- F) כימות. כמו כן, יש להימנע יתר opsonizing ה- R R 2 2 RBC, מה שיוביל phagocytosis המוגברת overcrowds הפנים מונוציטים ומפריע כימות מדויק (איור 3 ג).

figure-results-1
איור 1. תרשים סכמטי של MMA. צעד אחר צעד תיאור של השלבים המכריעים MMA: בידוד PBMC מדם כולו, להאכיל את monocyt דבקהes עם R R 2 opsonized 2, ועל שטיפת שקופיות קאמרית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
איור 2. תוך ורידי IgG (IVIG) מעכב phagocytosis במבחנה באמצעות MMA. IVIG ידוע כמעכב phagocytosis והוא משמש פקד עיכוב ב MMA האדם. (א) טיטרציה של IVIG הביאה עיכוב תלוי במינון של phagocytosis כאשר לעומת שליטת 2 R R 2 שלא טופלה. התוצאות מראות את ממוצע ± סטיית התקן של הממוצע (SEM) של n = 3 ניסויים. הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות -test t הסטודנט: ** P≤0.01 ו *** P≤0.001. (ב) עקום עיכוב של IVIG עם IC 50 of 3 מיקרוגרם / מ"ל ​​(הקו המקווקו). התוצאות מראות נתונים מנורמלים מטופל R 2 R 2 (עיכוב 0%); ממוצע ± SEM של n = 3 ניסויים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3
איור 3. תמונות מיקרוסקופיה שלב בניגוד שקופיות מדגם בהגדלה 40X. (א) השקופית מושלמת שבה מונוציטים phagocytosed 1-2 R 2 R 2 בממוצע (חיצים שחורים עם זוהר הילה מיוחד), עם קובץ פוגע מעט מאוד, בלתי phagocytosed R 2 R 2 (חצים לבנים) ברקע. (ב) כפי שניתן לראות שקופית זו, מונוציטים לפעמים יש vacuoles מוגדל (חצים לבנים), אשר יכולים להיחשב בטעות R R 2 phagocytosed 2. (C </ strong>) כאשר R 2 R 2 כבר מעל-opsonized, יותר מ 4-5 phagocytosed R 2 R 2 לכל מונוציטים (חיצים שחורים) לדקלם מדויק לספור קשה, מאז R R 2 2 מצטופפים בתוך מונוציטים ותא ברורים גבולות לא ניתן להבחין. (ד) כביסה לקויה של השקופית מובילה זיהום R 2 R 2 בשפע (חצים לבנים), אשר יכול להיחשב בטעות RBCs הדבק. (E) לפעמים, מונוציטים ו RBCs זיהום עלול להיווצר אשכולות. אשכולות להצביע גם זיהום חיידקים, אשר יש להימנע. (F) מונוציטים עלול להיווצר אגרגטים גדולים, אשר יש להימנע במהלך כימות. באמצעות בחירה אקראית של השדות כדי להציג, פנל מה הוא ציין בדרך כלל אם MMA שבוצע כהלכה. סרגל קנה מידה הוא 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאןכדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דיון

MMA היא טכניקה מייגעת הדורש התמחות בתרבות היא רקמות מיקרוסקופיה. ישנם מספר שלבים קריטיים כדי להבטיח הצלחה: 1) דור בשכבה מונוציטים; 2) opsonization של RBCs, ו -3) כימות ידנית. בשכבה מונוציטים אינה נצמדת חזק מאוד לשקופית התא, אז pH פיזיולוגי חייב להישמר לאורך כל assay 11 ו מספר מספיק של PBMCs צריך להיות זורעים. pipetting הנמרץ, אשר עלול להפריע את התאים הדבקים, יש להימנע. גישה אחת היא תמיד להסיר ולהוסיף פתרונות מאותו בפינה של החדר על מנת להבטיח כי הבקשה היא איטית ויציבה. בדומה לכך, במהלך שלב הכביסה האחרון להסיר את עודפי RBCs, התנועה צריכה להיות איטית ויציבה. הדבר מבטיח הפרעה מינימאלית בשכבה ועדיין הסרת רוב RBCs-phagocytosed האו"ם. שטיפת לקוי תוביל רקע גבוה של RBCs זיהום, מה שהופך קואה ידניתntification קשה. שנית, את RBCs R 2 R 2 חייב להיות opsonized מספיק כדי לקבל מדד phagocytic ממוצע של 80-120 על בקרת phagocytosis. מגוון phagocytic הרצוי זו מאזנת בין הקלות הספירה (למשל, מונוציטים עם יותר מ -5 phagocytosed RBCs שקשה לכמת במדויק) ושמירה על כמות נאותה של phagocytosis לניתוח סטטיסטי. מידת opsonization יכול להיות מאושרת על ידי ה- IAT, וכן קריאה בין 3+ כדי 4+ נדרשת. ה- R R 2 2 RBCs אמור להיות מושלך כאשר יש תמוגה עודף במהלך הכביסה, כאשר supernatant הופך לאדום כהה, או כאשר חל קיטון משמעותי phagocytosis הוא ציין בניסויים בשל הזדקנות התאים אחסון. לבסוף, כימות ידנית באמצעות מיקרוסקופ יכולה להיות מסובכת, במיוחד כאשר משווה ספירה בין אנשי מעבדה ובין ניסויים. על ידי בחינה באותו התחום על כל טוב, או פשוט על ידי ספירת תאים נוספיםניתן להשיג, ספירה יותר עקבית. אימון Side-by-side עם טכנאי מנוסה ושימוש סט מיועד של שקופיות אימון מומלץ.

ביקורת גדולה של MMA היא הסובייקטיביות של צעד כימות הידני. עם זאת, עם הכשרה מתאימה, עקביות ניתן להשיג על דלפקים שונים. מגבלה נוספת היא ההבדלים התורם אל התורם מהותי ביכולות phagocytic מונוציטים וב R 2 רמות הביטוי אנטיגן R 2 משטח, אשר מהווה מקור וריאציה נתונים בעת התמודדות עם דגימות אנושיות.

טכניקות חלופיות אחרות זמינות לבחינת phagocytosis בתיווך FcγR. רוב הערכות מסחריות לנצל פלט ניאון כדי לפקח phagocytosis (למשל, bioparticles, חלבון פלואורסצנטי pH רגיש, או חרוזי לטקס ניאון שכותרתו IgG). שימוש פלט פלורסנט האם להציע כימות אובייקטיבי יותר, אבל צריך גם להונותסדר את הזמינות, עלות, והכשרה הקשורים לשימוש של מיקרוסקופ פלואורסצנטי או cytometer זרימה, כמו גם את התלות שהתפתחה על ערכות זמינות מסחרי.

לבסוף, assay זה יכול להיות שונה בהתאם לשאלת המחקר. לדוגמה, כאשר בודקים עיכוב התרופה של phagocytosis, מונוציטים יכול להיות מראש שטופלו או מודגרות שיתוף עם שני הסמים RBCs opsonized (כלומר, assay התחרות). את האיתות במורד הזרם של נוגדנים של תת-סוגים שונים, נוגדנים כימרי, או בונה רקומביננטי יכול להיות גם נבדק. עם פריצות הדרך אחרונות בפיתוח של דם אנטיגן-null אוניוורסלי 24, MMA יכול להיות מנוצל מסך ראשוני של RBCs אנטיגן-null אלה עם נוגדנים שונים כדי להעריך האם אכן קיימת יעילות וריד מעורר phagocytosis.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מודים לשירותי הדם הקנדיים על פרס תוכנית המלגות לתארים מתקדמים ל-T.N.T. מחקר זה קיבל תמיכה כספית מהמרכז לחדשנות של שירותי הדם הקנדיים, במימון הממשלה הפדרלית (Health Canada) ומשרדי הבריאות המחוזיים והטריטוריאליים. הדעות המופיעות כאן אינן משקפות את העמדות של הממשלות הפדרליות, המחוזיות או הטריטוריאליות בקנדה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שואבי אבק חומצה ציטראט דקסטרוז (ACD)BDREF364606
RPMI 1640SigmaR8758
HEPESBioshopHEP003.100
סרום בקרעוברי רב תאי 080150
GentamicinGibco15710-64
Ficoll-Paque PLUSGE17-1440-03https://www.gelifesciences.com/
תמיסת מלח חוצצת פוספטSigmaD8537
שקופיות 8 חדריםLab-Tek-ll154534
R2R2 (cDE/cDE) תאידם אדומיםשירותי הדם הקנדייםזמינים מסחרית (למשל , http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells)
ניתן להחליף את SigmaP8136בתושבת זמינה מסחרית
UltraPure glycerineInvitrogen15514-011
תלושי כיסויVWR48366 067
Novaclone anti-IgGImmucorgamma5461023אופציונלי עבור IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/.../ucm081743.pdf)
אנטי-D רב-שבטי מסרום אנושי Gamma Biologics DIN 02247724 ניתן להחליף באנטי-D חד-שבטי זמין מסחרית או ב-Rh אימונוגלובולין 100% מתנול קלדון 6700-1-42 שרף אלכוהול פוליוויניל

מקורות

  1. Hunt, J. S., Beck, M. L., Hardman, J. T., Tegtmeier, G. E., Bayer, W. L. Characterization of human erythrocyte alloantibodies by IgG subclass and monocyte interaction. Am J Clin Pathol. 74 (3), 259-264 (1980).
  2. Schanfield, M. S., Stevens, J. O., Bauman, D. The detection of clinically significant erythrocyte alloantibodies using a human mononuclear phagocyte assay. Transfusion. 21 (5), 571-576 (1981).
  3. Branch, D. R., Gallagher, M. T., Mison, A. P., Sysiokian, A. L., Petz, L. D. In vitro determination of red cell alloantibody significance using an assay of monocyte-macrophage interaction with sensitized erythrocytes. Br J Haematol. 56 (1), 19-29 (1984).
  4. Hunt, J. S., Beck, M. L., Wood, G. W. Monocyte-mediated erythrocyte destruction. A comparative study of current methods. Transfusion. 21 (6), 735-738 (1981).
  5. Noumsi, G. T., Billingsley, K. L., Moulds, J. M. Successful transfusion of antigen positive blood to alloimmunised patients using a monocyte monolayer assay. Transfus Med. 25 (2), 92-100 (2015).
  6. Moulds, J. M. Introduction to antibodies and complement. Transf Apher Sci. 40 (3), 185-188 (2009).
  7. Grandstaff Moulds, M. K. Antibody identification. Transf Apher Sci. 40 (3), 195-197 (2009).
  8. Hendrickson, J. E., Tormey, C. A., Shaz, B. H. Red blood cell alloimmunization mitigation strategies. Transfus Med Rev. 28 (3), 137-144 (2014).
  9. Hamilton, J. R. Common and frequently encountered antibodies. Transfus Apher Sci. 40 (3), 189-194 (2009).
  10. Kenna, M. A., Cooper, R. A., Schrieber, A. D. Effect of papain on the interaction between human monocytes, erythrocytes and IgG. Blood. 46 (2), 245-252 (1975).
  11. Tong, T. N., et al. Optimal conditions for the performance of a monocyte monolayer assay. Transfusion. , Epub ahead of print (2016).
  12. Gray, S. J., Sterling, K. The tagging of red cells and plasma proteins with radioactive chromium. J Clin Invest. 29 (12), 1604-1613 (1950).
  13. Mollison, P. L., Veall, N. The use of the isotope 51Cr as a label for red cells. Br J Haematol. 1 (1), 62-74 (1955).
  14. Sebring, E. S., Polesky, H. F. Detection of fetal hemorrhage in Rh immune globulin candidates. A rosetting technique using enzyme-treated Rh2Rh2 indicator erythrocytes. Transfusion. 22 (6), 468-471 (1982).
  15. Downing, I., Templeton, J. G., Mitchell, R., Fraser, R. H. A chemiluminescence assay for erythrophagocytosis. J Biolumin Chemilumin. 5 (4), 243-250 (1990).
  16. Fabron, A. Jr, et al. Application of noninvasive phagocytic cellular assays using autologous monocytes to assess red cell alloantibodies in sickle cell patients. Transfus Apher Sci. 31 (1), 29-35 (2004).
  17. Michelis, F. V., et al. Acute hemolysis after intravenous immunoglobulin amid host factors of ABO-mismatched bone marrow transplantation, inflammation, and activated mononuclear phagocytes. Transfusion. 54 (3), 681-690 (2014).
  18. Rampersad, G. C., et al. Chemical compounds that target thiol-disulfide groups on mononuclear phagocytes inhibit immune mediated phagocytosis of red blood cells. Transfusion. 45 (3), 384-393 (2005).
  19. Purohit, M. K., et al. Structure-activity relationships of pyrazole derivatives as potential therapeutics for immune thrombocytopenias. Bioorg Med Chem. 22 (9), 2739-2752 (2014).
  20. Neschadim, A., Kotra, L. P., Branch, D. R. Small molecule phagocytosis inhibitors for immune cytopenias. Autoimmun Rev. 15 (8), 843-847 (2016).
  21. Fitzer-Attas, C. J., et al. Fcgamma receptor-mediated phagocytosis in macrophages lacking the Src family tyrosine kinases Hck, Fgr, and Lyn. J. Exp Med. 191 (4), 669-682 (2000).
  22. Allhorn, M., et al. The IgG-specific endoglycosidase EndoS inhibits both cellular and complement-mediated autoimmune hemolysis. Blood. 115 (24), 5080-5088 (2010).
  23. Li, L., et al. Inhibition of phagocytic recognition of anti-D opsonized Rh D+ RBC by polymer-mediate immunocamouflage. Am J Hematol. 90 (12), 1165-1170 (2015).
  24. Kwan, D. H., et al. Toward efficient enzymes for the generation of universal blood through structure-guided directed evolution. J Am Chem Soc. 137 (17), 5695-5705 (2015).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בליעת תאים המתווכת קולטני Fcבליעה מתווכת נוגדניםתאים גרנולוציטיים מהדם ההיקפי (PBMCs)אופסוניזציה של כדוריות דם אדומותמיקרוסקופיית ניגודיות פאזהמיקרוסקופיה פלואורסצנטיתWestern Immunoblottingעיכוב באמצעות גלובולין חיסוני תוך-ורידיבדיקה של רפואת עירוי
שימוש Assay מונוציטים חד שכבתי להערכת Fcγ קולטן בתיווך Phagocytosis
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.