מאמר שיטה

מתכות הדמיה ברקמת המוח על ידי אבלציה לייזר - פלזמה מצמידים אינדוקטיבי - ספקטרומטריית מסה (LA-ICP-MS)

23.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55042

⸱

22 בינואר 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Elemental Bio-imaging Facility, University of Technology Sydney, 2Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, The University of Melbourne, 3Department of Pathology, The University of Melbourne, 4School of Earth Sciences, The University of Melbourne, 5Research School, Ruhr University, 6Department of Physiology, Monash University, 7ESI Ltd., Bozeman, 8Agilent Technologies, Mulgrave

במאמר זה

סיכום

כמותית מיפוי מתכות ברקמות ידי אבלציה ליזר - אינדוקטיבי פלזמה מצמידה - ספקטרומטריית מסה (LA-ICP-MS) הנה שיטה אנליטית רגישה שיכול לספק תובנה חדשה איך מתכות להשתתף בתהליכי פונקציה ומחלות נורמלים. כאן אנו מתארים פרוטוקול הדמית מתכות כמותית בסעיפים דקים של רקמת נוירולוגית עכבר.

תקציר

מתכות נמצאות בכל מקום בגוף לאורך אורגניזם, עם התפקיד הביולוגי שלהם מוכתב על ידי שתי התגובה הכימית שלהם ושפע בתוך אזור אנטומיים ספציפי. בתוך המוח, יש מתכות חלוקות ממודר ביותר, בהתאם לפונקציה העיקרית שהם ממלאים במערכת העצבים המרכזית. הדמית הפריסה המרחבית של מתכות ספקה תובנה ייחודית הארכיטקטורה ביוכימי של המוח, מה שמאפשר קשר ישיר בין אזורי neuroanatomical ותפקוד הידועים לגבי תהליכי מתכת תלויה זה בזה. בנוסף, מספר הפרעות נוירולוגיות הקשורות לגיל תכונה שיבשו הומאוסטזיס מתכת, אשר מוקף לרב לאזורים קטנים של המוח שקשה אחרת לנתח. כאן, אנו מתארים שיטה מקיפה מתכות הדמיה כמותית במוח העכבר, באמצעות אבלציה לייזר - מצמידים אינדוקטיבי פלזמה - ספקטרומטריית מסה (LA-ICP-MS) ו ומעוצבת עיבוד תמונהתוֹכנָה. התמקדות ברזל, נחושת ואבץ, שהן שלוש של מתכות הנפוצות ביותר ומחלות רלוונטיות בתוך המוח, אנו מתארים את הצעדים החיוניים בהכנה מדגמת, ניתוח, מדידות כמותיות ועיבוד תמונה כדי לייצר מפות של הפצת מתכת בתוך מיקרומטר הנמוך מגוון רזולוציה. טכניקה זו, החלים על כל קטע רקמה לחתוך, הוא מסוגל להדגים את ההפצה משתנה מאוד של מתכות בתוך איבר או מערכת, וניתן להשתמש בו כדי לזהות שינויים הומאוסטזיס מתכת ורמות מוחלט בתוך מבנים אנטומיים בסדר.

מבוא

כימית החיזור הייחודית של מתכות מקלות מגוון של פונקציות נוירולוגיות, כולל העברת אותות, ייצור אנרגיה וסינתזה הנוירוטרנסמיטר. בכמה מחלות ניווניות הגדולות, dyshomeostasis של מתכות אלה היו שניהם מעורבים בהיווצרות המחלה וזוהו מטרות הרומן פוטנציאל ההתערבות הטיפולית 1. כדי להבין טוב יותר כיצד מתכות מעורבות בתנאים כגון מחלת פרקינסון אלצהיימר (AD ו PD, בהתאמה), הוא הכרחי כדי להיות מסוגל למדוד כיצד הפצת רמות מתכת להשתנות בתוך האזורים מושפעים לרעה את תהליך המחלה. שינויים אלה הם בדרך כלל מעידים על משמרות עדינות תגובות ביוכימיות שעשויות להיות קשורה באופן הדוק לתהליכים ליזום מוות של תאים, כגון המנגנון המוצע שלנו לאחרונה neurotoxicity ברזל הדופמין PD 2.

באופן מסורתי, מטארמות L בתוך אזורי אנטומיים מוגדרים הושגו באמצעות כריתה זהירה, עיכול וניתוח באמצעות מגוון של שיטות אנליטיות 3. עם זאת, גישה כזו מאבדת מידע מרחבים, אשר יכולה להיות קריטי כאשר מצבי מחלה נחקרים לערב קטן, אזורים מוגדרים היטב או סוגי תאים מסוימים. מספר שיטות אנליטיות זמינים המאפשר הדמיה מתכות במערכות ביולוגיות, ממדגמים שלמים סעיפים רקמות לשניים שלושה ממדים, באמצעות ספקטרוסקופית פליטה, בדיקות ניאון ו ספקטרומטריית מסה 4. יש טכניקה כל יתרונות וחסרונות לגבי רגישות, הסלקטיביות של מינים כימיים, ואת ברזולוציה מרחבית כי יכול להיות מושגת. לסקירה מקיפה של המגוון של טכניקות זמינות, לראות את הסקירה על ידי ואח 'הייר. 5.

ספקטרומטריית מסה (MS) מבוססת שיטות הם הרגישים ביותר של טכניקות אלה, מסוגל למדוד מתכות הרלוונטיות ביותר מבחינה ביולוגית בריכוז מולדתם 6. אבלציה לייזר - אינדוקטיבי פלזמה מצמידים - ספקטרומטריית מסה (LA-ICP-MS) הדמיה מעסיקה קרן לייזר אולטרה סגול ממוקד החל בגודל מ -1 עד> 100 מיקרומטר קוטר (או רוחב, כאשר צורה קרן מרובע משמש), לפיו מדגם מועבר 7. מידע כמוני יכול להיות מושג באמצעות אבלציה נציג חומרי התייחסות רגילות, אשר ניתן להפיק באמצעות מגוון של גישות שונות 8, כל אחד עם דרגות שונות של קושי טכני ומעשיות אנליטי. הגישה הנפוצה ביותר משתמשת התאמת מטריקס, שבו סטנדרט עם הרכב כימי שלטת דומה לזה של המדגם הוא הוכן על ידי spiking עם אנליטי היעד והעריך במדויק עבור ההומוגניות וריכוז מתכת מוחלטת באמצעות אנליטית עצמאית 9, 10. אבלציה של סטנדרטים מוכנים לאחר מכן ניתן להשתמש למטרות כיול חיצוניות, מה שמאפשר נתוני ריכוז מהתמונה מדגמת כתוצאה להיעקר לפיקסל.

רזולוציית התמונה נקבעת על ידי שני לגודל הקורה ואת המהירות שבה המדגם נסרק. העיצוב-quadrupole תקן ICP-MS (המהווים למעלה מ -90% מכלל מערכות ICP-MS מותקן ברחבי העולם 11) הוא מנתח המוני חוזר, כי מחזורי הגלאי ההמוני בעזרת כל יחס מסה-התשלום שנבחר (m / z ) ולא איסוף נתונים בו זמנית. לכן, בפעם הרכישה עבור כל מחזור של המונים חייבת משווה את הזמן שלוקח המדגם לעבור רוחב אחד של קרן הליזר על מנת להבטיח נציג פיקסל של הרזולוציה הרצויה הוא רכש 12. בחירת גודל אלומת ליזר היא פרמטר קריטי כי יש השפעות משמעותיות על רגישות הוא וזמן ניתוח כולל. כפי physi אבלציה לייזרקאלי מסיר חומר הוא נסחף אל ICP-MS על ידי גז מוביל ארגון, כמות החומר כי ניתן לאתר פיזי על ידי מסת Analyzer עומדת בדרישות החוק ההפוך הכיכר. לדוגמה, הפחתת קוטר אלומת לייזר 50 - 25 מיקרומטר התוצאה היא הפחתה של חומר ablated בפקטור של ארבעה. בנוסף, כשיטה סריקה, בקטרים ​​קרן קטנה להאריך את משך הזמן הכולל הנדרש כדי לקטוע לאזור הנבחר. לכן, תכנון ניסוי חיוני לאזן את הרזולוציה המרחבית ההכרחית עם צורכים רגישים אילוצי זמן.

הדמיה על ידי LA-ICP-MS הוחלה מגוון של דוגמאות, מטריצות מדינות מחלה, כוללת מודלים של בעלי חיים של הפרעות נוירולוגיות 13, 14, פגיעה מוחית טראומטית 15, חלוקת תרופות נגד סרטן המכיל מתכת 16, חשיפת toxicant בשליה distr 17 ומתכתibution בשיניים כמו סמן ביולוגי של מעברים תזונתיים בתחילת החיים. 18 בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטה כללית הדמיה ברזל, נחושת ואבץ במוח העכבר WT ברזולוציה של 30 מיקרומטר, למרות שזה יכול להיות מותאם בקלות למגוון של סוגי המדגם ותוצאות הניסוי, על בסיס הצרכים של מְנַתֵחַ.

פרוטוקול

ההליכים המתוארים במסמך זה אושרו על ידי ועדת האתיקה Animal הווארד פלורי לדבוק המועצה הלאומית למחקר בריאות ורפואה סטנדרטים של טיפול בבעלי חיים.

1. הכנת דגימה לצורך ביצוע אנליזה

הערה: שלב זה משתנה בהתאם מטריקס מדגם להיות מנותח.

  1. הכנה חתך לדוגמא
    הערה: קיבוע באמצעות paraformaldehyde 4% (PFA) ו cryoprotection ב סוכרוז 30% ב 0.1 M PBS תגרום כמויות משתנות של שטיפת מתכות מרקמות. ראה הייר ואח 19 לקבלת פרטים ספציפיים. ודאו כי כל הדגימות עברו שלבי קיבעון cryoprotection זהים.
    1. Transcardially perfuse החיה מורדמים עם PBS קר כקרח 0.1 M, pH 7.4 (ראה פרק שיטות Dodt et al. 20 לפרטים נוספים) ולהסיר את המוח.
    2. מניחים את המוח ב 4% PFA O / N כדי לתקן את הרקמה.
    3. cryoprotect המוח על ידי הצבת אותו סוכרוז 30% ב 0.1 M PBS למשך 24 שעות, ולאחר מכן כדי לשנות סוכרוז 30% טרי למשך 24 שעות. 19
    4. להקפיא את המוח בתוך cryostat ב -20 מעלות צלזיוס במשך לפחות h 1.
    5. הר המוח על צ'אק באמצעות הרכבה בינונית מתאימה.
    6. סעיף המוח על cryostat באמצעות סכין חד פעמי ללא מתכת (למשל, polytetrafluoroethylene [PTFE] מצופה סכינים) ו הר בשקופית מיקרוסקופ רגילה. העובי האופטימלי עבור המקטע צריך להיות כ 30 מיקרומטר.
  2. אם באמצעות דגימות-מוטבע פרפין, סעיף ב לעובי הרצוי, לצוף את הסרט על אמבט מים חמים הר בשקופיות מיקרוסקופ רגיל.
    הערה: השפעות מדויקות של קיבעון לטווח ארוך פרפין והטבעה של דגימות ביולוגיות אינן ידועות. כפי שתואר בסעיף 1.1, להבטיח כל הדגימות עברו הליכי הכנת המדגם זהים אם מיועד ניתוח השוואתי.
    1. Dewax paraffin-מוטבע דגימות על ידי טבילת השקופיות ב 3 שינויים של קסילן, 1 שינוי אחד: 100% אתנול, 95% אתנול, אתנול 70% ומרווח של לפחות 3 שינויי ISO 3696 או מים מטוהרים שווים ערך (להלן, המכונות ' מים "; לראות הייר ואח 21 עבור שיטה מפורטת)..
  3. אפשר דגימות אוויר יבש למשך כ 1 ח בסביבה ללא אבק, כגון תיבת שקופיות עם דגימות להציב במאונך מתלים והמכסה נשארה פתוחה לרווחה.

2. הכנת תקנים מטריקס בהתאמה

הערה: להלן פרוטוקול סיכם שפורסם 9 בעבר. יש להתייעץ עם הנייר המקורי לקבלת הוראות מפורטות להכנת סטנדרטי רקמה בהתאמת מטריקס.

  1. השג מוחות כבש מסחריים (או דומה) ולשטוף במים, הסרת כל הדם ורקמות חיבור.
  2. באמצעות אזמל, בזהירות לנתח כ 50 גרם של קליפת המוח tissuדואר חלקית homogenize באמצעות homogenizer רקמות כף יד עם בדיקת פוליקרבונט פנויה על חשמל נמוך. מחלקים ל 5 aliquots גרם, עם המספר תלוי בטווח הכיול ומספר נקודות כיול הרצוי.
  3. הכינו פתרונות של מתכות לספייק כל תקן ידי המסת מלח מסיס של כל אנליטי (למשל, FeSO 4 · H 2 O) ב 1% חומצה חנקתית לייצר 0.1, 1 ו -100 מ"ג מניות מתכת מ"ל -1.
  4. הוספת נפח טרום מחושב של פתרון המניות לרקמת 5 גרם aliquoted (למשל, 5 μL של 10 מ"ג המ"ל -1 עבור ריכוז סופי משוער של 10 מיקרוגרם g -1 רקמות רטובות) כדי להשיג מגוון של רמות מתכת הממוסמרות ב כל תקן.
    1. בהתאם לריכוז הסופי הרצוי של כל תקן, להשתמש בשילוב של כל פתרון מתכת מנייה כדי להבטיח את הכמות המזערית של פתרונות מתווספים הסטנדרטי. הוספת ספייק סופי של מים לכל סטנדרטי כדי להבטיח שוהכרכים ערכיים של נוזל הוסיף שוהים כל תקן.
    2. Homogenize בסטנדרטים משופדים על צריכת חשמל נמוכה כ 30 שניות. אם לא כדי לשמש מייד, לשמור קפוא ב -20 מעלות צלזיוס צינורות פוליפרופילן כתרים חתומים Parafilm.
  5. קבע את הריכוז והומוגניות המדויקים של כל תקן באמצעות באחד ההליכים הבאים:
    1. עיכול מיקרוגל
      1. מניחים 6 שקל במדויק (כ 50 מ"ג) aliquots של תקן בתוך כלי העיכול PTFE שטף ולהוסיף 4 מ"ל של מרוכז (65%) חומצה חנקתית 1 מ"ל של מי חמצן 30%. חותם ולעכל ב 500 W למשך 30 דקות.
      2. לאחר הקירור הספינה העיכול, פתוח במנדף וכמותית להעביר הפתרון מתעכל כדי צינור חומצה שטוף 50 מ"ל באמצעות 10 aliquots מ"ל מים. הפוך בכ 50 מ"ל, ובאופן מדויק לשקול את המסה של הפתרון הסופי.
      3. חזור על שלבי 2.5.1.1 - 2.5.1.2 עבור כל תקן.
    2. השתמש בהליך הבא אם מדובר בציוד עיכול במיקרוגל אינו זמין:
      1. מניחים שש למדוד במדויק (בין 25 - 200 מ"ג) aliquots לסטנדרטים לתוך צינור פוליפרופילן חומצה שטף / מתכת-חופשית Lyophilize O / N.
      2. הוסף 40 μL של חומצה חנקתית מרוכזת חום, לא אטום, על בלוק חימום עד 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן להוסיף 10 μL של מי חמצן 30%. חום במשך 5 דקות נוספות, ולאחר מכן לבצע במדויק 1 הנפח הכולל מ"ל באמצעות 950 μL של חומצה חנקתית 1%.
        הערה: מומלץ לעכל חומר ייחוס מאושר באמצעות שיטת הבחירה על מנת להבטיח נהלי עיכול מדויקים.
  6. קבע את ריכוז המתכת בכל פתרון לעכל באמצעות עִרפּוּל פתרון ICP-MS פרוטוקול סטנדרטי. הערכת ההומוגניות של כל תקן ידי קביעת סטיית התקן היחסית (RSD%) בין כל aliquot. ודא% RSDs כל נפילה בתוך 15%. באמצעות המסה הנמדדת של each aliquot, לחשב את ריכוז המתכת המדויק של כל תקן רקמות הומוגני.
  7. חוזר על תקן רקמות הומוגני, לארוז עובש היסטולוגיה פלסטיק חד פעמי 5 x 5 מ"מ ולהקפיא -pentane iso מקורר בחנקן נוזלי. הסר את בלוק תקן רקמות הקפוא מהתבנית והסעיף על cryostat באותו העובי כמו המדגם.
    הערה: מומלץ להכין מספר סעיפים ב משתנים עוביים ניסויים עתידיים. סטנדרטי אוויר מיובש ניתן לאחסן לזמן בלתי מוגבל במכל אטום לאוויר ונטול אבק.

3. הכנת LA-ICP-MS לניתוח

  1. סטנדרטי מקום מדגם בתא אבלציה, להבטיח כי הם בתוך עומק השדה של מצלמת CCD מצוידת ביחידת LA. אם הכוונון של המכשיר יש צורך, כולל חומר ייחוס מתאים (למשל, NIST 612 יסודות קורט ב זכוכית). אצבע להדק את שני הברגים בדלת תא לאטום התא דואר אבלציה.
  2. ב התוכנה ICP-MS, בחר לפתוח את שסתום גז ארגון ב 'תחזוקה' או לוח דומה ולהגדיר את זרימת הגז המוביל 1.2 L דקות -1 בתיבת הדו-שיח המתאימה.
    הערה: ארגון פרוטוקול זה משמש כגז המוביל. כמה דוגמאות להשתמש גם הליום או תערובת של הליום וארגון כגז מוביל. ראה גינטר והיינריך 22 לפרטים טכניים באמצעות תערובות הליום וארגון כמו גזים המוביל בתרסיס.
  3. בתוכנה LA, לחץ על כפתור 'טיהור' כדי לשטוף את התא עם גז ארגון למשך תקופה מינימלית של 30 דקות.
    הערה: זמן טהר ניתן לשנות על ידי לחיצה על 'זמן לטהר' או כפתור דומה. כאשר באמצעות מערכת אבלציה עם תא אבלציה שני כרכים, מעת לעת לעבור לשלב לכל אחת מן הפינות באלכסון לחצות את התא כדי להבטיח כמה שיותר אוויר שיורית יוסר התא ככל האפשר. זו יכולה להיות מושגת על ידי בחירת 'שלבים הביתה' או equivפונקצית alent.
  4. הפעל את ICP-MS באמצעות לחיצה על 'פלזמה על' ולאפשר להתחמם במשך שתי שעות, שבמהלכן צעדים 3.5 - 4.4 יכול להתבצע. גדרות מכשירות להשתנות בין יצרנים, אם כי דוגמא של תנאי הפעלה מתאימים LA-ICP-MS ניתן למצוא הייר et al. 10.
  5. אבלציה נציג של סטנדרטי רקמות
    1. בחר בכלי הקו למתוח קו יחיד של אבלציה כ ארוך 3 מ"מ על פני שטח הרקמות.
    2. הגדר את הפרמטרים כדלהלן ידי לחיצה ימנית על שורת אבלציה ברשימת הניסוי והשינוי הבא: קוטר הקרן (שנבחר על פי צורך על ידי המשתמש; 30 מיקרומטר קורות משמשים כאן), מהירות סריקה (4 פעמי קוטר האלומה לשנייה; 120 מיקרומטר s -1) ו השטף אנרגיה (0.3 -0.5 ס"מ J -2 עבור רקמות רכות; לייעל במידת הצורך עבור מטריצות יותר). 30 מיקרומטר עובי רקמת קרן הלייזר לא לחדור thic מלאkness של רקמה זו, ביטול מזהמים פוטנציאליים בכל מהתמיכה מיקרוסקופ. נירמול לפחמן 23 יכול לשמש כדי לתקן עבור וריאציה בסך של רקמות ablated. הגדר פרמטרים אלה כברירת המחדל עבור כל שורה לאחר מכן על ידי בחירה בלחצן הבחירה 'ברירת המחדל'.
    3. שכפל את הקו הזה שש פעמים על ידי בחירת הקו הראשוני, הלחיצה ימנית והבחירה 'סריקות כפולות ". הפוך שורות בטוחות מקוזזות כלשהי באחד משני x - או ציר y- ידי קוטר הקרן. זה נותן סך של שבעה קווים לפי תקן, במרווחים בהתאם לקוטר הקורה.
    4. חזור על שלבי 3.5.1 - 3.5.3 עבור כל תקן, הבטחת הקו באורך זהה.
  6. כדי לצייר את האזור אבלציה על המדגם, בצע אחת משתי השיטות הבאות:
    הערה: ודא אותם פרמטרי הסריקה (קוטר קרן, מהירות סריקה, שטף אנרגיה) משמשת קווי מדגם.
    1. אם מערכת LA מצוידתשדה רחב של נוף, בחר בכלי הקו למתוח קו מהפינה השמאלית העליונה של המדגם מספיק זמן כדי לכסות את המדגם בנקודה הרחבה ביותר באמצעות אותם פרמטרי הליזר מפורטים 3.5. שכפל את הסריקה כפי שמתואר 3.5.3 עם שורות רווח לפי קוטר האלומה כמספר פעמים דרושות כדי להבטיח כיסוי מלא של המדגם.
    2. אם נוף שדה רחב אינו זמין, לקבוע ולהקליט את קואורדינטות x ו- y (מוצג בדרך כלל על המסך הראשי כפי עמדת במה "או דומה) מתאימות הפינות של מלבן מכסה את המדגם. השתמש קואורדינטות אלה לתפקיד קווים מקבילים של אבלציה מכסה את אזור הדגימה כולו כמתואר 3.7.1.
    3. צייר קווים עבור סריקה לסירוגין של סטנדרטים לכל המאוחר לאחר ~ 20 שעות של סריקה המדגמת על ידי חזרה על התהליך מתואר 3.5. בהתאם משך הסריקה של המדגם הזה עשוי להידרש מספר פעמים. לסיים את הניסוי עם addiסריקה תזונתית של סטנדרטים.
      הערה: בעת קביעת קואורדינטות x ו- y תוך התא עומד להימחק, בחירת עמדות הביתה הכיול הקשורים המצייר ישנה את רכש בעבר פרטים עבור x ו- y ואילו ההבדל (כלומר אורך הקו) יהיה יושפע.

4. הגדרת שיטות קליטת נתונים עבור ICP-MS

  1. עבור הקו של אבלציה הסטנדרטי, לחלק את אורך הקו על ידי מהירות סריקת ליזר כדי לקבוע את זמן הניתוח הכולל שורה אחת. חזור על פעולה זו עבור הקו המדגם.
  2. ב תוכנת ICP-MS, ליצור שיטה חדשה (המוצגת כאן כ 'יצווה') וודא שאפשרויות 'הזמן נפתר ניתוח "או שווה ערך נבחר. בחר את ערכי m / z כדי להתגלות, ולאחר מכן להתאים את זמן האינטגרציה עבור כל z m / אז בפעם אינטגרציה כוללים מחזור אחד שווה 0.25 s. לחץ על 'בת שמורch כמו 'והשם בהתאם (למשל, std1).
    הערה: ככל המדגם יהיה לחצות את קרן הלייזר בארבע פעמים קוטר קרן, זה מבטיח נקודת נתונים עבור כל מסת נרשם שווה לקוטר קרן 12. למשל, באמצעות גודל נקודה 100 מיקרומטר, ומהירות סריקה של 400 מיקרומטר s -1 עם זמן אינטגרציה של 0.25 s תפיק תמונות בגדלים פיקסל נכון. זמן אינטגרציה יכול להיות מותאם כדי לשפר את הרגישות; כאשר הגדלת זמן אינטגרציה מהירות הסריקה של 0.33 צריך להיות האטה עד שלוש פעמים הקוטר הקורה.
  3. עבור סטנדרטים, הזן את זמן ניתוח לכל קו סריקה בתיבה המתאימה, בתוספת 15 שניות נוספות לתת דין וחשבון על חימום ליזר פעמים כשלון. זן רשימת דוגמאות ריצה (כלומר ההסדר שבו סריקות מנוהלות) עם אותו מספר הרכישות (ברצף ממוספר בדרך כלל; כלומר 001, 002, וכו ') כמו המספר הכולל של קווים רגילים.
  4. למדגם, לחקות את השיטה המשמש את הסטנדרטים על ידי שמירת השיטה או אצווה הנוכחי עם שם קובץ חלופי, ולהתאים את זמן הרכישה הכולל (כולל 15 שניות נוספות) והמספר הכולל של רכישות כדי להתאים את מספר השורות יהיה לקטוע המדגם .
    הערה: כמו רוב מערכות LA-ICP-MS להשתמש הדק חד סטרי (LA מפעילה ICP-MS), זה הכרחי כי תוכנת ICP-MS ממתינה על ההדק מן LA לפני הקו הבא של אבלציה מתחילה. חלון רכישת ICP-MS ייקרא 'מחכה התחל ".

5. הפעלת הניסוי

  1. התחילו את תור ICP-MS על ידי הוספת השיטה או המנה הראשונה לתור ולהבטיח שהתוכנה ממתינה על ההדק ממערכת LA.
  2. בתוכנה LA, ותאפשר אספקת כוח לייזר ידי לחיצה על 'פליטה', ולחץ על 'הפעל' וקבע את שעת חימום לייזר עד 10 s וזמן כשלון כדי 20 שניות בתיבות המתאימות.
    הערה: הצפה זה תהיהלהבטיח את ICP-MS מוכן להתחיל לרכוש נתונים חדשים כאשר הליזר מתחיל כל שורה נוספת של אבלציה.
  3. הפעל את רצף לייזר על ידי לחיצה על 'התחל'. אם באמצעות תא שני כרכים, להבטיח את כוס המדגם נמצאת בעמדה.

6. חישוב התקני כימות

הערה: ישנן וריאציות רבות להמרת נתוני ICP-MS לדימויים. אלה כוללים את השימוש בכלי תוכנת תוצרת בית שנכתבו בשפות קוד פתוח 17, 24, 25, פקודות מאקרו המסחריים 26 ונתוני תוכנת ניתוח. 7 כאן, השתמש תוסף התוכנה שפותח לאחרונה (המתואר פול ואח '. 27), מבוסס על חבילת ניתוח נתוני LA-ICP-MS מיוחד 28.

  1. העבר את כל התיקיות אצווה המכיל את הנתונים לרוץ (001.d, 002.d, וכו.) על אלמחשב נפרד עם תוכנת הניתוח המותקנת. חלץ את קבצי הנתונים * .csv עבור כל שורה של אצווה לתוך תיקייה נפרדת.
    הערה: שימוש תסריט להעביר באופן אוטומטי * קבצי ה- csv לתוך תיקייה חדשה מומלצת מאוד. ראה קוד פייתון המצורף לפרטים נוספים. סקריפט זה נכתב כדי להתאים בין כאדם Agilent 7700 או 8800 סדרה ICP-MS, אבל ניתן לערוך כדי להתאים את קובץ הפלט של יצרנים אחרים.
  2. פתח את פלטפורמת התוכנה ובצע את ברצף הכרטיסיות לייבא ולנתח את הסטנדרטים כדי להפיק תמונות כמותית כמתואר להלן.
  3. כדי לייבא את הנתונים יצוו התקן הראשון, בחר 'Agilent .csv' עבור 'סוג קובץ', 'כל התיקייה' עבור 'סוג היבוא' ולבדוק כי "פורמט התאריך 'מזהה את פורמט המחשב. לחץ על 'ייבוא', בחר את התיקייה המכילה את הקבצים-.csv עבור במערכה הראשונה של סטנדרטים, ולעבור אל הכרטיסייה 'קווי יסוד ".
  4. Baselineחִסוּר
    1. השתמש בכרטיסייה 'הבחירות אוטומטיות' (פקודת 2) מתפריט נפתח היישום העיקרי בסרגל הכלים, בחר 'מידע מיבוא' ולחץ על 'המשך'.
    2. לחץ על 'בחר הכל' ובחר 'Baseline_1' לשילוב.
    3. לבחירת 10 שניות הראשונות של כל קו סריקה (המקביל ל זמן ליזר החימום), לחתוך את הנתונים על-ידי הזנת ערכים השני '0' ו '(משך הקו - 10 שניות)' ולחץ על 'הוסף ואינטגרציות' (למשל עבור קו סריקה של 35, הזן '0' ערכים '25').
  5. כדי לבחור נתוני המדגם, השתמש בכרטיסייה 'אוטומטי הבחירות' כמתואר 6.4, אבל לבחור 'OUTPUT_1' כמו האינטגרציה. נתונים יבול מן ההתחלה ואת הסוף של כל שורה רגילה להוציא את אות הרקע (למשל עבור קו הסריקה של 35, זן ערכים '13' ו '4').
  6. כדי לא לכלול טיפות של האות נגרמת על ידי possiחורי ble בתקנים, בלשונית 'הדוגמות', לחצו על 'ערוצים' בפינה השמאלית העליונה של אזור גרף לבחירת ערוץ עם אות גבוה יחס רעש (למשל, C13 או P31). רשום לעצמך כל ירידות חדות האות ובחר ערך CPS נמוך מספיק, כי הוא מתחת הווריאציה הנורמלית בתוך הדגימות, אך גבוה מספיק כדי לברור את ירידות חדות האות.
  7. לחץ על הכרטיסייה 'DRS' ובחר 'Baseline_Subtract' עבור 'התכנית לצמצום הנתונים הנוכחית'. בחר את הערוץ מ -6.6 עבור מדד ערוץ 'ואת ערך CPS עבור' סף להשתמש כאשר מיסוך אותות נמוכים ". הכנס ערך <0.5 s עבור 'שניות לקצץ לפני / אחרי אותות נמוכים "לתת דין וחשבון על העיכוב בהעברת אותות מן הלייזר אל ICP-MS.
  8. כדי לאשר מיסוך נאות בתחומי האות הנמוכים, לחץ חזרה אל הכרטיסייה 'הדוגמות' ולבחור מעובד (למשל., Fe56_CPS) עקבות ערוץ. חזור ולזקק את CPS ו & #39; שניות לקצץ לפני / אחרי ערכים 'אותות נמוכים כמו 6.7 במידת הצורך.
  9. לחץ על הכרטיסייה 'התוצאות' ובחר 'נתוני יצוא' מתפריט נפתח היישום העיקרי. זן שם קובץ כדי ליצור קובץ נתוני גיליון אלקטרוני של התוצאות (למשל, חישובי std1, Std2 ...).
  10. פתח את קובץ הנתונים בתכנית גיליון אלקטרוני מתאימה ולחשב את ערכי CPS עבור כל ערוץ פרט להיות ונרשמים. השתמש ריכוזי מתכות מראש מן עִרפּוּל פתרון ICP-MS כדי לחשב את מקדם המרה מערכי CPS כדי ppm (-1 גרם מיקרוגרם) עבור כל רכיב לכימות.
  11. חזור על שלבי 6.3 - 6.10 עבור כל הסטים של סטנדרטים בטווח.

7. בניית תמונות כמותי

  1. כתוב 'Biolite ()' ב בשורת הפקודה כדי לפתוח את התוכנה.
  2. ייבא את נתוני המדגם ידי לחיצה על 'טען תמונות' ו בחירת התיקייה המכילה את הקבצים-.csv FOr התמונה מדגם.
  3. תיקון רקע
    1. לחץ על הכרטיסייה 'קווי היסוד "כדי להחיל תיקון רקע למדגם. על זרחן (P31) תמונה הנחיה על המסך, באזורים נבחרים של רקע שימוש באפשרות תיקו מלבן. בחירה כמה אזורים ככל האפשר יוצר מפת תמונה ברוחב של סחיפת אות / פלזמה כדי להבטיח פיצוי הולם מגורמים מבלבלים אלה.
    2. כדי להפוך את אות הרקע גלויה יותר, בחר בכלי עריכת גרף (פינה ימנית העליונה של התמונה המוצגת) ו קליק ימני על התמונה. "שינוי מראה תמונה 'בחר ולשנות את' הצבע הראשון ב Z = 'לערך שלילי גדול (למשל 100,000). המשך בלחיצה על 'סיום'.
  4. לחץ על הכרטיסייה 'התקנים' כדי להעלות שולחן גורמי תיקון CPS / ppm. זן ערכים מחושבים מן הסטנדרטים בשלב 6.10 עבור כל האלמנטים. צעד זה יסייע לתקן עבור הסחיפה הרגישה ICP-MS. לחץ על 'המשך! '
  5. "עיון בנתונים 'פתח מהכרטיסייה' הנתונים ', אשר מחזיקה את התמונות עבור כל רכיב וכל צעד.
  6. כדי לסיים דימוי לייצוא, לבחור את התמונה הרצויה בתיקיית 'StdCorrImages', לחץ לחיצה ימנית על שם התמונה (* _ppm) ולחץ על 'NewImage'. לחץ לחיצה ימנית על התמונה כדי לפתוח "שינוי מראה תמונה 'כדי לבחור סולם צבעי שולחן צבע רצוי. הוסף סולם צבע לתמונה על ידי לחיצה ימנית על התמונה ובחירה 'הוסף ביאור'. הבחירה 'ColorScale' מהתפריט הנפתח השמאלי העליון ולהשתמש בכרטיסיות כדי לשנות את סולם צבעים הרצוי.
  7. כדי לייצא תמונה, לוודא כי התמונה המדוברת נבחרה ונווט אל הכרטיסייה 'קובץ' ולחץ על 'שמור גרפיקה ... ". בחר את הפורמט הרצוי ולשמור את התמונה. לחלופין, התמונה שנבחרה ניתן להעביר באמצעות כלי ההעתקה והדבקה.
  8. חזור על שלבים 7.6 ו -7.7 עבור כל התמונות של עניין.
  9. Quantifיינג אזורים דיסקרטיים
    1. כדי להפעיל את כלי ROI, נווט אל הכרטיסייה 'ניתוח', 'חבילות' ובחר 'עיבוד תמונה'.
    2. בחר את התמונה הרצויה ונווט אל הכרטיסייה 'תמונה' ולחץ על 'ROI ...'. לחץ על 'התחל ROI תיקו' ולהשתמש בכלי ציור כדי לבחור אזור של עניין המדגם. לסיום, לחץ על 'סיום החזר על השקעה ".
    3. כדי לרכוש את הנתונים הסטטיסטיים עבור ROI שנבחרו, נווט אל הכרטיסייה 'תמונה' ולחץ על 'סטטיסטיקת ...'.
    4. העתק והדבק את התוצאות לגיליון אלקטרוני נפרד. מבחר ROI חזור (7.9.2) עבור כל האזורים ואלמנטים של עניין.

תוצאות

כדי להדגים את היכולות של זו גישת הדמית LA-ICP-MS, ניסוי פשוט באמצעות קטע בודד של מוח עכבר WT C57BL / 6, נחצה על כפיס המוח מחולק במישור העטרה, מוצג. זרימת עבודה לניתוח נתונים באמצעות Biolite (איור 1), כמתואר בסעיפים 6 ו -7, וכן למתן תמונה מייצגת של הפצת מתכת בחלק נתח (איור 2) מתוארת גם.

כפי שניתן לראות, הפצת מתכת במוח העכבר הוא משתנה בהתאם לאזור אנטומי. זה ניתן לייחס מתכות התפקידים משתנות, ובאופן ספציפי החלבונים שאליו הם מחויבים, לשחק בכל אזור במוח 27. למשל, ברזל נוטה להיות ריכוזים גבוהים יותר במוח התיכון ולאורך gyrus המשוננת, ואילו אבץ הוא נפוץ ביותר קורטיבאזורי קאל. פחמן, שהנו תקן נפוץ פנימי 8, מופץ homogenously. מפות Elemental (איור 2) יכול להיות שימושי במיוחד כאשר הפועל בשיתוף עם אטלסים התייחסות אנטומיים הקיימים ופונקציונלי 29, שבו מידע על colocalization של מתכות יכול הביטוי של חלבונים ספציפיים מחייבים מתכת יכולים לספק תובנה לתוך הפונקציה של מתכות בתוך המוח באזור, או בשל שינויים ברמות מתכת בקנה אחד עם biomolecule מחלות הקשורות מזוהה. באמצעות הגישה המתוארת, אשר מותאמת במיוחד עבור מגוון רחב יותר של analytes, עושה למנוע רגישות לאלמנטי שפע נמוכים כגון מנגן, ושיטות ניתן להתאים להתמקד בעיקר אנליטי זאת על ידי הגדלת פעמים להתעכב על חשבון המונים מדודים אחרים.

היתרון העיקרי בשימוש הדמיה ידי LA-ICP-MS הוא התבוננות ההבדלים יחסית concentr מתכתation והפצה בין קבוצות ניסוי. השתמשנו בעבר טכניקה כזו להפגין ברזל מוגבר בעקבות עלבון עצבי מחק PD 2, 10, ושינויים ברמות ברזל קליפת מוח ברקמת מחלת אלצהיימר אנושי 21. כזה פרוטוקול כמתואר כאן ניתן להתאים בקלות לכל סוג רקמה אחר עם תיקונים מינימאליים מהשיטות המפורטות.

figure-results-1
איור 1: Workflow עבור עיבוד תמונה. Workflow משלים סעיפי 6 ו -7, מתארי מרה של נתוני זמן לפתור גלם מן ICP-MS לתמונות כמותי של הפצת מתכת במוח העכבר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
איור 2: התפלגות Elemental אופיינית של Biometals בתוך עכבר המוח. מפות אלמנט נציג של קטע עטרת 30 מיקרומטר בעובי של חץ מוח עכבר אחת נתח עם LA-ICP-MS. תמונות עבור פחמן 13 (C13), מגנזיום-24 (Mg24) וזרחן-31 (P31) מוצגות קשקשי צבע זהב (ספירה לשנייה; CPS) (בשורה העליונה). תמונות כמותי (בשורה התחתונה) מנגן-55 (Mn55), נחושת-63 (Cu63), ברזל-56 (Fe56) ואבץ-66 (Zn66) מוצג עם קשקשים צבע BlueHot המתאים (מיקרוגרם g -1). זמן הניתוח סך סעיף המוח היה כ 5 שעות. סרגל קנה מידה = 2 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

קוד משלים קובץ 1. קוד פייתון קוד הפתוח מתואר 6.1, אשר יכול להיות שונה באמצעות עורך פייתון מתאים בהתאם לשיטה של יצרן ICP-MS של פלט נתונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

דיון

מתכות הדמיה ברקמות נוירולוגיות הן רק דוגמא אחת לאופן שבו פרוטוקול זה יכול לספק מידע שימושי על החלוקה וכמויות של מתכות בכל דפוס ביולוגי. למרות הכנת חומרי עזר רגילים יכולה להיות מפרכת, זה ניסוי שניתן לבצע אחת בארכיון לשימוש מאוחר יותר.

יש LA-ICP-MS יתרונות מסוימים על פני שיטות חלופיות, כגון מיקרוסקופ פלואורסצנטי סינכרוטרון המבוסס רנטגן, בעיקר במונחים של נגישות ורגישות. עם זאת, ישנם חסרונות מסוימים שיש לשקול בעת הכנת ניסוי בעזרת LA-ICP-MS, וככזה הוא לעתים קרובות בטכניקה משלימה שימוש הדמיה כימית הכוללת טכניקות ניתוח מטאל אלטרנטיביות, כמו גם השוואת היסטוכימיה 5.

מערך עם תכונות ידועות האנטומי של מוח העכבר יכול לספק מידע שימושי על relati הפונקציונלי האפשריonship בין רמות מתכת הפריסה המרחבית. בעבר, השתמשנו משאב המקוון אלן מוח האטלס, 29 אשר מהווה מאגר גישה פתוחה של שני נתוני ביטוי אנטומי גנים במוח העכבר C57BL / 6 לבחון קורלציה מרחבית של שניהם ביטוי אנזים המתכת תלויה 14 ו הנוירואנטומיה 27, 30. משאבים נוספים, כגון Workbench מכרסם המוח 31 זמינים גם כדי לסייע עם רישום ויישור של תמונות מתכת כדי לסייע בזיהוי הנכון של הפצת מתכת באזורים אנטומיים קטנים לעתים קרובות.

יישומים של הטכניקה הזו הם מועילים בהערכה כיצד רמות מתכת ושינוי הפצת microscale היא ברחבי אירועי חיים נורמלים (למשל, הזדקנות) ובמדינות מחלה; כמו גם בדיקת ההשפעות של תרכובות שניהם מתכת המכילים תרופות שנועדו למקד אותימטבוליזם טל. המגבלות העיקריות הנוכחיות של LA-ICP-MS בתור טכניקת דימות להערכת הפצת מתכת מרחבית הן תפוקה ורגישה. קיימת תחלופה בין המהירות של ניתוח ברזולוציה מרחבית 5, 12, עם תמונות ברזולוציה גבוהות יותר מחייבות פעמי ניתוח ארוכות יותר. הטכניקה היא גם מתאימה אלמנטים ביולוגיים בריכוזים גבוהים, אם כי גורמים כגון מנגן, קובלט וסלניום מוגבלים בשל השפע הנמוך שלהם ברקמה נורמלית ו / או מגבלות הגילוי שלהן על ידי קונבנציונלי ICP-MS. התקדמות חדשה בטכנולוגית ICP-MS, כגון ההכנסה של מנתחים המוניים משולשים quadrupole, ולאפשר זיהוי ממוקד של analytes הקשה, כמו סלניום 32 ב רגישויות גבוהות 33. כהליך טכנולוגיה המונעת, מקדמות הם ליזר ועיצוב ספקטרומטריית מסה תראה הדמיה זו הטכניקה ממשיכה להתפתח, להגדילהמהירות של ניתוח רגישות 34.

גילויים

RWH ו-COC הם עובדים בשכר של ESI Ltd. FF ו-TPH הם עובדים בשכר של Agilent Technologies Australia.

תודות

DJH ו PAD נתמכים על ידי פרויקט הצמדה המועצה למחקר האוסטרלי (LP120200081) עם Agilent Technologies ו- ESI בע"מ תרומת BK נתמכה על ידי PLUS הספר מחקר באוניברסיטת הרוהר, ממומן על ידי יוזמת המצוינות של גרמניה [DFG GSC 98/3]. DJH מומן בחלקו על ידי קרן Ramaciotti. KK נתמך על ידי קרן סיגריד Juselius.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שקופיות מיקרוסקופ זכוכית סודהn/an/aשקופיות טיפוסיות מתאימות לכל הניסויים
להבי מיקרוטום מצופים PTFEC.L. DT315R50גודל הלהב תלוי במחזיק להב קריוסטט. בדוק לפני ההזמנה.
Parafomaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich16005כל ספק מתאים
סוכרוזn/a n/aסוכר לבן בדרגה מסחרית מתאים
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)Sigma-AldrichP5368שקיות מעורבבות מראש רשומות, ניתן להכין על פי פרוטוקולי מעבדה רגילים
קסילןסיגמא-אולדריץ'247624כל ספק מתאים
אתנולסיגמא-אולדריץ'E7023כל ספק מתאים
מוח כבשn/an/aזמין מרוב הקצבים המקומיים מלחי
מתכתn/an/aהשתמש במלחי מתכת מסיסים במים המכילים אנליטים רצויים
Omni TH Tissue HomogeniserOmni IncTHP115הומוגנייזרים חלופיים מתאימים
בדיקות הומגנייזר פוליקרבונטOmni IncTH115-PCRH
יחידת עיכול מיקרוגלn/an/aאופציונלי. ראה סעיף 2
צינורות מיקרופוגה 1.5 מ"לTechnoPlasP4010צינורות פוליפרופילן ללא מתכת. צינורות שטופים בחומצה מתאימים גם
65% חומצה חנקתיתMerk Millipore100441ניתוח עקבות דרגה
30% מי חמצןSigma-Aldrich95321ניתוח עקבות דרגה
10 x 10 מ"מ תבניות קריוניות חד פעמיותטד פלה27181
איזופנטןסיגמא-אולדריץ'76871
חנקן נוזליn/a/aשימוש ספק מקומי
NWR213 מערכת אבלציה בלייזרESI Ltdn/aמשמש בניסויים אלה. יצרנים אחרים המתאימים, עשויים לדרוש שינויים בפרוטוקול
Agilent 8800 Series ICP-MSAgilent Technologiesn/aהמשמש בניסויים אלה. יצרנים אחרים מתאימים, עשויים לדרוש שינויים בפרוטוקול
תוכנת IoliteIoliten/aזמין החל מ-http://iolite-software.com/. שיטות אחרות זמינות, ראה פרוטוקול
ExcelMicrosoftn/a
IGOR ProWave Metricsn/aAvalable מ-https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm
n

מקורות

  1. Barnham, K. J., Bush, A. I. Biological metals and metal-targeting compounds in major neurodegenerative diseases. Chem Soc Rev. 43 (19), 6727-6749 (2014).
  2. Hare, D. J., Double, K. L. Iron and dopamine: a toxic couple. Brain. 139 (4), 1026-1035 (2016).
  3. Savory, J., Herman, M. M. Advances in instrumental methods for the measurement and speciation of trace metals. Ann Clin Lab Sci. 29 (2), 118-126 (1999).
  4. New, E. J. Tools to study distinct metal pools in biology. Dalton Trans. 42 (9), 3210-3219 (2013).
  5. Hare, D. J., New, E. J., de Jonge, M. D., McColl, G. Imaging metals in biology: balancing sensitivity, selectivity and spatial resolution. Chem Soc Rev. 44 (17), 5941-5958 (2015).
  6. Pozebon, D., Scheffler, G. L., Dressler, V. L., Nunes, M. A. G. Review of the applications of laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS) to the analysis of biological samples. J Anal At Spectrom. 29 (12), 2204-2228 (2014).
  7. Becker, J. S., Zoriy, M. V., Dehnhardt, M., Pickhardt, C., Zilles, K. Copper, zinc, phosphorus and sulfur distribution in thin section of rat brain tissues measured by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry: possibility for small-size tumor analysis. J Anal At Spectrom. 20 (9), 912(2005).
  8. Hare, D. J., Austin, C., Doble, P. Quantification strategies for elemental imaging of biological samples using laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. The Analyst. 137 (7), 1527-1537 (2012).
  9. Hare, D. J., Lear, J., Bishop, D., Beavis, A., Doble, P. A. Protocol for production of matrix-matched brain tissue standards for imaging by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Anal Meth. 5 (8), 1915-1921 (2013).
  10. Hare, D. J., et al. Quantitative elemental bio-imaging of Mn, Fe, Cu and Zn in 6-hydroxydopamine induced Parkinsonism mouse models. Metallomics. 1 (1), 53(2009).
  11. Potter, D. A commercial perspective on the growth and development of the quadrupole ICP-MS market. J Anal At Spectrom. 23 (5), 690(2008).
  12. Lear, J., Hare, D. J., Adlard, P., Finkelstein, D., Doble, P. Improving acquisition times of elemental bio-imaging for quadrupole-based LA-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 27 (1), 159(2012).
  13. Matusch, A., et al. Cerebral bioimaging of Cu, Fe, Zn, and Mn in the MPTP mouse model of Parkinson's disease using laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS). J Am Soc MAss Spectrom. 21 (1), 161-171 (2010).
  14. Hare, D. J., et al. An iron-dopamine index predicts risk of parkinsonian neurodegeneration in the substantia nigra pars compacta. Chem Sci. 5 (6), 2160-2169 (2014).
  15. Portbury, S. D., Hare, D. J., Sgambelloni, C., Finkelstein, D. I., Adlard, P. A. A time-course analysis of changes in cerebral metal levels following a controlled cortical impact. Metallomics. 8 (2), 193-200 (2016).
  16. Theiner, S., et al. LA-ICP-MS imaging in multicellular tumor spheroids - a novel tool in the preclinical development of metal-based anticancer drugs. Metallomics. 8, 398-402 (2016).
  17. Niedzwiecki, M. M., et al. A multimodal imaging workflow to visualize metal mixtures in the human placenta and explore colocalization with biological response markers. Metallomics. 8, 444-452 (2016).
  18. Austin, C., et al. Barium distributions in teeth reveal early-life dietary transitions in primates. Nature. 498 (7453), 216-219 (2013).
  19. Hare, D. J., et al. The effect of paraformaldehyde fixation and sucrose cryoprotection on metal concentration in murine neurological tissue. J Anal At Spectrom. 29, 565-570 (2014).
  20. Dodt, H. -U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Meth. 4 (4), 331-336 (2007).
  21. Hare, D. J., et al. Laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry imaging of white and gray matter iron distribution in Alzheimer's disease frontal cortex. NeuroImage. 137, 124-131 (2016).
  22. Günther, D., Heinrich, C. Enhanced sensitivity in laser ablation-ICP mass spectrometry using helium-argon mixtures as aerosol carrier. J Anal At Spectrom. 14 (9), 1363-1368 (1999).
  23. Austin, C. A., et al. Factors affecting internal standard selection for quantitative elemental bio-imaging of soft tissues by LA-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 26 (7), 1494-1501 (2011).
  24. Hare, D. J., et al. Three-dimensional elemental bio-imaging of Fe, Zn, Cu, Mn and P in a 6-hydroxydopamine lesioned mouse brain. Metallomics. 2 (11), 745-753 (2010).
  25. Osterholt, T., Salber, D., Matusch, A., Becker, J. S., Palm, C. IMAGENA: Image Generation and Analysis - An interactive software tool handling LA-ICP-MS data. Int J Mass Spectrom. 307 (1-3), 232-239 (2011).
  26. Uerlings, R., Matusch, A., Weiskirchen, R. Reconstruction of Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (LA-ICP-MS) Spatial Distribution Images in Microsoft Excel 2007. Int J Mass Spectrom. 395, 27-35 (2015).
  27. Paul, B., et al. Visualising mouse neuroanatomy and function by metal distribution using laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry imaging. Chem Sci. 6 (10), 5383-5393 (2015).
  28. Paton, C., Hellstrom, J., Paul, B., Woodhead, J., Hergt, J. Iolite: Freeware for the visualisation and processing of mass spectrometric data. J Anal At Spectrom. 26 (12), 2508(2011).
  29. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
  30. Hare, D. J., et al. Three-dimensional atlas of iron, copper, and zinc in the mouse cerebrum and brainstem. Anal Chem. 84 (9), 3990-3997 (2012).
  31. Hjornevik, T., et al. Three-dimensional atlas system for mouse and rat brain imaging data. Frontiers Neuroinform. 1, 4(2007).
  32. Bishop, D. P., et al. Elemental bio-imaging using laser ablation-triple quadrupole-ICP-MS. J Anal At Spectrom. 31 (1), 197-202 (2016).
  33. Balcaen, L., Bolea-Fernandez, E., Resano, M., Vanhaecke, F. Inductively coupled plasma - tandem mass spectrometry (ICP-MS/MS): a powerful and universal tool for the interference-free determination of (ultra)trace elements - a tutorial review. Analytica Chimica Acta. 894, 7-19 (2015).
  34. Van Malderen, S. J. M., Managh, A. J., Sharp, B. L., Vanhaecke, F. Recent developments in the design of rapid response cells for laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry and their impact on bioimaging applications. J Anal At Spectrom. 31, 423-439 (2016).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

LA ICP MSROI

מאמרים קשורים