מודל הפלישה Perineural ב קרצינומה תא ראש וצוואר קשקש

סיכום

פלישה פרינוירולית (PNI) היא תכונה שכיחה של קרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר (HNSCC), המעניקה שיעורי הישרדות נמוכים יותר. המנגנונים שלו אינם מובנים היטב. תוך שימוש בנויריטים הנוצרים מגרעיני שורש גב עכברים המוגבלים למטריצה מוצקה למחצה, ניתן לחקור את המסלולים המעורבים ב-PNI של קווי תאי HNSCC.

תקציר

פלישה פרינוירולית (PNI) נמצאת בכ-40% מקרצינומות תאי הקשקש בראש ובצוואר (HNSCC). למרות טיפול רב-מודאלי בניתוח, הקרנות וכימותרפיה, הישנות מקומיות וגרורות מרוחקות מתרחשות בשיעורים גבוהים יותר, וההישרדות הכוללת יורדת ב-40% בהשוואה ל-HNSCC ללא PNI. מחקרי מבחנה של המסלולים המעורבים ב-HNSCC PNI היו מאתגרים מבחינה היסטורית בהתחשב בהיעדר בדיקה עקבית וניתנת לשחזור. מתואר כאן ההתאמה של בדיקת גנגליון השורש הגבי (DRG) לבדיקת PNI ב-HNSCC. במודל זה, DRG נקצרים מעמוד השדרה של עכבר עירום שהוקרב ומונחים בתוך מטריצה חצי מוצקה. במהלך הימים שלאחר מכן, נויריטים נוצרים וגדלים בתבנית רדיאלית מגופי התאים של ה-DRG. קווי תאי HNSCC ממוקמים לאחר מכן באופן היקפי סביב המטריצה ופולשים באופן מועדף לאורך הנויריטים לכיוון ה-DRG. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה של מצבי טיפול מרובים, עם שיעורי הצלחה ושחזור גבוהים מאוד של הבדיקה.

מבוא

קרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר (HNSCC) הוא הסרטן השישי בשכיחותו בארה"ב, עם 10,000 מקרי מוות בשנה ברמה הלאומית ו-300,000 מקרי מוות בשנה ברחבי העולם¹. הפרוגנוזה הכוללת של HNSCC נותרה ללא שינוי על 50% בעשורים האחרונים. פלישה פרינוירולית (PNI) היא אחד המאפיינים הפתולוגיים הבולטים ביותר המבשרים על פרוגנוזה גרועה בחולים עם HNSCC. למרבה הצער, PNI הוא תופעה שכיחה ב-HNSCC וניתן למצוא אותו בעד 40% מחולי HNSCC^2,3.

PNI הוא התהליך שבו תאים ממאירים עוקבים אחר עצבים לרקמות סמוכות, מה שמאפשר שיעורים גבוהים יותר של התפשטות מקומית ומרוחקת. בהתאם לכך, לגידולי HNSCC חיוביים ל-PNI יש שיעורים גבוהים יותר של הישנות מקומית וגרורות מרוחקות, וכתוצאה מכך הישרדות כוללת נמוכה יותר בהשוואה לחולי HNSCC ללא PNI^4-8.

למרות שהטיפול בחולים עם PNI ממקסם בדרך כלל על ידי שימוש בניתוחים, הקרנות וכימותרפיה, שיעורי ההישרדות הכוללים של חולים אלה עדיין יורדים בעד 40% בהשוואה לחולים ללא PNI^9-11. לפיכך, ברור כי שיטות הטיפול הנוכחיות ב-HNSCC אינן יעילות בשיפור הפרוגנוזה השלילית הקשורה ל-PNI. הגישה של פיתוח טיפול ממוקד נגד PNI ב-HNSCC נפגעה על ידי ההבנה הלקויה של הגורמים המווסתים תהליך זה. זו, בין השאר, תוצאה של היעדר מודל עקבי במבחנה לחקר PNI ב-HNSCC.

בשנים האחרונות, מספר קבוצות משתמשות במודל מבחנה לחקר PNI בעיקר בסרטן הלבלב והערמונית^12-19. מודל זה משתמש בנוריטים הנוצרים מגרעיני שורש גב שבודדו מעכברים או חולדות כתחליף לפלישה לעצבים גדולים. גרעיני השורש הגבי מקובעים במטריצה מוצקה למחצה מדולדלת גורם, שהיא תערובת חלבון ממברנת בסיס מסיסה המופרשת על ידי תאי סרקומה של עכבר אנגלברת-הולם-נחיל. מטריצה זו מאפשרת צמיחה של הנויריטים ומעקב אחר תאי סרטן בודדים לאורך תאי עצב אלה. מתואר כאן ההתאמה של מודל זה לבחינת PNI ב-HNSCC.

פרוטוקול

1. הכנת בינוני תרבות ומנות (10 דקות)

1. הוספת 100 μL של בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% בסרום שור העובר (FBS) אל הבארות של צלחת 96-גם V-התחתון.
2. הסר בקבוקון-טרום aliquoted של כ 100 μL של מטריקס חצי קשות מהמקפיא 20 ° C, ולמקם אותו ישירות על הקרח.
   הערה: האם זה לפני השורש הגבה גנגליון (DRG) קציר כי המטריצה ​​למחצה לוקחת כ -30 דקות להגיע במצב נוזלי על קרח, אשר הוא הכרחי עבור השלבים הבאים. אי שמירת המטריצה ​​חצי הקשה על קרח בכל העת יגרום אגל מטריקס באיכות ירודה.
3. זכוכית תחתונה תווית צלחות תרבויות עם דיו קבע, יצירת מזהים ייחודיים בכל אחת מארבע הפינות על המשטח התחתי של הצלחת. מניחים את הצלחות בצד הימני על קרח כדי לקרר את פני צלחת.
   הערה: כל תשואות עכבר 32 - 40 DRG, ואז הם קוראים אותם מ -1 עד 40. אין צורך לאשר מראש צמרמורת piללטף טיפים, עצות מצוננות תתחממנה במהלך הצבת טיפות מטריקס, פוטנציאל מציגים הבדלים עקביים מטריקס.

2. Dissection של Murine DRG (45 דקות)

1. להרדים עכבר בעירום athymic לפי פרוטוקולים מעבדה ספציפית, כגון באמצעות שימוש בתא CO ₂ פתיחת בית החזה.
2. הגדר באזור לנתיחה ומיקרוסקופ. השתמש התחתון נקי, מעוקר, ושטוח מכולות פוליסטירן עבור צינורות חרוטי 15 או 50 מ"ל.
   הערה: בנוסף, הם מתאימים לשימוש כמו פני השטח לנתח, כפי שהם זולים חד פעמיים, ולאפשר קיבוע של עמוד השדרה באמצעות סיכות או מחטים. השתמש רק מכשירים מעוקרים ומחטים.
3. תחת חזון טבעי, לעשות חתך אורכי לאורך עמוד השדרה מן השורש של הזנב עד הראש של העכבר עם זוג מספריים בסדר ישר או עקום.
4. השתמש באותו מספריים לפער רוחבי מתחת sacrעמוד השדרה אל. לנתח את שני הצדדים של עמוד השדרה כל הדרך עד לבסיס הגולגולת באמצעות מספריים. בשלב זה, להבטיח כי עמוד השדרה הצווארי הוא transected cranially ככל האפשר עם מספריים.
5. להבחין בסוף צוואר הרחם של עמוד השדרה מתחת למיקרוסקופ ההפעלה בהספק נמוך. חוט השדרה הלבן בולט באמצע טבעת גרמית, המוקפת כמויות משתנות של שרירי paraspinal ורקמות רכות.
6. פיצול הגבה או היבט המעולה של 2 ראשון - גופים בחוליות 3 במספרי האביב מיקרוסקופים. באמצעות פעולת האביב של המספריים, פתח גרמי ראשוני זה לחתוך על מנת להבטיח כי לנתיחת גוף השדרה התרחשה על קו האמצע. המשך במרווחים קטנים לכיוון עמוד שדרת עצם העצה, ולאחר מכן לחצות את עמוד השדרה על ידי השלמת הקיצוצים הזהים על היבט הגחון או נח של הגופים בחוליות.
   הערה: אי להבטיח לנתיחת קו האמצע של עמוד השדרה הגרמי יגרום תשואת DRG נמוכה.
7. בשעת תינקודת ים, עמוד השדרה מחולק לשני חצאים. מניח עמוד שדרה חמה אחד הצידה, עם חוט השדרה במקום פונה כלפי מטה על צלחת סטרילי.
   הערה: השארת חוט השדרה במקום תמנע DRGs מהתייבשות, כמו DRGs עמוק אל חוט השדרה.
8. Secure משני צדי עמוד השדרה החם האחר עם שתי מחטים 18-מד בפלטפורמת לנתח הקלקר. החל בסוף צוואר הרחם (שהוא לכאורה כי עמוד השדרה צרה, את DRG קרוב אחד לשני, ויש הוספות צלעות), בעדינות לקלף בחזרה את חוט השדרה מכ -4 רמות שדרה.
9. שים את עצבי תחושה (בדרך כלל שתיים) המחברים את DRG. באזור שבו העצבים להכניס אל DRG, בעדינות לתפוס את fascia שמסביב עם מלקחיים מיקרוסקופיים. לנתח לקצץ fascia זה רקמת עצב אחרת עם המספריים באביב המיקרוסקופים לשחרר את DRG. הכחשה עדינה תביא את DRG מתוך עמדתה בתוך עמוד השדרה הגרמית.
   הערה: הגדלהכוח מיקרוסקופ בשלב זה מועיל. קראש פגיעה DRG יגביל את הצמיחה באופן משמעותי של neurites. זה הוא נמנע מעולם ידי אחיזת DRG ישירות, אלא על-ידי אחיזת fascia שמסביב.
10. חותך את העצבים ההיקפיים (את DRG יש בדרך כלל עצב אחד פריפריה, שהוא יחסית עמוק לתצוגת לנתח) עם המספריים באביב המיקרוסקופים כדי לשחרר את DRG.
    הערה: זה הכי קל לברר היכן לקצות העצבים ואת DRG מתחיל בעוד על המתח, כך עושה זה לחתוך קרוב ככל האפשר אל DRG בשלב זה הוא אידיאלי. ברגע סניף דיסטלי זה נחתך, הענפים הפרוקסימלי הם גזומים גם כן.
11. חתוך את DRG של כל סיבי עצב תועה או חיבורים fascial עם מספריים באביב מיקרוסקופיים. לאחר בידוד נאות, למקם את DRG לתוך המדיום-בטמפרטורת החדר בתוך צלחת V-התחתון 96-היטב.
    הערה: הצבת רקע כהה מתחת לצלחת עושה לדמיין את DRGs הלבן מ"מ תת קל. רק למקם DRG אחד EACh היטב; בדרך זו, ניתן להסביר להם עבור בקלות יותר בשלבים הבאים.
12. חזור על תהליך זה כל הדרך למטה-שדרה חמה אחד ואחר כך את השני. כל צד מניב 16 - 20 DRGs, בסך של 32 - 40.
    הערה: אם יש פחות DRGs מזה, דיסקציה של עמוד השדרה צריכה להתבצע cephalad נוסף ו / או caudally. DRGs להיות פחות ופחות ברור כשל אחד ממשיך caudally.

3. הכנת טיפות מטריקס חצי קשות (<1 דקות לכל צלחת)

1. הסר כוס אחת צלחת היטב בתחתית מקרח ומניח אותו על בלוק קרח מתחת למיקרוסקופ ההפעלה. ודא aliquot של מטריקס נשאר על הקרח בכל עת.
2. מניחים טיפה 1.5-μL של מטריקס בכל אחת מארבע פינות של צלחת זכוכית התחתונה עם micropipetter 2-μL או 10 μL, עוזב במרחק לפחות גדול כמו אגל עצמו מקצה הכוס היטב.
   1. הנח את קצה פיפטה ישירות על גביהזכוכית בזווית של 45 מעלות. לאט pipet המטריצה. לאט להתרחק מתחתית הכוס אחרי מטריקס עוסקת על הצלחת.
      הערה: מתח הפנים בין מטריקס והזכוכית צריך ליצור אונה מושלמת בכל פעם.
   2. עצור pipetting רק לפני הטיפ הוא ריק, כי הזרקה מכוונת של אוויר לתוך אגל מטריקס עושה את הקוטר של אגל מטריקס הרבה יותר קשה להסיר.
      הערה: שימוש יד שנייה לייצב את היד pipetting מקלה מיקום מדויק יותר.

4. קלטי DRG לטיפות מטריקס חצי קשות (<2 דקות לכל צלחת)

1. השאירו את הצלחת עם טיפות מטריקס בקצרה בטמפרטורת החדר (~ 1 דק '). זה מעט מתקשח המטריצה, מה שמקל על המיקום המדויק של DRG.
2. סקופ (לא לתפוס) את DRG בעדינות עם מלקחיים מיקרוסקופיים סגור ביד שמאל. שוב, רקע כהה נגד קטן, לבןDRG מקלה ויזואליזציה. מעבירים את DRG אל קצה מחט 21-מד ביד ימין. העברה זו תעזוב תקשורת שיורית על המלקחיים.
3. הכנס בעדינות את DRG לאמצע אגל מטריקס באמצעות מחט 21-מד (איור 1). רוב הזמן, את DRG תשחרר בקלות לתוך המטריצה ​​ולאחר מכן ניתן למקם באופן מרכזי עם המחט.
   1. אם DRG מקל על המחט, להשתמש במלקחיים המיקרוסקופים לדחוף את DRG הנחה של המחט לתוך אגל מטריקס. וויק משם תקשורת עודפת המלקחיים המיקרוסקופים עם מעבדת לנגב.
      הערה: היכרות עם מדיה מטריקס תשנה את הקוטר, נפח, ועקביות של assay. בלוק קרח עם צבע או בכתב צבעוני מספק בניגוד רקע, דבר המקל להדמיה של תהליך עדין זה.
4. לאחר הצלחת יש כל ארבעת DRGs, לבצע בדיקה סופית על מנת להבטיח כי DRG נמצא במרכז של רביב מטריקס. בצע התאמותלפי הצורך עם מחט 21-מד.
5. מעביר את הצלחת הושלמה על 37 מעלות צלזיוס חממה. זה יהיה לגבש המטריצה ​​למחצה ולתקן את DRG בעמדה.
6. חזור על תהליך זה עבור כל DRGs. מניח טיפות מטריקס ריקות ללא DRG כמו השליטה השלילית.
7. הוסף 4 מ"ל של DMEM עם 10% FBS התקשורת על כל צלחת זכוכית התחתונה לאחר השלמת כל צלחות וחשיפתם אל 37 ° C חממה עבור 3 דקות לפחות. מניחים את הצלחת בזווית קלה ולאט לאט מוסיפים את המדיום, כך שהוא מגיע בהדרגה במגע עם יחידות מטריקס-DRG.
   הערה: אם המדיום הוא הוסיף מהר מדי ולא חזק, מטריקס ו / או DRG יכול להיות וחילצה.
8. אחסן את המבחנים ב 37 ° C החממה עבור 48 בא - h 72.
   הערה: בדיקה תקופתית של מבחני יראת תולדה היקפית של neurites לכיוון קצה מטריקס (איור 2). כאשר neurites הם גבוהים יותר משלושה רבעים מן הדרך אל מטריקס, זהראוי צלחת התאים.

5. הכנת הראש ותאי סרטן הצוואר

הערה: תא קווים שאינ ראש והתאים הסלולרי קרצינומה קשקשית צוואר ניתן להשתמש בעיצוב ניסיוני זה.

1. לשמור על שורות תאי קרצינומה של תאי קשקש DMEM עם 10% FBS צלוחיות העדיפו או תרבות מנות בתוך 37 ° C חממה. כדי להכין תאים לניסויים, יניקה כל המדיום מבקבוק התרבות או הצליח ולשטוף את זה פעמים עם PBS. להשעות את התאים על ידי הוספת כמות מתאימה של טריפסין 0.025% במשך 5 דקות, ואחריו DMEM עם 10% FBS. פיפטה 4 מ"ל של תערובת תאים ומדיה לתוך תרבות מנות 6 מ"ל.
   הערה: צלחת תרבות 6 מיליליטר מספקת די והותר תאים, גם כאשר פחות מ -50% ומחוברות.
2. לחשוף את שורות תאי HNSCC לתנאים שונים 24 שעות לפני מכתים ציפוי על assay DRG. Re-dose תנאי פעם התאים הם מצופים לשמור על environme עקביתNT.
   הערה: הוספת נוגדנים, גורמי גדילה, ציטוקינים, או מולקולות אחרות את כלי תרבית תאי 1 - 2 ימים לאחר עכבר לנתיחת השתלה של DRG לתוך המטריצה.
3. להוסיף כתמי תא פלורסנט 1 שעות לפני ציפוי התאים (2 - 3 ימים לאחר הקציר DRG והשתלת לתוך המטריצה).
   הערה: כתמים מסוימים משמשים כאן לעבור בחופשיות דרך קרום התא; עם זאת, לאחר מגיבים עם קבוצות תיאול תאיים, הכתם לא הוסר בתוך התא מועבר לתאי הבת. המכתים מאוד מקל להדמיה בתוך המבחנים. כתמים זמניים אלה הם אידיאליים עבור אלה מבחנים כי הקרינה קיימת במשך 2 - 3 ימים, המהווה את מסגרת הזמן של הניסויים הללו. זה גם מאפשר השימוש בצבעים רבים ושונים מייתר את הצורך ביצירת שורות תאי חלבון-טרנספקציה ניאון.
   1. הכן 10 מיקרומטר של פתרון לצבוע ידי ערבוב 2 μL של 10 מ"מ כתמים המניות תא 2 מ"ל של סרום ללא DMEMלכל מצב תא. לחמם זה ל -37 מעלות צלזיוס לפני הוספתו התאים.
   2. הסר את מדיום התרבות בתוך הצלחת 6-המ"ל, עוזב את תאי HNSCC החסידים על הצלחת. הוסף 2 מ"ל של בופר פוספט (PBS) ולהסיר 2 מ"ל של הכתם תא 10 מיקרומטר / DMEM סרום המתווספים כל צלחת
   3. מחזירים את הצלחת תרבות 6 מ"ל עם כתם התא אל 37 ° C חממה עבור 40 דקות.
   4. לאחר 40 דקות, לשאוב את המדיום. הוסף 2 מ"ל של PBS ולאחר מכן לשאוב אותו. הוסף 1 מ"ל של טריפסין 0.025% על כל צלחת ולהחליף אותם 37 ° C חממה.
   5. הוסף 2 מ"ל של DMEM עם 10% FBS לאחר 3 - 5 דקות ולהעביר את התאים מושעה צינור חרוטי 15 מ"ל. ספין התאים מחדש תלויה אותם 1 מ"ל של DMEM עם 10% FBS.
   6. ספירת התאים עם hemocytometer או נגד תא אוטומטי, ולאחר מכן להוסיף DMEM עם FBS 10% כדי ליצור ריכוז תא סופי של 300,000 תאים לכל מיליליטר.

6. ראש הציפוי ו- Nתאים סרטניים Eck

1. הסר את צלחות הזכוכית תחתונה עם מבחני מטריקס-DRG מן החממה.
   הערה: שוב, הם מתאימים כאשר neurites הם לפחות 75% מן הדרך עד לקצה של מטריקס, אשר מתרחש בדרך כלל לאחר 2 - 3 ימים. הדבר בא לידי ביטוי הכי טוב באמצעות לפחות מטרה 10X.
2. לשאוב את המדיום בתוך צלחת זכוכית התחתונה. לחלוטין לשאוב את המדיום בתוך הכוס גם מבלי להסיר את היחידות מטריקס-DRG.
3. צייר את 200 μL של 300,000 תאים / מ"ל ​​בינוני באמצעות pipet 200 μL. מניחים שתי טיפות של התאים על פני כל assay מטריקס-DRG. בצע פעולה זו עבור כל אגל מטריקס, יצירת ארבע חזרות על כל תנאי תא על צלחת אחת.
   הערה: צורת חצי הכדור של המטריצה מאפשרת לתאים להתיישב טבעת לאורך בפריפריה של assay (איור 3 א, 3 ב איור). מציאת pipet עם הדק חלק עושה מיקום של מדי טיפות הרבה יותר קל.
4. אשר מספר di תא דומיםstribution תנאי התאים השונים תחת מיקרוסקופ 4X.
5. מניחים את הצלחות זכוכית התחתונה לתוך 37 ° C חממה כ -60 דקות. הערה: למרות שיש רק נפח קטן של תאים ומדיה (~ 150 μL), המבחנים שלא יתייבשו עד כמה שעות של זמן חממה שחלפו.
6. לאחר 60 דקות, בעדינות להוסיף 4 מ"ל של DMEM עם 10% FBS לאורך דפנות של צלחת זכוכית התחתונה.
   הערה: במשך תקופה של זמן, התאים חלקית לדבוק בתחתית הצלחת, ואת שיטת הוספת המדיום לא מפריע התאים. סוגי תאים שונים להפוך לקחת יותר או פחות זמן להתחיל לדבוק צלחת זכוכית התחתונה.
7. חלף כל תרופות אקסוגניים או גורמי גדילה בשלב זה לשמור על רמות הריכוז הקודמות.
8. מחזיר את המבחנים אל 37 ° C החממה, למעט כאשר נבחנים הם מיקרוסקופי. לכמת את התוצאות של assay זה על ידי הדמיה מיקרוסקופית. בקצרה, לספור את קווצות הפלישה perineural עםארבעה רביעים באמצעות תמונה מיקרוסקופית 4X.
   הערה: מיקרוסקופ עם יכולות אובייקטיביות קרינת 4X הוא נאות לפוטו-המתעד את המבחנים. גודלו של מבחני משתלב יפה בתוך השדה של מטרת 4X, אשר מפורטת מספיק כדי ללכוד את האזורים הבודדים של פלישת perineural. פלישת Perineural מתבררת תוך 24 שעות, אבל מעבר 48 שעות, על שלמות המבחנים מתחילה להיחלש, כמו התאים הסרטניים לחלק לאורך בפריפריה של מטריקס לפלוש. מעבר 48 שעות, יש גם בזרימת ניכר פיברובלסטים מן DRG, אשר מטשטש להדמיה באמצעות מיקרוסקופ brightfield. לכן, רצוי-מסמך צילום התוצאות עם מיקרוסקופיה 4X לפחות פעמים במהלך חלון זה (לדוגמא, ב 24 ו 48 שעות לאחר ציפוי התאים הסרטניים). שימו לב כי אלו הם מבחני 3-ממדי, וזה קשה התמונה לחלוטין את assay כולו. רוב הפלישה perineural מתרחשת במטוס מתחתית הצלחת, כאשר tהוא התאים המוטבעים המטריצה ​​מעט מעל בתחתית הצלחת. בגלל שאבירון קרוב אופקי, הרוב המכריע של neurites עם תאים סרטניים נלכדים בתמונה אחת ברמה ב 4X.

תוצאות

לאחר דיסקציה של DRG וההקצאה בתוך אגל מטריקס, את המראה של assay צריך להידמות הערה באיור 1. כי DRG אינו עגול באופן מושלם, אבל הוא מרוכז בתוך אגל מטריקס. זה מאפשר את התולדה של neurites ב 360 מעלות, הראתה חלקית באיור 2. שים לב כי חלקים מסוימים של DRG שולחים neurites מהר במספרים גדולים יותר מאשר לאחרים, בדרך כלל מתאימים שבו efferent וענפי עצב מביאים נכנסו ויצאו DRG, בהתאמה. אנו להסביר את זה ובגין הפרשים גודל בין DRGs בא...

דיון

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול

הצעדים החשובים ביותר בתוך פרוטוקול זה הם לנתיחת מיצוי המדויקת של גרעיני שורש הגבה. חיתוך רוחב תקין של עמוד השדרה ועל חלוקת קו אמצע-אורך לשני חמי קוצים הם קריטיים קבלה מספר גדול של DRG. במהלך דיסקציה של DRGs הפרט, הגנגליון לא צריך להיות מטופלים באופן ישיר, אלא fascia שמסביב צריך להיתפס עם מלקחיים מיקרוסקופיים. אי ביצוע הוראה זו תיגרם פגיעה למעוך של DRG, המהווה את הגורם...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM/F-12 50/50 תערובת עם L-גלוטמין ו-15 מ"מ HEPES	Corning Cellgro	10-090-CV	Manassas, VA
סרום בקר עוברי	אטלנטה ביולוגי	S11150	Flowery Branch, GA
0.25% טריפסין-EDTA (1x)	Life Technologies Corporation	25200056	גרנד איילנד, ניו יורק
פוספט חוצץ מלח 1x	קורנינג	21-040-CM	מנסס, וירג'יניה
Matrigel hESC-Qualif	Mouse Corning Incorporated	354277	Bedford, MA
Gamma מוקרנים 35 מ"מ צלחות תרבית תחתית זכוכית	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Ashland, MA
SteREO Discovery.V8 מיקרוסקופ הפעלה	Carl Zeiss Microimaging	495015-0021-000	ת'ורנווד, ניו יורק
מקור אור Schott ACE I	Schott	A20500	גרמניה
CellTracker	Life Technologies Corporation	C2925	Carlsbad, CA
BD PrecisionGlide Needle 18 G ו- 21 G	BD	305195	Franklin Lakes, NJ
Premium Microdissecting Tweezer	מכשיר הרווארד	60-3851	Holliston, MA
פרימיום מספריים סטנדרטיים להפעלה עדינה	מכשיר הרווארד	52-2789	Holliston, MA
מספריים קפיצים פרימיום	הרווארד מכשיר	60-3923	הוליסטון, MA
חבישת מלקחיים	הרווארד מכשיר	72-8949	הוליסטון, MA
עכברים עירומים אתימיים (002019)	מעבדת ג'קסון	002019	בר הרבור, מיין