מאמר שיטה

תא ללא DNA Integrity ניתוח בדגימות שתן

DOI:

10.3791/55049

⸱

5 בינואר 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biosciences Laboratory, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Department of Urology, Morgagni-Pierantoni Hospital

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצעת שיטה לניתוח שלמות ה-DNA בחלק העל-טבעי נטול התאים של דגימות השתן. השיטה מתאימה לגילוי מוקדם של ממאירויות אורולוגיות והוכחה כמדויקת לאבחון מוקדם של סרטן שלפוחית השתן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות הנוכחות של מחזורי DNA ללא תא פלזמה או בסרום הוכחה נרחב להיות מקור מתאים של סמנים ביולוגיים עבור סוגים רבים של סרטן, כמה מחקרים התמקדו את הפוטנציאל של השימוש ללא תא שתן (UCF) DNA. החל מ ההשערות כי תאים אפופטוטיים נורמלי לייצר DNA מקוטעת וכי תאים סרטניים לשחרר עוד DNA, את התפקיד הפוטנציאלי של שלמות ה- DNA UCF הוערך כסמן אבחון מוקדם מסוגל להבחין בין חולים עם הערמונית או סרטן שלפוחית ​​השתן אנשים בריאים.

ניתוח שלמות UCF DNA מוצע על הבסיס ארבעה PCRs כמוני בזמן האמת של ארבעה רצפים ארוכים מ -250 נ"ב: c-myc, BCAS1, HER2, ו AR. רצפים כי לעתים קרובות יש מספר עותק דנ"א גדל ב סרטן שלפוחית ​​השתן וסרטן הערמונית נבחרו לניתוח, אבל השיטה היא גמישה, וגנים אלה יוכל להחליף אותו עם גנים אחרים של inteמנוחה. את התועלת הפוטנציאלית של UCF DNA כמקור ביומרקרים כבר הודגמה עבור ממאירויות אורולוגים, ובכך לסלול את הדרך למחקרים נוספים על אפיון DNA UCF. המבחן שלמות ה- DNA UCF יש את היתרון של להיות לא פולשנית, מהירה, וקלה לביצוע, עם רק כמה מיליליטרים של שתן צורך לבצע את הניתוח.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תא ללא DNA ניתן לאתר בדם ובשתן בשל מוות של תאים על ידי מנגנונים אפופטוטיים או נמקי. דנ"א נייד ללא בדם נחקר באופן נרחב למטרות אבחון ופרוגנוסטיים במחלות שונות, בעיקר סרטן 1. עם זאת, פחות ידוע על התפקיד ללא תא שתן (UCF) DNA. UCF DNA עשויה מהקורן חולף דם דרך מערכת סינון גלומרולרי או מתאי שמגיעים ישירות במגע עם נוזל 2 הגוף הזה (למשל, תאי urothelial או תאי ערמונית). שימוש DNA UCF כמקור ביומרקרים נחקר בעיקר לאבחון המוקדם של כליות, שלפוחית שתן, סרטן הערמונית בשל האחוז הגבוה של DNA UCF מגיע ישירות מתאי בדרך שתן 3,4.

מעט מאוד ידוע על DNA UCF ואת השיטות הטובות ביותר לבידוד ואפיון זה. בהינתן ההשערה כי תאים סרטניים לשחרר קטעי דנ"א עוד יותר מתאים רגילים, ההערכהשל שלמות ה- DNA בתא ללא נחקרה בניסיון להבהיר את מקור ה- DNA במחזור הדם 5. מספר מחקרים הוכיחו כי שלמות ה- DNA ללא תא דם מייצג בדיקת אבחון טוב עבור סוגים רבים של סרטן 6, ואותו ההשערה הוצעה ביחס שתן 7-9.

מאמר זה מתאר שיטה חדשה לניתוח שלמות UCF DNA עם יישום פוטנציאל לגילוי סרטן שלפוחית ​​השתן וסרטן הערמונית. בפרט, על שלמות ה- DNA UCF שבר יותר מ -250 נ"ב נבדקה 4 אזורים ידועים כבעל מספר עותק דנ"א מוגבר בגידולים מוצקים, כולל ערמונית וסרטן שלפוחית השתן: c-myc (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2), AR (Xq12) 10-14. אונקוגנים ספציפיים, ולא רצפים אקראיים, נבחרו כדי להגדיל את ההסתברות למציאת אותם בשבריר תא ללא של חולי סרטן. אחד היתרונות העיקריים שלשיטה זו היא כי היא גמישה וכי באזורים אחרים יכולים גם להיבחר על בסיס סוג גידול ומאפיין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול פועל בהתאם להנחיות ועדת האתיקה מחקר האדם irst.

הערה: בפרוטוקול זה, אנחנו מבודדים דנ"א מדגימות השתן לבצע ניתוח שלמות UCF DNA. קווי LNCaP ותא MRC ששימשו לבניית סטנדרטים. טכניקות כגון מיצוי DNA, כימות DNA (ספקטרופוטומטר ו בזמן אמת PCR עבור הגן שליטה, STOX1), בזמן אמת PCR עבור אונקוגנים ספציפיים בוצעו (איור 1).

איסוף ועיבוד שתן 1.

  1. השג דגימת שתן ראשון בבוקר נקי לתפוס בכוס נקייה ויבשה, פלסטיק. אסוף לפחות 50 מ"ל של דגימת שתן.
  2. לשמור על שתן על 4 מעלות צלזיוס למשך תקופה מקסימלית של 3 שעות ולשלוח אותו למעבדה באותה הטמפרטורה.
  3. מערבבים כל דגימה על ידי היפוך זה פעמיים מיד עם הגעתו במעבדה ולהעביר לשתי 50 מ"ל תחתית חרוטי צינורות פוליפרופילן.
  4. בצנטריפוגה צינורותב 850 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C או בטמפרטורת החדר.
  5. בזהירות להעביר 10 מ"ל של החלק העליון של supernatant שתן לשני צינורות 5 מ"ל, עוזב לפחות 2 מ"ל של supernatant מעל גלולה התא.
    הערה: העברת החלק העליון של supernatant מפחיתה את הסיכון של זיהום על ידי תאים או פסולת הסלולר. אין הגדרה ברורה בין החלקים העליונים ותחתונים.
  6. וזורקים את הכדור ומיד להקפיא את supernatant ב -80 ° C עד השימוש.

בידוד DNA 2. מן Supernatant שתן שורות תאים

הערה: לבודד את ה- DNA משורת תאים (למשל, LNCaP לסרטן הערמונית או MRC בסרטן שלפוחית השתן) באמצעות ערכה מסחרית בהתאם להוראות היצרן. בידוד של DNA מן supernatant שתן צריכה להתבצע באמצעות הפרוטוקול המסחרי, שונה כדלקמן:

  1. להפשיר aliquot אחד supernatant שתן בטמפרטורת החדר.
  2. וורטקס ומערבבים את דגימת שתן ולהעביר 1 מ"ל של supernatant שתן לתוך צינור 5 מ"ל ברור. להקפיא את השתן שיורי ב -80 מעלות צלזיוס.
  3. הוספת 100 μL של k proteinase ישירות המדגם.
  4. הוסף 1 מ"ל של חיץ AL המדגם ומערבבים היטב על ידי pipetting.
  5. סגור את צינורות דגירת הדגימות ב 56 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  6. במהלך הדגירה, להכין עמודה אחת עבור כל דגימה ולהכין את מאגרים לשטוף, AW1 ו AW2, על פי הוראות היצרן (להוסיף את הסכום המצוין של 100% אתנול).
  7. תביאו את דגימות בחזרה לטמפרטורת החדר ומוסיפים 1 מ"ל של אתנול מוחלט. מערבבים היטב על ידי pipetting.
  8. להוסיף 650 μL של התערובת שהושגה בשלב 2.7 לעמודה צנטריפוגות אותו ב -6,000 XG דקות 1.
  9. מחק את הצינור המכיל את הזרימה דרך למקם את הטור על צינור אוסף חדש, נקי. חזור על שלבים 2.8 ו -2.9 עד שכל התערובת מדגם נוצל בעבר (5 פעמים).
  10. הוספת 500 &# 181; L של חיץ AW1 מבלי להרטיב את שפת הטור. צנטריפוגה זה ב 6,000 XG דקות 1.
  11. מחק את השפופרת המכילה את הזרימה דרך ולהחליף אותו עם צינור אוסף חדש, נקי.
  12. הוספת 500 μL של חיץ AW2 מבלי להרטיב את שפת הטור. צנטריפוגה זה במלוא המהירות (20,000 XG) במשך 3 דקות.
  13. מחק את השפופרת המכילה את הזרימה דרך ולהחליף אותו עם צינור אוסף חדש, נקי.
  14. חזור על שלב 2.12 כדי להסיר כל חיץ כביסה שיורית.
  15. מניחים את הטור לתוך צינור 1.5-מ"ל נקי. הוסף 50 μL של חיץ elution AE ולחכות 7 דקות על מנת להבטיח כי מרטיב חיץ העמודה.
  16. צנטריפוגה זה ב 8000 XG דקות 1.
  17. פיפטה eluent משלב 2.15 לתוך הטור-מיני צנטריפוגות אותו במהירות המרבית עבור 1 דקות כדי להבטיח את התאוששות מקסימלית של ה- DNA.

3. כימות דנ"א דילול

  1. באמצעות ספקטרופוטומטר, לבצע כימות של דנ"א בוטh הקו הסלולרי לבין דגימות supernatant שתן. השתמש 2 μL של המדגם על ספקטרומטר הספסל העליון, על פי הוראות היצרן.
  2. לדלל את דגימות DNA UCF כדי לקבל ריכוז של 1 ng / μL ולאחסן את ה- DNA ב -20 ° C עד לניתוח שלמות ה- DNA.
    הערה: אם כמות ה- DNA אינו מספיק כדי להמשיך עם בזמן אמת PCR (לפחות 100 נ"ג), לבצע תהליך בידוד DNA חדש.
  3. לדלל את דנ"א מדגימות שורת תאים להשיג שישה תקנים עם ריכוזים שונים: 0.001, 0.01, 0.1, 1, 0.5, ו -2 ng / μL, כל אחד עם נפח של 100 μL (st1, ST2, ST3, st4, ST5, ו st6). אחסן את הסטנדרטים DNA התא קו ב -20 ° C עד לניתוח שלמות ה- DNA.

4. DNA Integrity מבחן - PCR

  1. הפשרה פריימרים (ריכוז תלוי בסוג של assay), Supermix הירוק, סטנדרטי DNA התא אונליין, דגימות בדילול UCF DNA על קרח.
  2. הכן צינורות רצועה בצלחת fאו הדיסק הרוטור 72-היטב. Aliquot 10 μL בשני עותקים עבור כל תקן מדגם מדולל 10 μL של מים RNase ללא עבור הביקורת השלילית.
  3. להכין תערובת של 1 μL של כל צבע יסוד (הריכוזים מסומנים בטבלה 1), 12.5 μL של Supermix ירוק, ו -6.5 μL של RNase ללא מים עבור כל דגימה. כאשר מכין את התערובת, להשתמש את המספר הבא של דגימות: 6 תקני 2 משכפל, מספר דגימות עבור 2 משכפל, שליטה שלילית 2 משכפל, ו -2 דגימות נוספות.
  4. Aliquot 15 μL של התערובת לתוך כל טוב. אל פיפטה או לסובב את הצינורות.
  5. הפעל את הפרוטוקול עם תנאי PCR המצוינים בטבלת 1.
    הערה: לקבלת ערך DNA UCF, 29 דגימות DNA עובדו עבור כל ניסוי בזמן אמת באמצעות הדיסק הרוטור 72-היטב: 29 x 2 דגימות + 6 x 2 תקנים + שלילי מלא x 2 = 72 (UCF DNA ערך).
    הערה: הפרוטוקול לניתוח שלמות ה- DNA UCF יכול גם להיותמתבצע באמצעות מכשיר אחר בזמן אמת PCR (בעת השימוש במכשיר אחר, צבע רוקס ייתכן שיהיה צורך להוסיף).

5. DNA Integrity מבחן - ניתוח נתונים ופרשנות

הערה: ערך DNA UCF עבור כל דגימה הושגה על ידי תוכנת מערכת מכשיר איתור בזמן אמת באמצעות בניית עקומת סטנדרט עבור כל הערכת גן PCR פרט באמצעות אינטרפולציה עקומה סטנדרט, כפי שתוארה לעיל 7-9 (איור 2).

  1. להעריך את המשכפל; מדגם משכפל עם הבדל ≥1 Ct חייב להיות מושלך מחדש העריך בניסוי שני.
  2. חשב את Ct החציוני עבור כל דגימה ולשקול דגימות עם ערך Ct ≤ 36.
  3. להעריך את הספציפיות של מוצרי ה- PCR באמצעות ניתוח היתוך.
  4. להעריך את הריכוז של כל amplicon ידי אינטרפולציה עם עקומת סטנדרט; להשיג ערך ריכוז (ng / μL) עבור כל amplicon.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ריכוז DNA חופשי הכולל היה לכימות על ידי spectrophotometry עבור כל הדגימות נותחו, מראה מגוון של בין 1.51 ו 138 ng / μL. חמש דגימות בקרה שימשו שחזור של נתונים: שני ניסויים בזמן אמת עצמאית בוצעו עבור c-myc, HER2, BCAS1, AR, ו STOX1. המקדמים של השתנות (CV) חושבו אז עבור כל גן (טבלה 2), עם תואר טוב של שחזור בין שני ניסויים בלתי תלויים (טבלה 2).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח דנ"א שלמות UCF הוא שיטה חדשה, לא פולשנית להערכת שלמות ה- DNA בשתן. הוצע לאחרונה לאבחון המוקדם של סרטן שלפוחית השתן וסרטן הערמונית 9 7,8. מספר יתרונות וחסרונות של הבדיקה התקינה DNA UCF נדונים כאן, יחד עם הזדמנות עתידית.

היתרון העיקרי של הגישה הוא שהיא מציעה שיטה זולה, לא פולשנית פרוטוקול פשוט ללמוד שתן כמקור פוטנציאלי של סמנים ביולוגיים, הדורשים ידע בסיסי בלבד של טכניקות הביולוגיה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לגריין טירני ולסילביה בליסימו על עזרתן בעריכה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת מיני QIAamp DNA
 		Qiagen51304
iQ SYBR  ירוק סופרמיקס, 100 x 50 ומיקרו; L rxns, 2.5 מ"ל (2 x 1.25 מ"ל)Biorad1708880
IDT אוליגוס DNA מותאם אישית IDT טיהור HPLC, 100nMole DNA oligo
NanoDrop 1000 ספקטרופוטומטרThermo Scientificניתן להשתמש בשיטות ספקטרופוטומטריות אחרות לכימות DNA
Rotor-Gene 6000Corbettמכשיר PCR אחר בזמן אמת יכול לשמש גם
מיקרוצנטריפוגה
אחת לצינורות
אינקובטור-80
ו-deg; C מקפיא-20
מעלות; מקפיא
10 & #956; L פיפטה
20 & #956; L פיפטה
200 & #956; L פיפטה
1,000 & #956; קצות פיפטה L (
10; 20; 200; 1,000)
צינורות
צינורות
צינורות
רוטור דיסק 72 רוטור9018899
צינורות וכובעים רצועות קורבט, 0.1 מ"ל (250)Qiagen981103
צינורות איסוף (2 מ"ל)Qiagen19201
Buffer AL (264 מ"ל)Qiagen19075
Proteinase K (10 מ"ל)Qiagen19133
של 50 מ"לC1.5 מ"ל50 מ"ל15 מ"ל

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Francis, G., Stein, S. Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer. Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).
  2. Bryzgunova, O. E., Laktionov, P. P. Extracellular Nucleic Acids in Urine: Sources, Structure, Diagnostic Potential. Acta Naturae. 7 (3), 48-54 (2015).
  3. Szarvas, T., et al. Deletion analysis of tumor and urinary DNA to detect bladder cancer: urine supernatant versus urine sediment. Oncol.Rep. 18 (2), 405-409 (2007).
  4. Togneri, F. S., et al. Genomic complexity of urothelial bladder cancer revealed in urinary cfDNA. Eur.J.Hum.Genet. , (2016).
  5. Zonta, E., Nizard, P., Taly, V. Assessment of DNA Integrity, Applications for Cancer Research. Adv.Clin.Chem. 70, 197-246 (2015).
  6. Hao, T. B., et al. Circulating cell-free DNA in serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer. Br.J.Cancer. 111 (8), 1482-1489 (2014).
  7. Salvi, S., et al. Urine Cell-Free DNA Integrity Analysis for Early Detection of Prostate Cancer Patients. Dis.Markers. 2015, 574120(2015).
  8. Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early prostate cancer diagnosis: a pilot study. Biomed.Res.Int. 2013, 270457(2013).
  9. Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early bladder cancer diagnosis: preliminary data. Urol.Oncol. 31 (8), 1744-1750 (2013).
  10. Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br.J.Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
  11. Ishkanian, A. S., et al. High-resolution array CGH identifies novel regions of genomic alteration in intermediate-risk prostate cancer. Prostate. 69 (10), 1091-1100 (2009).
  12. Oxley, J. D., Winkler, M. H., Gillatt, D. A., Peat, D. S. Her-2/neu oncogene amplification in clinically localised prostate cancer. J.Clin.Patho. 55 (2), 118-120 (2002).
  13. Nord, H., et al. Focal amplifications are associated with high grade and recurrences in stage Ta bladder carcinoma. Int.J.Cancer. 126 (6), 1390-1402 (2010).
  14. Tabach, Y., et al. Amplification of the 20q chromosomal arm occurs early in tumorigenic transformation and may initiate cancer. PLoS One. 6 (1), e14632(2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNART PCRDNA

מאמרים קשורים