מיפוי אתר הקישור של Aptamer על ATP שימוש microscale Thermophoresis

סיכום

MicroScale Thermophoresis (MST) היא טכנולוגיה רגישה לאפיון אינטראקציות aptamer-מטרה. כתב יד זה מתאר פרוטוקול MST לאפיון אינטראקציות בין אפטמר למולקולות קטנות.

תקציר

אפיון אינטראקציות מולקולריות במונחים של פרמטרי קשירה בסיסיים כגון זיקה קשורה, סטוכיומטריה ותרמודינמיקה הוא צעד חיוני במדע בסיסי ויישומי. תרמופורזיס בקנה מידה מיקרו (MST) היא שיטה ביופיזיקלית רגישה להשגת מידע חשוב זה. בהסתמך על אפקט פיזיקלי הנקרא תרמופורזה, המתאר את תנועת המולקולות דרך שיפועי טמפרטורה, טכנולוגיה זו מאפשרת קביעה מהירה ומדויקת של פרמטרי קשירה בתמיסה ומאפשרת בחירה חופשית של תנאי חיץ (ממאגר לליזאטס/סרה). MST משתמש בעובדה שמולקולה לא קשורה מציגה תנועה תרמופורטית שונה מאשר מולקולה שנמצאת במתחם עם שותף קושר. התנועה התרמופורטית משתנה ברגע האינטראקציה המולקולרית עקב שינויים בגודל, במטען ובמעטפת ההידרציה. על ידי השוואת פרופילי התנועה של יחסים מולקולריים שונים של שני שותפי הקשירה, ניתן לקבוע מידע כמותי כגון זיקה מחייבת (pM ל-mM). אפילו אינטראקציות מאתגרות בין מולקולות בגדלים קטנים, כגון אפטמרים ותרכובות קטנות, יכולות להיחקר על ידי MST. באמצעות אינטראקציית המודל הנחקרת היטב בין אפטמר ה-DNA DH25.42 ל-ATP, כתב יד זה מספק פרוטוקול לאפיון אינטראקציות של מולקולות קטנות. מחקר זה מדגים כי MST רגיש מאוד ומאפשר מיפוי של אתר הקישור של אפטמר ה-DNA 7.9 kDa לאדנין של ATP.

מבוא

אינטראקציה בין המולקולות היא הבסיס של הטבע. לפיכך, מדענים בתחומים רבים של מחקר בסיסי ויישומים לנסות להבין את עקרונות היסוד של אינטראקציות מולקולריות מסוגים שונים. Microscale Thermophoresis (MST) מאפשרת למדענים לבצע את מהירה מדויקת, יעילה וחסכונית, ואיכות שבשליטת אפיון של אינטראקציות מולקולריות בתמיסה, עם בחירה חופשית של מאגרים. יש כבר יותר מ -1,000 פרסומים באמצעות MST, משנת 2016 בלבד, המתאר סוגים שונים של ניתוחים, כוללים סריקות ספרייה, מחייב אימותי אירוע, מבחני תחרות, וניסויים עם שותפים מחייבים מספר ^1-8. באופן כללי, MST מתיר חקר הפרמטרים המחייבים הקלסיים, כגון זיקה מחייבת (PM כדי מ"מ), ורכב, ותרמודינאמיקה, מכל סוג של....

פרוטוקול

1. הכנה של Stock עבודת Aptamer

1. פעל על פי הוראות היצרן ו לפזר את oligonucleotide (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, רצף בהפניה ¹⁸⁾ במים, להגיע לריכוז סופי של 100 מיקרומטר.
2. הכן את הפתרון עובד aptamer ידי דילול המניות oligonucleotide 200 ננומטר עם חיץ מחייב (20 מ"מ טריס, pH 7.6; 300 מ"מ NaCl; 5 מ"מ MgCl _2; 0.01% Tween20).
3. דגירה את התערובת במשך 2 דקות ב 90 מעלות צלזיוס, בואו המדגם מיד להתקרר על קרח, ולהשתמש מדגם בטמפרטור....

תוצאות

במחקר זה, MST יושמה לאפיין את אתר הקישור של aptamer DH25.42 DNA ¹⁸ על ATP. בניגוד למחקרים אחרים המאפיינים את האינטראקציה של ATP או ה- ATP-מחק מולקולות קטנות עם חלבונים שכותרתו אקראית עם fluorophores אחד או יותר ^38-40, מחקר זה כולל גרסה שכותרתו של aptamer 7.9 kDa ssDNA עם מולקולת Cy5 אחת בקצה 5' . נגזר ATP שונה ומולקולות קשורות, כל משתנה בין ATP בתפקידים שונים, שמשו כדי למפות את אתר הקישור על מולקולת ATP. סדרת דילול (ב -16 .......

דיון

בקרות איכות:

דבק נוקבים / ספיחה של חומר מדגם למשטחים, וכן תופעות צבירה, יש השפעה דרמטית על איכות נתוני הזיקה. עם זאת, רק המדינה- of-the-art כמה טכנולוגיות מציעות אפשרויות מדויקות ומהירות לפקח למנוע את ההשפעות הללו. MST מציעה בקרת איכות משולבת המאתרות לעזור להתגבר על בעיות אלה, המאפשרים אופטימיזציה בשלבים של ההגדרות הטכניות. מידע חשוב על תופעות דבקות קרינה יכול להיות מופק סריקת הנימים והצורה נימי (שלבי 5.2 ו -7.5), ו.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
		קשירה של אפטמר	20 מ"מ Tris pH 7.6; 300 מ"מ NaCl; 5 מ"מ MgCl2; 0.01% Tween-20
Fluorescently labelly ATP aptamer	IDT, Leuven, Belgium		sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP	Sigma Aldrich, גרמניה	A2383	פתרונות מלאי של 10 מ"מ מאוחסנים בטמפרטורה של - 20 מעלות; C
ADP	סיגמא אולדריץ', גרמניה	A2754	פתרונות מלאי של 10 מ"מ מאוחסנים בטמפרטורה של - 20 מעלות; C
AMP	סיגמא אולדריץ', גרמניה	A2252	פתרונות מלאי של 10 מ"מ מאוחסנים בטמפרטורה של - 20 מעלות; C
אדנין	סיגמא אולדריץ', גרמניה	A8626	פתרונות מלאי של 10 מ"מ מאוחסנים בטמפרטורה של - 20 מעלות; C
SAM	סיגמא אולדריץ', גרמניה	A7007	10 מ"מ מאוחסנים בטמפרטורה של - 20 מעלות; C
dATP	סיגמא אולדריץ', גרמניה	11934511001	פתרונות מלאי של 10 מ"מ המאוחסנים בטמפרטורה של - 20 מעלות; C
CTP	סיגמא אולדריץ', גרמניה	C1506	פתרונות מלאי של 10 מ"מ מאוחסנים בטמפרטורה של - 20 מעלות; C
GTP	סיגמא אולדריץ', גרמניה	G8877	פתרונות מלאי של 10 מ"מ מאוחסנים בטמפרטורה של - 20 מעלות; C
מונוליט NT.115	NanoTemper Technologies, מינכן, גרמניה	MO-G008	ערוץ כחול/אדום מכשיר MST עם גלאי סטנדרטי, Monolith NT115 pico הוא מכשיר MST עם גלאי רגישות גבוהה
Monolith NT.115 נימים סטנדרטיים	NanoTemper Technologies, מינכן, גרמניה	MO-K002
צינורות Eppendorf PCR	Eppendorf, גרמניה	30124537
תוכנת בקרת Monolith. 2.1.33, מותקן מראש על המכשיר	NanoTemper Technologies, מינכן, גרמניה
MO.affinity analysis v2.1.1	NanoTemper Technologies, מינכן, גרמניה
Kaleidagraph 4.5.2	Synergy Software

מאגר פתרונות מלאי