מאמר שיטה

ייצור ומנהלה של גזע הטיפולי mesenchymal / תא סטרומה (MSC) Spheroids הדרוך בתרבויות 3-D בתנאים קסנו ללא

11.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55126

⸱

18 במרץ 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Mary Hardin-Baylor, 2Department of Pediatrics, University of Texas Medical Branch, 3Multi-Organ Support Technology Task Area, U.S. Army Institute of Surgical Research, 4Internal Medicine, Texas A&M University Health Science Center

במאמר זה

סיכום

הפוטנציאל הטיפולי של תאי גזע/סטרומה מזנכימליים (MSCs) מתועד היטב, אולם השיטה הטובה ביותר להכנת התאים לחולים נותרה שנויה במחלוקת. כאן, אנו מתקשרים פרוטוקולים ליצירה וניהול יעיל של אגרגטים כדוריים טיפוליים או 'ספרואידים' של MSCs המוכנים בתנאים נטולי קסנו ליישומים ניסיוניים וקליניים.

תקציר

גזע mesenchymal / בתאי סטרומה (MSCs) מחזיקים הבטחה גדולה Bioengineering ורפואה רגנרטיבית. MSCs יכול להיות מבודד רקמות בוגרות מרובות באמצעות הדבקות החזקה שלהם פלסטיק בתרבית רקמה ולאחר מכן להרחיב עוד יותר במבחנה, לרוב תוך שימוש בסרום שור עובר (FBS). מאז FBS יכול לגרום MSCs להפוך immunogenic, נוכחותה תרבויות MSC המגבילה הוא יישומים קליניים וניסויים של התאים. לכן, מחקרים והעסיקו עובדים ללא קסנו הגדרה כימית (XF) מדיה עבור תרבויות MSC היא יקרה ערך. השפעות מועילות רבות של MSCs יוחסו יכולתי לווסת דלקת חסינות, בעיקר באמצעות הפרשת גורמי מערכת חיסוניים כגון גן גורם מגורה נימק גידול 6 (TSG6) ו פרוסטגלנדין E2 (PGE2). עם זאת, MSCs מחייב הפעלה לייצר גורמים אלה שכן ההשפעה של MSCs היא לעתים קרובות חלף, עניין רב התפתח לגלות דרכים של טרום הפעלת PRIO התאיםr כדי השימוש בהם, ובכך לחסל את זמן השהיה עבור ההפעלה in vivo. כאן אנו מציגים פרוטוקולים כדי להפעיל ביעילות או MSCs הממשלה תלת ממדי (3D) תרבויות בתנאי XF הגדרה כימית ולנהל MSCs מראש מופעל אלה in vivo. באופן ספציפי, אנו מתארים שיטות ראשונות שיצרו MSC הכדורי-רקמות מייקרו או 'spheroids' בטיפות תלויות באמצעות מדיום XF ולהדגים כיצד הספירות והתנו הבינוני (CM) ניתן לקצור עבור יישומים שונים. שנית, אנו מתארים מסכי ביטוי גנים במבחנת מבחנים תפקודיים כדי להעריך את הרמה במהירות של הפעלת MSC ב spheroids, תוך שימת דגש על הפוטנציאל אנטי-דלקתי ואנטי-סרטני של התאים. שלישית, אנו מתארים שיטה חדשה להזריק spheroids MSC השלם לתוך חלל הצפק העכבר לבדיקות יעילות vivo. בסך הכל, את הפרוטוקולים בזאת להתגבר על האתגרים העיקריים של קבלת MSCs מראש מופעל תחת con XF הגדרה כימיתditions ולספק מערכת גמישה לניהול spheroids MSC עבור טיפולים.

מבוא

גזע mesenchymal / בתאי סטרומה (MSCs) הראה פוטנציאל גדול עבור גישות רפואת רגנרטיבית שונות. MSCs בתחילה בודדו כמרכיב סטרומה של מח העצם אבל מאז התקבלו מחברת רקמות בוגרות רבות אחרות, כולל רקמת שומן 1, 2, 3. מעניין לציין, כי שיטת הבידוד העיקרית מחבק תכונה יוצאת דופן של MSCs להיצמד בחוזקה על פלסטיק בתרבית רקמה בנוכחות בסרום שור העובר (FBS). בעוד טכניקת בידוד המסורתית הזה מאפשרת רחבה קלה ומהירה של MSCs ב דו ממדים (2D) תרבות, זה גם מאוד מלאכותי ומתעלם משמעות של תלת ממדי (3D) בסביבה המקורית שמובילה לאובדן פוטנציאל של מאפיינים תאיים חשובים 4, 5 , 6. לכן, המחקר של MSCs בתרבויות 3D, אשרהם יותר פיסיולוגיים מאשר תרבויות 2D מסורתיות, התפתח בחיפוש עבור "אבדו / פחתה" מאפייני MSC. יתר על כן, עניין רב עלה לזהות תנאים מוגדרים קסנו-חינם (XF) כימי לתרבות הפעלת MSC, ובכך להפוך את התאים יותר נוחים עבור יישומים קליניים.

מחקרים רבים פורסמו הוכחת תרבות 3D של MSCs היא biomaterials וכפי אגרגטים או spheroids כדוריים. MSCs ב biomaterials בתחילה תוכנן עבור גישות הנדסת רקמות להחליף רקמות פגועות עם פיגומי תא זרע, ואילו תרבויות אליפטית של MSCs נראו כדרך להבין את התנהגות MSC in vivo לאחר מתן של התאים עבור טיפולים בניסויים פרה-קליניים או קליניים 4, 5, 7. מעניין, spheroids טופס MSCs ספונטני כאשר דבקות פלסטיק בתרבית רקמה אינה מותרת8, 9, 10. באופן מסורתי, צבירה התא התאפשרה על ידי שיטות בקבוק טווה או טכניקות כיסוי נוזלי, שיטות השתמשו בתחילה בביולוגיה סרטן במאמצים לנסות לחקות את המיקרו-סביבה של הגידול. לאחרונה, שיטות נוספות צצו ממחישי צבירת תא כלי תרבות מראש מצופית עם כימיקלים מסוימים כדי למנוע תא אל הפלסטיק דבק 4, 5, 6. אחת השיטות הפשוטות ביותר וחסכוני ליצור spheroids MSC היא תרבות אותם בטיפות תלויים, טכניקה ששימשה לעתים קרובות לייצר גופים embryoid מתאי גזע עובריים. עם תלוי טכניקת תרבות ירידה, דבקות תא הפלסטיק בתרבית רקמת נמנע בשל השעיית תאי ירידה של מדיום על החלק התחתון של מכסת צלחת בתרבית רקמה ומאפשר הכביד כדי להקל תא aggregation ב הקודקוד של ירידה. גודל אליפטית ניתן להשפיע בקלות על ידי שינוי ריכוז התא או נפח ירידה, מה שהופך תרבויות Drop Hanging במיוחד קל לשלוט.

מחקרים מוקדמים על תרבות 3D של MSCs הפגינו שוני קיצוני קיים בין המאפיינים של תאי 3D לעומת עמיתיהם 2D שלהם 6, 8, 9. במקביל, דיווחים הראו כי ההשפעות המיטיבות של MSCs in vivo הסתמכה על יכולתם להיות מופעל על ידי רמזים מיקרו-סביבתיים, בתגובה, כדי לייצר אנטי דלקתי אימונו גורמי 11. מעניין לציין, כי רבים של גורמים אלה כגון פרוסטגלנדין E2 (PGE2), מגורה גורם נמק גידול גן 6 (TSG6), ואת גורם הגדילה hepatocyte (HGF) יוצרו בכמויות הרבה יותר גדול על ידי spheroids MSC מ MSCs 2D המסורתית לסלול את הדרך עבור רעיון שלבתרביות 3D כדי להפעיל את תאי 8, 12, 13. יתר על כן, הפעלת גנים בתרבויות 3D הופיע לשחזר מנגנונים, לפחות חלקית, של הפעלת תא לאחר ההזרקה לעכברים 12. על ידי הפעלת MSCs לפני השימוש בם בניסויים, אפקטים של התאים עשויים להתמשך ובולטים יותר כהשפעת MSC המסורתית in vivo היא לעתים קרובות מתעכבת וחולפת, והוא יכול להיות מתואר כמו "פגע וברח". במהלך השנים האחרונות, מחקרים תפקודיים חשובים באמצעות spheroids MSC הוכיחו כי הם יכולים לדכא תגובות דלקתיות ולווסת חסינויות in vivo באמצעות השפעה על תאי מפעיל כגון מקרופאגים, תאים דנדריטים, נויטרופילים, ותאי T ביצוע spheroids צורה אטרקטיבית של MSCs הדרוך 2 , 3. בנוסף, ייצור של מולקולות אנטי-סרטניות, כגון interleukin-24 (IL-24) ו נימקים גידול קשור גורם ליגנד וישכנע אפופטוזיס (TRAIL), גוברים בתרבויות 3D של יחסי MSCs כדי חד שכבתי MSCs, תופעה שעלולה להיות מנוצלת על בטיפולי הסרטן ממוקד 8, 10, 14.

כמו התרבות MSC המסורתית נדרשה לא רק את שימוש פלסטיק בתרבית רקמה אלא גם FBS, משוכה נוספת וגדילה ל spheroids MSC יותר נוחה לשימוש קליני היה הצורך להתגבר. כדי להתמודד עם המשוכה הזאת, הראינו היווצרות לאחרונה של spheroids MSC בתנאי XF ספציפי הגדרה כימית והקמתי כי spheroids MSC וכתוצאה מכך הופעל לייצר המולקולות אנטי-דלקתית ואנטי-הסרטניות הזהות spheroids שנוצר בתנאים עם FBS 14. הנה, ממצאים אלה מוצגים בכמה פרוטוקולים מפורטים המדגימים את הדור של MSCs מראש המופעל בתרבויות 3D באמצעות XFכְּלֵי תִקְשׁוֹרֶת. בנוסף, פרוטוקולים מוצגים המתארים דרכים יעילות כדי להעריך את רמות ההפעלה של MSCs לגבי ההשפעות אנטי דלקתית, המערכת החיסונית ואנטי סרטן שלהם, יחד עם שיטה מעשית כדי לספק את spheroids השלם לעכברים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

בידוד MSC 1. והרחבה

  1. השג MSCs מעבר מוקדם מן המרכז הכנה והפצה של תאי גזע בוגרים ( http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html ) 15 בקבוקונים קפוא כמו. לחלופין, לבודד MSCs מ aspirates מח עצם בעקבות פרוטוקול שגרתי 14 ולאחסן כמו צלוחיות קפוא.
  2. הכן בינוני תרבות שלמה (CCM), המהווה אלפא מדיום חיוני מינימלי (αMEM) בתוספת פרמיה 15-20% בחרו FBS, 2 מ"מ L- גלוטמין, ו 1x-סטרפטומיצין פניצילין. לעקר את המדיום על ידי סינון.
  3. מניחים 30 מ"ל של CCM לתוך צלחת תרבית תאים 150 מ"מ ו דגירה את המנה למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified המכיל 5% CO 2.
  4. דגירה בקבוקון קפוא המכיל כ 10 6 MSCs למשך 2 דקות בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
  5. מעבירים את תכולת הבקבוקון כדי בצלחת תרבות באמצעות pipet 5 מ"ל סרולוגיות ולשטוף מספר פעמים בקבוקון עם 1-2 CCM מ"ל מצלחת ללכוד תאים שיורית. מניחים את לילה המנה באינקובטור המתאים.
  6. בזהירות לשטוף את תרבות פעמיים עם בופר פוספט בטמפרטורת החדר (PBS) ולנתק את MSCs עם 3 מ"ל של תמיסת מראש חימם 0.25% טריפסין / ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA). ניתוק בדרך כלל לוקח כ 3-4 דקות בחממה.
  7. לנטרל את טריפסין בצלחת עם 6 מ"ל CCM מחומם מראש ל -37 ° C ולהעביר את ההשעיה התא לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. מערבבים עם שטיפות של PBS על מנת למקסם את התשואה התא.
  8. בצנטריפוגה תאים (450 XG) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לשאוב supernatant.
  9. Re- להשעות את התאים בנפח קטן של CCM לספור את התאים קיימא באמצעות hemocytometer trypan כחול.
  10. זרעים של מספר הולם של מנות 150 מ"מ ב -100 תאים / 2 ס"מ ב 30 מ"ל של CCM חם ו דגירה התרבויות עד כ 70-80% ומחוברות, בדרך כלל 7 ימים עם המדיום משתנה כל 2-3 ימים 24-48 שעות לפני הקציר.
  11. קציר התאים כנ"ל עם טריפסין / EDTA ולשלב כל התאים לתוך צינור חרוטי יחיד עם המדיום המתאים. צנטריפוגה שוב מחדש להשעות את התאים לתוך נפח קטן של אותו המדיום עבור ספירת תאים. השתמש CCM סטנדרטי (המכיל FBS) או שונים זמינים מסחרית ניסוחים מדיה XF, כאן המכונה XF בינוני 1 (XFM-1) ו XF בינוני 2 (XFM-2), עם או בלי אלבומין בסרום אדם (HSA, 13 תוספת מ"ג / מ"ל).

2. הכנה הופעל MSC Spheroids ב 3-D תליית תרבויות זרוקות תחת תנאי XF

  1. כדי ליצור spheroids של 25,000 תאים כ, לדלל את MSCs שנקטפו לתוך CCM, XFM-1, XFM-1 + HSA (13 מ"ג / מ"ל), XFM-2, או XFM-2 + HSA (13 מ"ג / מ"ל) ב 714 תאים / μl.
  2. טיפות פיפטה 35 μl / של תאים על גביהחלק התחתון של מכסה צלחת תרבות הפוכה 150 מ"מ. טיפות מרובות ניתן pipetted בקלות באמצעות פיפטה רבה.
    הערה: אם spheroids גדול יותר או קטן הם רצויים, לשנות את ריכוז תאים או נפח הירידה (25-45 μl) כראוי.
  3. העבר 20 מ"ל של בטמפרטורת החדר PBS לתוך הבסיס של המנה ובאחד תנועה רציפה ויציבה להעיף את המכסה, המכיל את טיפות, כך apices ירידה כלפי מטה. מניח את המכסה בזהירות על הבסיס של מנת התרבות.
  4. מעביר את הצלחת לתוך החממה במשך 3 ימים מבלי להפריע זה להתיר הרכבה בתחום מתאימה.
  5. לאחר 72 שעות, להתחיל את הקציר אליפטית ידי הסרת המכסה בזהירות היפוך זה כך טיפות, שוב, כלפי מעלה.
  6. זווית את המכסה כ 10-20 ° ולדחוף את טיפות, המכיל את spheroids, עד לקצה הצלחת באמצעות מרים תא.
  7. מעבירים את התחומים ובינוניים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל עם צינור μl 1,000טטי. השתמש בטמפרטורת החדר PBS ו פיפטה עם אותו קצה לשטוף את הצלחת להבטיח התאוששות מקסימלית של spheroids.
  8. עבור מבחני PCR בזמן אמת (פרוטוקול 3), בצנטריפוגה ההשעיה בתחום ב -450 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר לשאוב supernatant. שטפו את spheroids עם PBS וחזור הן הצעדים צנטריפוגה והשאיפה. למסירה לתוך חיים (פרוטוקול 8), לאפשר התחומים להתיישב התחתון של הצינור (~ 3-4 דקות) ללא צנטריפוגה.

3. PCR בזמן אמת של סמנים ואנטי דלקתי אנטי-סרטניות

  1. השתמש בערכת RNA החילוץ עם עמודות homogenizer ו RNase ללא DNase סט לבודד RNA סך DNA ללא מ MSCs בשכבה (פרוטוקול 1) ו spheroids MSC (פרוטוקול 2) כי נשטפו עם PBS ו centrifuged.
  2. Lyse לפחות 100,000 MSCs בשכבה ו -20 spheroids מכל מצב צינורות חרוטי 15 מ"ל נפרד עם חיץ RLT המכיל β-mercaptoethanol (1: 100).
  3. עָבָרFER את lysates מעורבת ביסודיות לתוך צינורות 1.5 מ"ל RNase ללא מקום לתוך המקפיא (-80 מעלות צלזיוס) במשך לפחות 3 שעות כדי לסייע תמוגה אליפטית.
  4. ההפשרה lysates התא על קרח, מערבולת בקצרה, ופעל בהתאם להוראות היצרן עבור בידוד RNA באמצעות ערכת בידוד RNA הכולל יונקים זמינים מסחרית.
  5. לכמת ולהעריך את איכות RNA הבודד באמצעות ספקטרופוטומטר.
  6. השתמש בקיבולת גבוהה ערכת שעתוק לאחור cDNA או שווה ערך על פי הוראות היצרן כדי ליצור cDNA עבור PCR בזמן אמת.
  7. מניחים דגימות cDNA, נועד מסחרית פריימרים PCR בזמן אמת / בדיקות (מבחני ביטוי גנים), ו- PCR מיקס מאסטר על הקרח. השתמש פריימרים / בדיקות עבור GAPDH (שליטה), PTGS2 (COX-2, אנטי דלקתי), TNFAIP6 (TSG6, אנטי דלקתי), TRAIL (נגד סרטן), ו- IL-24 (אנטי סרטניים).
  8. הכן את התגובות בזמן אמת PCR פי הוראות היצרן עבור מבחני ג'ין הביטוי Unive מהירמיקס מאסטר rsal.
  9. פעל בהתאם להנחיות עבור מכשיר PCR בזמן האמת להפקת מסמכי הניסוי וביצוע הריצה.
  10. לנתח את הנתונים בשיטת T ΔΔC ידי חישוב השינויים היחסיים (כמות יחסית, RQ) ב ביטוי גנים באמצעות GAPDH כמו MSCs המלא בשכבת אנדוגני כבסיס 8, 14.

אוסף 4. של CM עבור מבחנים של מערכת חיסונית ואת הפוטנציאל אנטי-סרטני

  1. קציר spheroids ו CM כמתואר לעיל לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל, באמצעות מרים תא ו פיפטה, לעומת זאת, לא לשטוף את מכסים בצלחת עם PBS כמו זה יהיה לדלל את CM.
  2. צנטריפוגה ב 450 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, בזהירות לאסוף את supernatant תא ללא עם טפטפת, ולהעביר את supernatant לתוך צינורות 1.5 מ"ל.
  3. צנטריפוגה ב XG 10,000 למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר, בזהירות לאסוף את CLCM arified עם טפטפת, ולהעביר את CM לתוך צינורות 1.5 מ"ל חדש לאחסון במקפיא (-80 ° C). כן aliquots של CM לפני ההקפאה כאשר משתמשים בו עבור מבחנים מרובים.
    הערה: לפני ביצוע מבחנים במורד זרם, ריכוז PGE2, אינדיקטור טוב של פוטנציאל אנטי-דלקתי של CM, ניתן לקבוע באמצעות ערכת ELISA מסחרית לפי הוראות היצרן. ריכוז TSG6 ניתן לקבוע באמצעות פרוטוקול פרסם 14.

5. Assay Macrophage כדי להעריך את הפוטנציאל האנטי-דלקתיות של MSC-CM

  1. הכן בינוני מקרופאג, אשר מורכב של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) המכיל L-alanyl-L- גלוטמין ו בתוספת 10% פרמיה לבחור FBS ו 1x פניצילין, סטרפטומיצין. מסנן לעקר את המדיום.
  2. השג בקבוקון קפוא של כ 10 6 מקרופאגים העכבר J774 דגירה בקבוקון למשך 2 דקות בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
  3. מעבירים את תכולת הבקבוקון לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל, להוסיף 9 מ"ל של מדיום מקרופאג, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 200-300 XG ו בטמפרטורת החדר.
  4. לשאוב supernatant, להשעות את מקרופאגים לתוך 1 מ"ל של מדיום מקרופאג, ולהעביר את מקרופאגים לתוך צלחת פטרי 150 מ"מ המכיל 30 מ"ל של מדיום מקרופאג.
  5. שנה את בינונית כל 2 ימים דגירה התאים בחממה עד ומחוברות 70-80% כ.
    הערה: המקרופאגים לא להיצמד בחוזקה כדי בצלחת פטרי, ובכך יש להיזהר לא לאבד את התאים עם שינוי בינוני.
  6. קציר מקרופאגים ידי ריסוס המדיום מקרופאג על גבי תאים עם טפטפת. העברת התאים לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 200-300 XG ו בטמפרטורת החדר.
  7. לשאוב supernatant ו להשעות את תאי נפח קטן של מדיום מקרופאג עבור ספירת תאים עם hemocytometer. התאם את הריכוז 200,000 תאים / מ"ל ​​עם מקרופאג ליdium.
  8. כדי להפעיל את להגדיר עבור assay מקרופאג, להוסיף 480 μl של מדיום מקרופאג לתוך הבארות של צלחת 12-היטב.
  9. הוסף 20 μl של מדיום מקרופאג לתוך בארות שליטה הלא מגורה 20 μl של בתווך בלתי מותנה או MSC ממוזג, מוכן לעיל, בבארות ניסיון. מערבבים את בינוניים הבארות על ידי הקשה על צלחת.
  10. העבר 500 μl של השעית תא מקרופאג אל בארות שליטה מקרופאג הלא מגורה.
  11. לעורר את מקרופאגים הנותרים עם תוספת של 1: 500-1: 1,000 של 0.1 מ"ג / מ"ל ​​lipopolysaccharide (LPS) דגירה 5-10 דקות בטמפרטורת החדר.
  12. העבר 500 μl של מקרופאגים מגורה לתוך הבארות עם בתווך בלתי מותנה או MSC ממוזג. מערבבים את בארות ידי בהתמדה נדנדה את הצלחת כמה פעמים.
  13. מעביר את הצלחת באינקובטור במשך 16-18 שעות.
  14. קציר המדיום ממוזגים מקרופאג ו צנטריפוגות ב XG 500 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  15. לְהַעֲבִירsupernatant לתוך צינורות assay חדשים עבור אלפא tumor necrosis factor (TNF-α) ו- interleukin-10 (IL-10) תוכן לפי ערכות מסחריות ELISA בעקבות הוראות היצרן.

6. Assay Splenocyte כדי להעריך את הפוטנציאל המערכת החיסונית של אליפטית-CM

  1. הכן בינוני splenocyte מלאה, אשר מורכב של מכון הזיכרון Rosewell פארק (RPMI) בינוני -1640 בתוספת 10% חום מומת FBS, סטרפטומיצין פניצילין 1x, ו -2-mercaptoethanol. מסנן לעקר את המדיום.
  2. טחול קציר מעכברים BALB מורדמים-זכר / ג דרך חתך מוכן בצד השמאלי של הבטן מעל הטחול, כ באמצע הדרך בין החלק הקדמי ורגליו האחוריות 14. מעבירים את הטחול כדי מסננת תא 70 מיקרומטר לבודד את splenocytes 14.
  3. לבודד את splenocytes / לימפוציטים על ידי לחיצה על טחול דרך מסננת 70 מיקרומטר לתוך usin צלחת פטרי סטריליתז סוף רך גומי / פלסטיק של הבוכנה של 2-3 מ"ל מזרק 14. השתמש תנועה מעגלית שחיקה לנתק את הטחול.
  4. שטפו את מסננת תא מספר פעמים עם PBS קר להעביר תאים מצלחת פטרי לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. מלאו את הצינור עם PBS קר צנטריפוגות (500 XG) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
  5. לשאוב supernatant ולנקות את התאים מן אריתרוציטים ידי הדגירה עם 5-10 פתרון תמוגה תאי הדם האדומים מ"ל (מחיר הטחול) למשך 5-10 דקות.
  6. עצור את תמוגה על ידי הוספת PBS קר אל הצינור צנטריפוגות במשך 5-10 דקות ב XG 500 ו ב 4 מעלות צלזיוס.
  7. להשעות את התאים המבודדים במדיום splenocyte מלא, לסנן דרך מסננת 40 מיקרומטר, לספור את התאים באמצעות hemocytometer. הוסף בינוני splenocyte על השעיית התא כדי להשיג ריכוז התא הסופי של 10 6 תאים / מ"ל
    הערה: טכניקה זו בדרך כלל מניבה כ 3 x 10 7 splenocytes לכל טחול עכבר.
  8. לעורר את המספר המתאים של splenocytes עם 2 מיקרוגרם / אנטי CD3e נוגדן מ"ל במשך 5 דקות.
    הערה: כמות splenocytes נדרשת תלויה במספר תנאי ניסוי כפי שנקבע על ידי החוקר (ראה שלב 6.9). עבור כל מדגם ניסיוני / טוב, 10 6 splenocytes נדרשים.
  9. העברת 10 6 splenocytes (מגורה או הלא מגורה) לתוך הבארות של צלחת 12-היטב ולהוסיף ממוזג הלא (שולטת) או MSC-CM לתוך בארות בדילול סופי של 1: 10-1: 20.
  10. קציר את CM splenocyte לאחר 24 שעות ו צנטריפוגות ב XG 500 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  11. מעביר את supernatant לתוך צינורות assay חדשים עבור גמא אינטרפרון (IFN-γ) תוכן ידי ערכת מסחרי ELISA בעקבות הוראות היצרן.

7. Assay סרטן הערמונית כדי להעריך את הפוטנציאל האנטי-סרטניות של אליפטית-CM

  1. כן בינוני צמיחת RPMI שלם כי הוא בינוני RPMI-1640 בתוספת 10FBS%, 1x-סטרפטומיצין פניצילין.
  2. השג בקבוקון קפוא של תאי סרטן ערמונית LNCaP דגירת הבקבוקון עבור 2 דקות בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
  3. מעבירים את תכולת הבקבוקון לתוך צלחת תרבות המכיל 30 מ"ל של מדיום הגידול RPMI להשלים באמצעות pipettor ממונע ו pipet סרולוגיות 5 מ"ל. שטוף את פעמי בקבוקון כמה עם מדיום מצלחת ומניח בצלחת לתוך החממה.
  4. רק לפני התאים להגיע confluency, לשטוף את תרבות פעמיים עם בטמפרטורת החדר PBS ולנתק את תאי LNCaP עם 3 מ"ל של תמיסת טריפסין מחומם מראש 0.25% / EDTA.
  5. לנטרל את טריפסין בצלחת עם מדיום הגידול RPMI להשלים ולהעביר את התאים יחד עם שטיפות לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל.
  6. צנטריפוגה התאים ב 450 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לשאוב supernatant.
  7. מחדש להשעות את התאים לתוך נפח קטן של מדיום הגידול RPMI המלא ולספור את התאים הסרטניים באמצעות hemocytometer.
  8. העבר תאים LNCaP לתוך צלחת 96-גם ב 5000 תאים / היטב 120 μl של מדיום הגידול להשלים RPMI המכיל 25% של הלא ממוזג או אליפטית-CM. דגירה בחממה במשך 72 שעות.
  9. כדי לבצע assay צמיחת תאים באמצעות ערכת assay תא התפשטות, לשאוב את המדיום מבאר ולהעביר את הצלחת לתוך במקפיא (-80 ° C) לפחות 3 שעות.
    1. להפשיר את הצלחת lyse התאים בכל טוב על ידי הוספת 100 μl של מגיב תמוגה התא המכיל 180 mM NaCl, 1 mM EDTA, ו -0.2 מ"ג / מ"ל ​​RNase א
    2. עבור עקומת סטנדרט, לסכומים ידועים lyse של תאי LNCaP כמתואר לעיל.
    3. אחרי השעה 1, להוסיף 100 μl של חיץ תמוגה תא 1x המכיל 1: 100 דילול של מגיב assay התפשטות תאים למדוד את הקרינה בכל טוב כדי לקבוע את הכמות התאית.

8. משלוח Intraperitoneal של Spheroids Intact

  1. הכן MSCs אליפטית כמתואר לעיל (פרוטוקול 2) ו resuspend tהוא בתחומי המלח המאוזן של סטרילית האנק הפתרון (HBSS) השלים עם 0.2-0.5% HSA כדי לשמור על תנאי XF. HSA בפתרון מסייע במניעת הידבקות לכדור הפלסטיק במהלך הזרקה.
  2. העבר 40-120 spheroids לתוך 15 מ"ל צינורות חרוטי ולשטוף את התאים על ידי הוספת 6 מ"ל HBSS / HSA של חצוצרות. אפשר 3-4 דקות עבור תחומים לרדת. הכין צינור חרוטים עצמאי של spheroids עבור כל חיה. כמו כן, להכין צינורות נוספים של spheroids עבור מבחני קביעת שימור אליפטית (ראה 8.18 להלן) וייצור של גורמים טיפוליים לאחר ההעברה (ראה 8.19 להלן) אם תרצה בכך.
  3. לשאוב supernatant, כיסוי הספרואידים עם 100-200 μl של HBSS סטרילי השלימו עם 0.2-0.5% HSA, ולמקם את הצינורות על הקרח.
  4. בקצרה להרדים את החיות עם isoflurane 2% ב 100% חמצן עד היעלמות רפלקס קמצוץ הבוהן כ 2 דקות בחדר אינדוקציה.
  5. מניח את החיה בתוך ארון BSL-2, הגבה aspeCT למטה (בצד הגחון כלפי מעלה), עם זרימה רציפה של תערובת 1.5% isoflurane / חמצן באמצעות חרטומו.
  6. נקה את בטן העכבר הנמוכה עם כזה חיטוי כמו אלכוהול 70%.
  7. הסר את המכסה של 20 תוך ורידי G (iv) קטטר ולבצע את זריקת intraperitoneal עם הרכבת קטטר-סטילטו. השתמש ביד אחת להחזיק את עור העכבר אחר לבצע את הזריקה. אתר את נקודת ההזרקה בערך באמצע של קו מלאכותי חיבור אזור משותף מין ברך מכווצת עם קצה המחט מצביע לכיוון קו האמצע.
    הערה: הרכבת קטטר-הפגיון בעל עמידות גבוהה יותר מאשר מחט רגיל, ולכן אכפת צריכה להילקח כמו לא להזריק את המחט עמוקה מדי לתוך הבטן, אשר יכול לגרום לפגיעה באיברים פנימיים. חדירה של העור ולאחר מכן שרירים / קרום הצפק יכולים להיות מורגש במהלך השמת צנתר.
  8. הוצא בעדינות את המתכת סטילטו / מחט ממכלול קטטר-סטילטו. check את פגיון דם, שתן וצואה וזורק אותו. דם על המחט מצביע ניקוב האיבר הפנימי (ים).
  9. החזק את הקטטר הפלסטיק בתנוחה זקופה במהלך הזריקות להתיר זרימת נוזל.
  10. אשר את המיקום הנכון של הקטטר פלסטיק ידי הזרקת כ 100 μl של סטרילית HBSS / HSA באמצעות קטטר בעזרת פיפטה עם קצה 100-200 μl. מניחים את הקצה של קצה פיפטה בתוך מתאם מזרק קטטר להרכיב חותם חזק. לאט לאט להזריק את הנוזל בתוך חלל הצפק.
    הערה: נוזל קטטר וממוקמים כראוי יזרום בחופשיות בתוך חלל הצפק עם התאמה קלה בלבד של הקטטר. מיקום לא תקין של הקטטר (תת עורית או תוך-מעיים, או אם קצה האיברים הצפק נפצע המחט כגון כליות) יגדיל התנגדות ולהפחית זרימה. מיקום תת עורי יגרום במערך של "בועה" ברורה מתחת לעור.
  11. אסוף tהוא MSC spheroids, ערוכים 100-200 μl של HBSS / HSA (שלב 8.3), באמצעות קצה פיפטה 200 μl, ולהעביר את כל נפח של כדורים (40-120 תחומים) לתוך חלל הצפק באמצעות קטטר כפי שתואר לעיל.
  12. שטפו את שפופרת המכילה תחומי עם 100 μl של HBSS / HSA באמצעות אותו קצה כנ"ל לאסוף כל spheroids שיורית ולהזריק אותם לתוך חלל הצפק.
  13. (אופציונלי) להזריק 100 μl נוסף של HBSS / HSA לתוך חלל הצפק כדי לשטוף את הקטטר.
  14. מניחים את פד גזה טבול חומר מחטא על קטטר ולאט לאט להסיר את הקטטר מחלל הצפק וזורקים אותו.
  15. בעדינות לעסות את חלל הצפק עם האצבעות על מנת להבטיח חלוקה שווה של spheroids.
  16. בואו החיה להתאושש תחת השגחה צמודה ולצפות לדימומים מאתר ההזרקה.
  17. בדוק את הקטטר ואת צינור 15 מ"ל לכל spheroids הנותרים. זה נורמלי לצפות כמה כדורים בקטטר / צינור.
    הערה: הטכניקה המתוארת למסירת אליפטית MSC יכולה להיות מאומצת לשימוש בחיות נורמליות או במגוון מודלי פציעה. טכניקה זו שימשה בהצלחה להזריק spheroids לפגיעה בקרנית העכבר ומודלים endotoxemia, כמו גם מודל הצפק הנגרמת zymosan 8.
  18. כדי לכמת את מספר spheroids שמר (לא חובה), השתמש מגיב / ערכת כימות מספר הסלולרי מבוסס-DNA. החזק את הקטטר בשימוש מעל הצינור 15 מ"ל נמרצות לוותר HBSS / HSA באמצעות קטטר לכפות על כל התחומים הנותרים בחזרה לתוך הצינור 15 מ"ל.
    1. צנטריפוגה שפופרת 15 מ"ל ב XG 500 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר לשאוב supernatant. מעביר את הצינור המכיל את הגלולה אליפטית לתוך מקפיא (-80 מעלות צלזיוס) במשך לפחות 3 שעות.
    2. להפשיר את הצינור lyse הספירות על ידי הוספת 500 μl של מגיב תמוגה התא המכיל 180 mM NaCl, 1 mM EDTA, ו -0.2 מ"ג / מ"ל ​​RNase א
    3. עבור פקד, freEze ו lyse כמות של spheroids ידוע (רצוי שווה למספר של spheroids מוכן זריקה אחת) כמתואר לעיל.
    4. אחרי שעה 1, להעביר 100 μl של lysate התא, בשני עותקים, לתוך microplate 96-היטב ולהוסיף היטב כל 100 μl של חיץ תמוגה התא 1x המכיל 01:50 דילול של מגיב assay התפשטות תאים מתוך הערכה. לאחר 10 דקות, למדוד את הקרינה בכל טוב כדי לקבוע את מספר תחומים שלא הוזרקו ידי השוואת המדגם הניסיון (ים) עם מדגם השליטה.
  19. להעריך את רמת ההפעלה של spheroids המוכן להזרקה (אופציונלית) על ידי מדידת ריכוז של PGE2 ו TSG6 המיוצר על ידי תחומי עבירה. העברת 40-120 התחומים באמצעות קטטר, כמתואר לעיל, לתוך צלחת 12-היטב או 6-היטב המכיל 1 או 2 מ"ל αMEM בתוספת 2% FBS ו 1x פניצילין / סטרפטומיצין. מניחים את הצלחות בחממה במשך 6 שעות.
    1. מעבירים את המדיוםהבארות לאחר 6 שעות לתוך 1.5 או 15 מ"ל צינורות צנטריפוגות צינורות ב 450 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. מעבירים את supernatant תא ללא לתוך צינורות 1.5 מ"ל טרי בעזרת פיפטה ו צנטריפוגות ב XG 10,000 למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. מעביר את הבהיר CM (supernatant) לתוך צינורות 1.5 מיליליטר ו assay חדשים עבור ריכוז PGE2 (אינדיקטור טוב של פוטנציאל אנטי-דלקתי של CM) באמצעות ערכת ELISA מסחרית לפי הוראות היצרן. ריכוז TSG6 ניתן לקבוע באמצעות פרוטוקול פרסם 14.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בעבודה הנוכחית, תרבויות ירידה תלויות הועסקו כדי ליצור רקמות מייקרו כדורי קומפקטיות או 'spheroids' של MSCs מופעל בתנאי XF. מפת דרכי המחקר באיור 1 מתארת כי MSCs מעודד עצמי להרכיב לתוך spheroids מרחף תלוי טיפות במשך 72 שעות, שלאחריו spheroids, או CM עמוסה גורמים טיפוליים הנגזר בתחום, ניתן לאסוף ולנצל פוטנציאל בשני מחקר ויישומים קליניים. המספר הגדול של תאים הדרושים לייצור בתחום ניתן לרכוש בתוך שבוע על ידי זריעת MSCs בצפיפות נמו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

MSC האופטימלי לשימוש בכמה יישומי מחקר קליניים צריך להיות מופעל ביותר על מנת למקסם את התועלת שלהם, והכין מועדף בתנאי XF הגדרה כימית כדי למזער את המסירה של אנטיגנים פוטנציאל מרכיבים בינוניים xenogeneic כגון FBS. בפרוטוקולים המתוארים כאן, הראינו שיטות 1) להפעיל MSCs בתרבות 3D ידי היווצרות spheroids, 2) להשיג את הפעלת 3D של MSCs בתנאי XF, 3) להעריך את רמות ההפעלה של אליפטית MSCs לגבי אנטי שלהם דלקתית,-modulatory חיסונית, וכן פוטנציאל אנטי-סרטני, ו -4) לספק MSCs להפעילם מספר בלתי מוגבל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי P40RR17447 מענקים מהמכון הלאומי לבריאות ופרס RP150637 מהמכון למניעת סרטן ומחקר בטקסס. ברצוננו להודות לד"ר דרווין ג'יי פרוקופ על תמיכתו בפרויקט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
MEM-ואלפא; (אלפא בינוני חיוני מינימלי)ThermoFisher/Gibco12561049; 12561056; 12561072מדיום חיוני מינימלי להכנת מדיום גידול MSC (CCM)
FBS (סרום בקר עוברי), פרימיום נבחרAtlanta BiologicalsS11595; S11510; S11550; S11595-24רכיב של מצע תרבית שלם לכל סוגי התאים
L-glutamineThermoFisher/Gibco25030081; 25030149;מרכיב 25030164 של מצע תרבית שלם לכל סוגי התאים
פניצילין/סטרפטומיציןThermoFisher/Gibcoמרכיב15070063 של מצע תרבית שלם לכל סוגי התאים
יחידות סינון עיקור, 0.22 ומיקרו; m קרום PESMilliporeSigmaSCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; עיקור מדיה
צלחת תרבית תאים 150 מ"מNuncD8554  תרבית תאים
פורמה מעטפת מים CO2 חממה לחהThermo Fisherדגם 3110דגירה של תאים מתורבתים
MCSs מעבר מוקדםמרכז להכנה והפצה של תאי גזע בוגרים בטקסס A& מרכז מדעי הבריאות M המכללה לרפואה לרפואה המכון לרפואה רגנרטיבית בסקוט & NAשל תרביות דו-ממדיות ותלת-ממדיות של אמבט מים MSCs
VWR89501-468ל-37 מעלות; C
PipettesEppendorf492000904טיפול ידני בנוזלים
Pipete-AidDrummond Scientific Company4-000-300טיפול בפיפטים סראולוגיים
Costar סטרילי פיפט סרולוגי (5, 10, 25 ו-50 מ"ל)קורנינג4487; 4101; 4251; 4490טיפול בנוזל
PBS (מי מלח חוצץ פוספט), pH 7.4ThermoFisher/Gibco10010023; 10010072; 10010031; 10010049 עיבוד תרבית תאים
0.25% תמיסת טריפסין/EDTAThermoFisher/Gibco25200056; 25200072; 25200114הרמת תאים דבקים ופיזור אגרגטים של תאים
15 מ"ל צינור חרוטיCorning/BD Falconצנטריפוגתתאים
352097 50 מ"ל צינור חרוטיCorning/BD Falconצנטריפוגת
EppendorEppendorf / FisherScientific Model 5810Rצנטריפוגה תאים
Fisher Scientific26716ספירת תאים
טריפאן כחולSigma-AldrichT8154 SIGMAאי הכללת תאים מתים במהלך ספירת תאים בהמציטומטר
מוגדר xenofree MSC medium-1 (XFM-1)ThermoFisher / GibcoA1067501מדיה נטולת קסנו שפותחה במיוחד לצמיחה והרחבה של תאי גזע מזנכימליים אנושיים
מוגדרת xenofree MSC medium-2 (XFM-2)Stem Cell Technologies5420מדיום מוגדר ונטול קסנו לתאי גזע מזנכימליים אנושיים
HSA (אלבומין בסרום אנושי)Gemini800-120רכיב של מדיה MSC נטולת קסנו
rHSA (אלבומין סרום אנושי רקומביננטי)Sigma-AldrichA9731  רכיב SIGMAשל מדיה MSC נטולת xeno
בידוד RNA כולל ערכת מיניQiagen74104מיצוי RNA כולל
QiashredderQiagen79654הומוגניזציה של דגימה לפני מיצוי RNA כולל
ערכת DNase ללא RNAse Qiagen79254חיסול DNA על העמודה במהלך מיצוי RNA כולל
&בטא;-מרקפטואתנול סיגמא-אולדריץ'M6250  עיכוב ALDRICH של RNAs במאגר RLT
מערבולתVWR97043-562דגימת ערבוב
ספקטרופוטומטרBioradNARNA ריכוז ואיכות
קיבולת גבוהה ערכת שעתוק הפוך cDNA ThermoFisher/Applied Biosystems4368814שעתוק של סך ה-RNA לתוך
מבחני ביטוי גניםThermoFisher/Applied Biosystemsמשתנהשילוב פריימר/בדיקה עבור PCR
מהיר אוניברסלי PCR Master MixThermoFisher/Applied Biosystems4352042; 4364103; 4366073; תערובתמאסטר 4367846 לתגובת PCR בזמן אמת
מערכת PCR בזמן אמת (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)ABI PrizmNAPCR
1.5 מ"לEppendorf22364111צנטריפוגה של תאים, איסוף ואחסון דגימות
(-80 & deg; ג) מקפיאתרמו פישרדגם Thermo Forma 8695אחסון דוגמאות
PGE2 (פרוסטגלנדין E2) ELISA KitR& D SystemsKGE004Bהערכת ריכוז הציטוקינים בדגימה
DMEM (Dulbecco' s שונה Eagle medium)ThermoFisher/Gibco10566-016; 10566-024; 10566-032מדיית תרבית מקרופאגים
J774 מקרופאגים עכבריםATCCTIB-67קו תאים מקרופאגים עכבר
12 בארות צלחתקורנינג3513במבחנה גירוי מקרופאגים
LPS (ליפופוליסכריד)סיגמא-אולדריץ'L4130במבחנה גירוי מקרופאגים
עכבר TNF-a ערכת ELISAR& D SystemsMTA00Bהערכת ריכוז הציטוקינים בדגימה
עכבר IL-10 (אינטרלוקין 10) ערכת ELISAR& D SystemsM1000Bהערכת ריכוז הציטוקינים בדגימה
RPMI-1640 בינוניThermoFisher/Gibco11875-085מדיה לתרבית טחול
עכברי BALB/cמעבדת ג'קסון651in vivo משלוח ספרואידים; הכנת טחול
Anti-Mouse CD3e Functional GradePurified eBioscience145-2C11in vitro גירוי טחול
70 μ מסננת M קורנינג352350הכנת טחול
תמיסת ליזה של תאי דם אדומים (1x)Affymetrix eBioscience00-4333הסרת כדוריות דם אדומות במהלך בידוד הטחול
עכבר IFN-γ (אינטרפרון גמא) ערכת ELISAR& D SystemsMIF 00אומדן ריכוז הציטוקינים בדגימת
תאי סרטן הערמונית LNCaP ATCCCRL-1740חוקר את ההשפעה של MSCs תלת מימדיים על קווי תאים סרטניים in vitro
DNA ערכת בדיקת התפשטות תאים מבוססתThermoFisherC7026מדידת מספר תאים המבוססת על תכולת DNA
NaClSigma-AldrichS5150רכיב של מגיב ליזה
EDTA (חומצה אתילנדיאמינטטראצטית)ThermoFisherFERR1021כלאטור סידן, רכיב של מגיב ליזה
Rnase AQiagen19101פירוק RNA למדידת
קורא מיקרו-פלטות רב-מצבי מבוסס מסנןDNA BMG TechnologyNAMicroplate astests (ELISA, כימות תאים, etc.)
HBSS (תמיסת מלח מאוזנת של הנקס), ללא סידן, ללא מגנזיום, ללא פנול אדוםThermoFisher/Gibco14175079חידוש של ספרואידים MSC לפני זריקות in vivo
איזופלורןMWI אספקת וטרינר502017הרדמה לזריקות in vivo
חמצן, גז דחוסPraxairNAלשימוש עם איזופלורן
תרמו פורמה BSL-2 ארוןתרמו פישרדגם 1385תרבית תאים סטרילית
בטיחות IV קטטר/סטילטו מחט, 20 גרם, 1 אינץ'TerumoSR*FNP2025אספקת שפרואידים לחלל הצפק
קצות מיקרופיפטה סטרילייםEppendorfמשתנהטיפול בנוזל/תאים
SCGPU11RESIGMA תרמו הכנת לבנה תאים 352098 המוציטומטר cDNA צינור צנטריפוגה בזמן אמת DNA

מקורות

  1. Keating, A. Mesenchymal stromal cells: New directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
  2. English, K., Wood, K. J. Mesenchymal stromal cells in transplantation rejection and tolerance. Cold Spring Harb Perspect.Med. 3 (5), a015560(2013).
  3. Le Blanc, K., Mougiakakos, D. Multipotent mesenchymal stromal cells and the innate immune system. Nat.Rev.Immunol. 12 (5), 383-396 (2012).
  4. Follin, B., Juhl, M., Cohen, S., Perdersen, A. E., Kastrup, J., Ekblond, A. Increased Paracrine Immunomodulatory Potential of Mesenchymal Stromal Cells in Three-Dimensional Culture. Tissue Eng.Part B.Rev. , (2016).
  5. Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. , 9176357(2016).
  6. Achilli, T. M., Meyer, J., Morgan, J. R. Advances in the formation, use and understanding of multi-cellular spheroids. Expert Opin.Biol. Ther. 12 (10), 1347-1360 (2012).
  7. Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng.Part B.Rev. 20 (5), 365-380 (2014).
  8. Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
  9. Potapova, I. A., et al. Mesenchymal stem cells support migration, extracellular matrix invasion, proliferation, and survival of endothelial cells in vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
  10. Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Eng.Part C.Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
  11. Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs Improve Myocardial Infarction in Mice because Cells Embolized in Lung Are Activated to Secrete the Anti-inflammatory Protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
  12. Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H., Bazhanov, N., Kuhlman, J., Prockop, D. J. Dynamic compaction of human mesenchymal stem/precursor cells into spheres self-activates caspase-dependent il1 signaling to enhance secretion of modulators of inflammation and immunity (PGE2, TSG6, and STC1). Stem Cells. 31 (11), 2443-2456 (2013).
  13. Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Coble, K., Prockop, D. J. Human mesenchymal stem/stromal cells cultured as spheroids are self-activated to produce prostaglandin E2 that directs stimulated macrophages into an anti-inflammatory phenotype. Stem Cells. 30 (10), 2283-2296 (2012).
  14. Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Tiblow, A., Prockop, D. J. Unique characteristics of human mesenchymal stromal/progenitor cells pre-activated in 3-dimensional cultures under different conditions. Cytotherapy. 16 (11), 1486-1500 (2014).
  15. Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White. , http://www.medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html (2016).
  16. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  17. Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat.Rev.Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
  18. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  19. Fontaine, M. J., Shih, H., Schafer, R., Pittenger, M. F. Unraveling the Mesenchymal Stromal Cells' Paracrine Immunomodulatory Effects. Transfus.Med.Rev. 30 (1), 37-43 (2016).
  20. Nemeth, K., et al. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nat.Med. 15 (1), 42-49 (2009).
  21. Prockop, D. J. Concise review: two negative feedback loops place mesenchymal stem/stromal cells at the center of early regulators of inflammation. Stem Cells. 31 (10), 2042-2046 (2013).
  22. Krampera, M. Mesenchymal stromal cell 'licensing': a multistep process. Leukemia. 25 (9), 1408-1414 (2011).
  23. Saleh, F. A., Genever, P. G. Turning round: multipotent stromal cells, a three-dimensional revolution? Cytotherapy. 13 (8), 903-912 (2011).
  24. Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Eng.Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
  25. Yeh, H. Y., Liu, B. H., Hsu, S. H. The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes. Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).
  26. Lee, E. J., et al. Spherical bullet formation via E-cadherin promotes therapeutic potency of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood for myocardial infarction. Mol.Ther. 20 (7), 1424-1433 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

peritonealPGE2TSG6

מאמרים קשורים