מאמר שיטה

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים תסיסנית Brains

DOI:

10.3791/55128

⸱

1 בדצמבר 2016

 ,  ,  , 
1Center for Metabolic and Degenerative Diseases, The Brown Foundation Institute of Molecular Medicine, Programs in Human and Molecular Genetics and Neuroscience, The Graduate School of Biomedical Sciences at Houston, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2Department of Natural Sciences, University of Houston - Downtown, 3Department of Neurobiology and Anatomy, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המוח תסיסנית הבוגרת הוא מערכת יקרה ללימוד מעגלים עצביים, תפקוד מוח גבוה, והפרעות מורכבות. שיטה יעילה כדי לנתח רקמות מוח כולו מראש הזבוב הקטן תקל מחקרים מבוססי מוח. כאן אנו מתארים פשוט, פרוטוקול לנתיחת צעד אחד של מוחות בוגרים עם מורפולוגיה השתמרה היטב.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש עניין גובר בשימוש תסיסנית מודל מחלות ניווניות במוח האנושי, למפות circuitries עצביים במוח הבוגר, וללמוד את הבסיס המולקולרי הסלולר של תפקודי מוח גבוהים. תכשיר כל ההר של מוחות בוגרים עם מורפולוגיה השתמרה היטב הוא קריטי ללימודי מוח מבוסס כולו כזה, אבל יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית ונדרש זמן רב. פרוטוקול זה מתאר גישת דיסקציה קלה ללמוד, צעד אחד של ראש זבוב בוגר תוך פחות מ -10 שניות, תוך שמירה במוח השלם מחובר לשאר הגוף כדי להקל מדרגות עיבוד שלאחר מכן. ההליך מסייע להסיר ביותר של רקמות העין לקנה הנשימה הקשורים בדרך כלל עם המוח שיכולים להפריע צעד הדמיה מאוחר יותר, וגם מציב פחות ביקוש על איכות מלקחיים לנתח. בנוסף, אנו מתארים שיטה פשוטה המאפשרת מרפרף נוח של דגימות מוח רכוב על coverslip, שהינה חשובה הדמיה משני צידי בגשמים בעצמה ואיכות אות דומות. כדוגמה של הפרוטוקול, אנו מציגים ניתוח של דופאמין (DA) נוירונים במוח הבוגר של WT (w 1118) זבובים. היעילות הגבוהה של השיטה לנתיחה עושה את זה שימושי במיוחד עבור מבוגר בקנה מידה גדולה מחקרי מוח מבוססים תסיסנית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האורגניזם המודל תסיסנית, הידוע בכינויו זבוב הפרות, כבר מוערך ארוך עבור הכלים הגנטיים האלגנטיים שלה, פעמי רבייה קצרות, ומאוד נשמר מסלולים מולקולריים תאיים. זבוב הפרות הועסק בהצלחה לנתח מסלולי איתות בסיסיים, מנגנוני הדפוסים של יצורים רבים-תאיים, כמו גם את מנגנוני התפתחות עצבית, פונקציות, ומחלות 1,2. עם התקדמות בטכנולוגיות תיוג הדמית תא, מוח זבוב פרות הפך חזק במיוחד במיפוי קנס של מעגלים עצביים לשלוף את הבסיס המולקולרי הסלולר של תפקודי מוח גבוהים, כגון למידה וזיכרון, וכן מקצב צירקדי 1,3, 4,5,6,7,8.

יתרון אחד מסוים של מערכת תסיסנית הוא גודלו הקטן יחסית, מה שמאפשר כל הר הכנה ובדיקה של המוח באמצעות תרכובת רגילה או מיקרוסקופ confocal. תיתכונה של אפשר ניתוחים אנטומיים מפורטים ופונקציונליים של מעגלים עצביים, או אפילו תא עצב יחיד, ברמות הסלולר subcellular, בהקשר של רקמות מוח כולו, ובכך לספק היא נקודת מבט הוליסטית של המטפלים בנושא והגיאומטריה המדויקת שלה בתוך המכלול מוֹחַ. עם זאת, בהתחשב בגודל מיניאטורי למדי של המוח, זה גם אתגר טכני לנתח רקמה במוח שלמה ביעילות מתוך תיק ראש השלד חיצוני המגן בתוך זבוב בוגר. יעיל שונה ופשוט יחסית שיטות לנתיחה תוארו בפירוט, אשר בדרך כלל כרוכות זהיר צעד חכם הסרה במקרה הראש ואת הרקמות הקשורות כוללות העיניים, קנה נשימה, שומן מהמוח 9 הראוי, 10. שיטות לנתיחת מייקרו אלה לעתים קרובות למקום יותר בדרישות המחמירות על איכות מלקחיים לנתיחה, בהסתמך על מלקחיים עם עצות גם מזדהות בסדר כי עלולים להיפגע בקלות. יתרה מזאת, כפי המוח הגזור הוא בדרך כלל בהסרהאד משאר הגוף, המוח יכול בקלות ללכת לאיבוד במהלך תהליכי המכתים והשטיפה עוקבים כי בעלי המידות הקטנות שלהם והשקיפות שלהם למאגר העיבוד. כאן, אנו מתארים פשוט יחסית וקל ללמוד, פרוטוקול לנתיחת צעד אחד עבור מוחות בוגרים שמחזיקים את המוח הגזור מצורף הטורסו. תהליך לנתיחה לעתים קרובות בקלות מנקה את רוב הרקמות הקשורים במוח כגון העין ואת קנה הנשימה ומקטין את הביקוש מלקחיים דיסקציה באיכות טובה.

בנוסף, כאשר הדמית המוח מתחת למיקרוסקופ מתחם הניאון או confocal, הצד של המוח כי הוא הרחק ממקור אור פלורסנט לעתים קרובות מייצר אות חלשה ותמונות פחות ברורות בשל העובי של המוח כל ההר. כאן אנו גם מתארים שיטת הרכבה פשוטה המאפשרת מרפרף קל של דגימות המוח, המאפשר הדמיה נוחה של שני הצדדים של המוח עם intensi אות הדומהty ואיכות.

כהוכחה של קונספט עבור היישום של השיטה בחקר המוח הבוגר, עוד בחנו את הנוכחות של נוירונים DA במוחם של w 1118 זבובים; גנוטיפ זה משמש לעתים קרובות כקו ההורי להפקת זבובים מהונדסים ואת שליטת wildtype במחקרים תסיסנית רבים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פתרונות 1. משמש המוח Dissection ו Immunofluorescent מכתים

  1. לנתח המבוגר לטוס המוח בנוזל השדרה מוחין מלאכותי (aCSF): 119 מ"מ NaCl, 26.2 מ"מ NaHCO 3, 2.5 מ"מ KCl, 1 מ"מ לאא 2 4 PO, 1.3 מ"מ MgCl 2, ו -10 גלוקוז מ"מ. לפני השימוש, הגז aCSF עם 5% CO 2/95% O 2 במשך 10 - 15 דקות ו ספייק עם 2.5 מ"מ CaCl 2. לעקר את הפתרון aCSF על ידי סינון דרך מסנן הממברנה 0.22 מיקרומטר.
    הערה: חנות aCSF ב 4 ° C על מנת למנוע זיהום חיידקי. טוס מוח יכול להיות גזור גם בתמיסה פוספט שנאגר מלוח (PBS), אם כי השוואה מפורטת של ההשפעות של שני הפתרונים לנתיחה על איכות ההדמיה הסופית של המוח הגזור לא בוצעה.
  2. השתמש paraformaldehyde 4% (PFA) שהוכנו 1x PBS כפתרון מקבע, אשר aliquoted בדרך כלל ומאוחסנים ב -20 מעלות צלזיוס.
    Caution: PFA הוא רעיל ומאכל וצריך לטפל בהם בזהירות.
  3. השתמש 1x PBS לשטוף את PFA מהמוחה ואחרי שלב הכביסה האחרון, במהלך מכתים immunofluorescent של המוח הגזור. הכן את PBS 1x מפתרון המניות 10x PBS (1.37 M NaCl, 27 KCl מ"מ, 100 מ"מ Na 2 HPO 4, ו -18 מ"מ KH 2 PO 4).
  4. השתמש 0.3% Tween-20 ב 1x PBS (1x PBT) עבור כל שלבי הכביסה הבאים במהלך מכתים immunofluorescent של המוח הגזור.

2. Dissection Microsurgical ראשים למבוגרים Fly

הערה: ההליך לנתיחה מתואר באיור 1.

  1. להרדים את הזבובים הבוגרים עם CO 2. בעזרת מלקחיים, להרים זבוב בקצרה dewax לציפורן שלה על ידי טבילה אותו אתנול 70% עבור 3 - 5 שניות. הדבר מבטיח כי אין בועות לדבוק לציפורן הזבובים כאשר שקוע בתוך aCSF או פתרון לנתיחה 1X PBS.
  2. תחתמיקרוסקופ לנתח עם מקור אור בזווית לא ייחסמו על ידי ידיים, להגדיר את העדשה אובייקטיבי כדי להשיג תצוגה ברורה של הזבוב (הגדלה 1.2x). שימוש במלקחיים עם יד nondominant כדי לשתק את החיה לטבול לטוס לתוך התמיסה לנתיחה הקרה עם הבטן שלה כלפי מעלה, כפי שמוצגת באיור 1 א.
  3. שמור מלקחיים בכל 160 - זווית ° 170 ביחס לצלחת לנתיחה, תוך הפעלת כוח קטן על הבטן של הזבוב (מאויר כחצים באיור 1 א). שלב זה יהיה לשתק את הזבוב לכפות את זה כדי להזיז את הראש לאחור על ידי 15 - 25 ° תוך הארכת החוטם כלפי מעלה. תוך כדי כך, אזור רך השקוף של לציפורן, מתחת החוטם, צריך להיות ברור. הגדל את ההגדלה ולהתאים את מישור המוקד על האזור הזה.
    הערה: אל תקרבו את המלקחיים חזקים מדי, אלא רק חברה מספיק כדי לייצבהזבוב. כוח רב מדי יגרום האיברים בתוך להתפקע לתוך התמיסה.
  4. השתמש ביד הדומיננטית ללחוץ על מלקחיים לנתח כך טיפים סגורים, אשר יפיקו כוח עמיד קל על קצות המלקחיים, כך המלקחיים יצמחו פתוחים כאשר לחץ מהיד החזקה הוא שוחרר. מקם את המלקחיים בניצב המלקחיים כשהוא לופת את הזבוב, כפי שמוצג באיור 1 ב.
    1. פירס הטיפים הסגורים של מלקחי דיסקציה דרך האזור הרך השקוף של לציפורן מתחת החוטם, כפי שמודגם על ידי החץ האדום באיור 1B. חשוב לא לחדור המלקחיים עמוקים מדי כי הוא בא במגע עם המוח. המוח הנכון צריך להיות גלוי. יש לשמור על אחיזה יציבה של הזבוב עם יד nondominant.
  5. במהירות אך בהתמדה, לשחרר את קצות מלקחיים דיסקציה בכוח משלה ולהסתמך על המומנטום מההשקה זה לקרוע tהוא שלד חיצוני סביב ראש הזבוב. שלמים במוח נכון צריך להיות גלוי (הרקמה הלבנה מייד מעל קצה המלקחיים התחתונים תרשים 1C) פעל קו דמיוני להנחות את המומנטום של טיפי המלקחיים שוחררו (המאויר כמו החצים האדומים החוצה שמוצגים באיור 1C). פעולה זו תסיר את שלד חיצוני בעדינות ביותר של העין הקשורים למוח קנה הנשימה מהמוח. התזמון הנכון ואת הכוח ליישם כדי לפתוח את השלד החיצוני יהיה תלוי ניסיון של החוקר.
    הערה: זהו השלב הקריטי ביותר במהלך הניתוח. חשוב לסמוך על הכח הטבעי המופק את המומנטום של מלקחי הפתיחה להסיר את השלד החיצוני תוך השאיר את המוח החשוף נשאר מחובר לשאר הגוף.
  6. השתמש מלקחיים ביד הדומיננטית להסיר את רקמות אבזר שריד בזהירות, כמו קנה הנשימה שמופיע כמבני סיבים לבנים remaining מצורפת המוח. היזהר שלא למשוך או נזק מוחי תקין.

3. מכתים Immunofluorescent של המוח

  1. תקן את דגימות מוח גזור עם torsos הקשורים בהם נע בין 1 מ"ל של 4% PFA עבור 40 - 60 דקות.
    הערה: השלבים זה שלאחר מכן, לשמור על צינורות או צלחות עם דגימות על nutator לערבב דגימות כראוי הפתרון.
  2. לשטוף עם 1 מ"ל של 1x PBS על ידי pipetting את הפתרון ולמטה 3 פעמים. היזהר שלא לשאוב את מוחם משם.
  3. לשטוף 5 פעמים עם 1x PBT במשך 5 דקות כל אחד. שמור את הדגימות על nutator במהלך דגירה.
  4. דגירה עם נוגדנים עיקריים ב O דילול הנכון / N ב 4 ° C.
  5. למחרת, להסיר את הנוגדנים הראשוניים, ולשטוף את הדגימות 5 פעמים עם 1x PBT. השאר את הדגימות עבור 5 - 10 דקות בתמיסת PBT 1x בין כל שטיפה. שמור את הדגימות על nutator במהלך דגירה.
  6. דגירת שטףדגימות נוגדנים משני מתאימים עם הדילול הציע ושעה של דגירה.
  7. שטוף את הדגימות שש פעמים עם 1x PBT עם דגירת 10 דקות בין כל שטיפה.
    שלב זה הוא קריטי עבור הסרת נוגדנים משני מחויב nonspecifically מן המדגם.
  8. מדגירים את דילול 1: 10,000 של 1 מ"ג / מ"ל ​​4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) בתמיסה 1x PBT במשך 30 דקות. DAPI הוא צבע DNA הנקשר אזורי AT של דנ"א שיכול לשמש כדי לחשוף את המורפולוגיה הכוללת של המוח.
  9. לשטוף שלוש פעמים עם 1X PBS.
  10. דגימות מעבירים לצלחת לנתיחה, ולהפריד את המוח מהגופים בצלחת לנתיחה באמצעות מלקחיים.
  11. לאחר הצעדים המכתימים ושטיפה, הר המוחות בין שני coverslips ולמקם את coverslips על גבי שקופית גוברת. בדרך זו, דגימות המוח ניתן התהפכו בקלות כך ששני צידי המוח ניתן הדמיה עם עוצמת אות דומה.
    הערה: הרכבת המוח על coverslip במקום ישירות בשקופית ההרכבה מאפשרת מרפרף של האורינטציה המדגמת בחופשיות. תהליך ההרכבה מוסבר ביתר פירוט בהמשך.
    1. הוסף coverslip 18 x 18 מ"מ על גבי שקופית גוברת. להרחיב את הפתח של קצה פיפטה עם להב ולהשתמש בו כדי להעביר את המוח בתמיסה 1x PBS על 18 x 18 מ"מ coverslip.
    2. מניחים את המוח על באמצע coverslip, להסיר את הנוזל סביב המוח עם קצה פיפטה בסדר, ולאחר מכן להוסיף עוד 20 - 40 μL של המדיום גובר אנטי לדעוך (0.2% (w / v) n-propyl gallate ב 99.5 גליצרול כיתה% ACS) את מוחם.
      הערה: הכמות גוברת הוסיף בינוני תלויה במספר של המוח שנבדק.
    3. בעדינות להפיץ את המוח בזמן דחק את ההרכבה הבינונית הצמיגה כלפי חוץ. מניח coverslip שני 18 x 18 מ"מ על גבי המוח על ידי הוריד את השקופית ראשונה מצד אחד עד שהוא יוצר מגע עםפני השטח של תלוש ההרכבה, ולאחר מכן הנמכת הצד השני לאט כדי למזער מגע מוח עם בועות אוויר.
      הערה: אין צורך להשתמש spacer בין שתי coverslips, כמו נפח של המדיום גובר ואת המוח אמור לספק מספיק מקום להפריד בין שתי coverslips.
    4. אפשר השקופיות להתיישב. הסר נוזל מוגזם שיוצאים מן הצדדים של תלושים עם רקמות במעבדה.
    5. כדי למנוע את coverslips עם המוח רכוב מלנפול השקופית הגוברת במהלך הובלה, השתמש פיסה קטנה של סרט לצרף את coverslips לשקופית הגוברת.
      הערה: Brains רכוב בין שקופיות ניתן הדמיה באופן מיידי או משומרים ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע ללא אובדן משמעותי של אות ניאון, ללא צורך להשתמש בכל איטום לאטום את השקופיות. עבור שימור לטווח הארוך של המוח המוכתם, הצד של שני תלושים יכול להיות אטום wמסמר ה- i פולני ומאוחסן -20 ° C במקפיא, למרות מוח מוכתם עלול לאבד האותות שלהם לאורך זמן. אפשרות זו אינה מומלצת.
  12. השתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי המתחם מתאים או מיקרוסקופ confocal כדי שזה יקלוט את המוח.
    1. ראשית, לרכוש את התמונה מהצד של המוח הקרוב אל המטרה, ולאחר מכן בזהירות להעיף את coverslips לקבל את הדגימות דחוקות באמצע. צעד זה הופך לפשוט רכישת התמונה של הצד השני של אותו המוח.
    2. השתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי המתחם זקוף עדשה 20X אובייקטיבית תמונה במוח (דוגמאות באיור 2) השלם מטרת 40X לאזורים קטנים תמונה של המוח, כגון נוירונים DA ב המדיאלי Anterior מותאם באזור האשכול (PAM) (דוגמאות באיור 3).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מדגים את ההליכים העיקריים לנתיחה המוח הבוגר, כמתואר לעיל איורים 2 ו -3 הם תמונות נציג של 3 ימים בת WT. (גנוטיפ: w 1118) מבוגר לטוס המוח, שהיו costained עם נוגדן נגד טירוזין hydroxylase (TH צבעוני, באדום באיור 2 ולבן באיור 3), סמן נפוץ לתייג נוירונים DA 11, בנוסף לצבוע DNA DAPI לתייג כל גרעיני תאים נוגדן כנגד חלבון Elav, סמן כל ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עם עניין גובר בשימוש מוח תסיסנית מבוגר כדי לחקור מחלות מוח אנושיות, מעגלים עצביים, ועל תפקוד מוח גבוה, יש צורך לפתח שיטות פשוטות ומהירות להשיג מוח זבוב על תילן כל הר מנתח, אשר חשוב במיוחד עבור מידה גדולה סולם מסך מוחי. השיטה שלנו מספקת פשוט וקל ללמוד גישה לנתח את ראש זבוב (לעתים קרובות תוך פחות מ 10 שניות עם ניסיון) עם מורפולוגיה השתמרה היטב כי מנוקה בעיקר של רקמות כלולות. כמו המוח הגזור עדיין מחובר לשאר הגופים לטוס, הם בדרך כלל לשקוע לקרקעית של הצינור מדגם במהירות והם קל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מכירים מר Enes מחמט, הגב 'קיארה אנדרדה, הגב' פילאר רודריגז, כריס קווק, והגב 'דנה Ghafir לתמיכה העצומה שלהם לפרויקט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
w*;   פארק<> ודלתא; 21/TM3,  P{GAL4-Kr.C}DC2,  P{UAS-GFP. S65T}DC10,  Sb1Bloomington Drosophila Stock Center51652Balancer הועבר ל-TM6B
PBac{WH}parkf01950Exelixis בבית הספר לרפואה של הרווארדf01950Balancer הועבר ל-TM6C
NaClFisher ScientificS640-500
נתרן ביקרבונט (NaHCO3) פישר סיינטיפיק02-003-990
אשלגן כלורי (KCl)פישר סיינטיפיקBP366-500
נתרן פוספט, מונו-בסיסי מונוהידראט (NaHCO3)פישרסיינטיפיק02-004-198
מגנזיום כלוריד (MgCl2)פישרסיינטיפיק02-003-265
D-סורביטולסיגמא-אולדריץ'S1876-500Gמחליף גלוקוז
סידן כלוריד דיהידרט (CaCl2)Sigma-AldrichC5670-500G
EMD Millipore  מסנני ממברנה Durapore PVDF: הידרופילי: 0.22 ומיקרו; m גודל נקבוביותפישר סיינטיפיקGVWP14250
תמיסת פורמלין, 10% (היסטולוגי)פישר סיינטיפיקSF98-20
אשלגן פוספט, דו-בסיסי, אבקה, ביוריאגנט אולטרה-טהורפישר סיינטיפיק02-003-823
טווין-20פישר סיינטיפיקBP337-500
אקסלטה פינצטה מדויקת עם נקודות עדינות מאודפישר סיינטיפיק17-456-055פרוטוקול אינו דורש נקודות עדינות במיוחד.
נוגדן נגד טירוזין הידרוקסילאזPel-Freez ביולוגיP40101
Rat-Elav-7E8A10 אנטי-אלאבהמחקרים ההתפתחותיים שיבוט בנק היברידומה7E8A10
עז נגד חולדות IgG (H+L) נוגדן משני, Alexa Fluor 647 מצומדThermoFisher ScientificA-21247
עז נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני, Alexa Fluor 594 מצומדThermoFisher ScientificA-11037
תמיסת DAPI (1 מ"ג/מ"ל)ThermoFisherScientific62248
אבקת פרופיל גלאטSigma-AldrichP3130-100G
מגיב גליצרול ACS, ≥ 99.5%Sigma-AldrichG7893-500ML
Zeiss Axioimager Z1ZeissQuote
ציטוטZeiss
Zen lite
Zeiss Apotome.2 ציטוט תוכנת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genetics. 199, 639-653 (2015).
  2. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan's legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163, 12-14 (2015).
  3. Aso, Y., et al. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, 04577(2014).
  4. Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11, 1114-1125 (2001).
  5. Yamagata, N., et al. Distinct dopamine neurons mediate reward signals for short- and long-term memories. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 578-583 (2015).
  6. Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 2967-2976 (2015).
  7. Waddell, S. Neural Plasticity: Dopamine Tunes the Mushroom Body Output Network. Curr Biol. 26, 109-112 (2016).
  8. Wolff, T., Iyer, N. A., Rubin, G. M. Neuroarchitecture and neuroanatomy of the Drosophila central complex: A GAL4-based dissection of protocerebral bridge neurons and circuits. J Comp Neurol. 523, 997-1037 (2015).
  9. Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 1472-1474 (2011).
  10. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
  11. Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5(2009).
  12. White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205(2010).
  13. Yang, Y., et al. Mitochondrial pathology and muscle and dopaminergic neuron degeneration caused by inactivation of Drosophila Pink1 is rescued by Parkin. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 10793-10798 (2006).
  14. Greene, J. C., et al. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4078-4083 (2003).
  15. Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8024-8029 (2005).
  16. Pesah, Y., et al. Drosophila parkin mutants have decreased mass and cell size and increased sensitivity to oxygen radical stress. Development. 131, 2183-2194 (2004).
  17. Trinh, K., et al. Decaffeinated coffee and nicotine-free tobacco provide neuroprotection in Drosophila models of Parkinson's disease through an NRF2-dependent mechanism. J Neurosci. 30, 5525-5532 (2010).
  18. Kim, K., Kim, S. H., Kim, J., Kim, H., Yim, J. Glutathione s-transferase omega 1 activity is sufficient to suppress neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson disease. J Biol Chem. 287, 6628-6641 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Drosophila Brain DissectionWhole Mount PreparationAdult Fly BrainDissection ProtocolBrain Morphology PreservationImmunohistochemistry StainingDopaminergic Neuron AnalysisConfocal Microscopy ImagingParaformaldehyde FixationAnti fade Mounting Medium

מאמרים קשורים