השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

Summary

חלבונים רבים מבצעים את תפקידם כאשר הם מחוברים למשטחי הממברנה. ניתן לדמות בעקיפין את הקישור של חלבונים חיצוניים על ממברנות ננו-דיסק על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה. אנו מראים כי הערימה האופיינית (רולו) של ננו-דיסקים הנגרמת על ידי הכתם השלילי נתרן פוספוטונגסטט נמנעת על ידי קשירה של חלבון חיצוני.

Abstract

חלבונים מונוטופיים מפעילים את תפקידם כאשר הם מחוברים למשטח הממברנה, ואינטראקציות כאלה תלויות בהרכב השומנים הספציפי ובזמינות של מספיק שטח לביצוע הפונקציה. ננו-דיסקים משמשים לספק משטח ממברנה בגודל מבוקר ותכולת שומנים. בהיעדר חלבונים חיצוניים קשורים, ננו-דיסקים מוכתמים בנתרן פוספוטונגסטט מופיעים כערימות מטבעות כאשר מסתכלים מהצד על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM). לכן פרוטוקול זה נועד לקדם בכוונה ערימה; כתוצאה מכך, ניתן לפרש את מניעת הערימה כקשירה של החלבון קושר הממברנה לננו-דיסק. בשלב נוסף, ניתן לעבד את תמונות ה-TEM של קומפלקסי החלבון-ננו-דיסק בשיטות סטנדרטיות של חלקיק בודד כדי להניב מבנים ברזולוציה נמוכה כבסיס לעבודת cryoEM ברזולוציה גבוהה יותר. יתר על כן, הננו-דיסקים מספקים דגימות המתאימות לאלקטרופורזה של ג'ל TEM או לאלקטרופורזה של ג'ל שאינו דנטור. כדי להמחיש את השיטה, מוצגת קשירה המושרה על ידי Ca²⁺ של 5-ליפוקסיגנאז על ננו-דיסקים.

Introduction

במחקר רפואי, תשומת לב רבה מתמקדת חלבונים בממברנה, או פנימיים או חיצוניים, מעורבים במגוון אינטראקציות שומנים. עבודה עם חלבונים אינטראקציה השומנים כולל גם בחירת תחליף ליפידים, כגון חומרי ניקוי, amphipols ^1, או חלבונים קטנים ^2, או למצוא תחליף קרום שמחזיק את חלבון מסיס ופעיל. תחליפי קרום ליפואית כוללים ליפוזומים nanodiscs (ND) ^{3, 4.}

Nanodiscs הם פלטפורמות הממברנה כמעט טבעיות שפותחה על ידי הנדסה חלק חלבון, ApoA-1, של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) טבעי בדם. A....

Protocol

1. הכנת Nanodiscs

1. ביטוי וטיהור של פיגומי קרום החלבון ^{8, 35}
   1. לבטא את MSP1E3D1 שלו מתויג ב BL21 E. coli (DE3) זן T1R pRARE2 צלוחיות. הכן תרבות המתנע לילה 50 מ"ל עם מדיום LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​Kanamycin על 37 מעלות צלזיוס. לדלל את תרבות המתנע לילה 2 ליטר של המדיום מרק נהדר בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​kanamycin.
   2. לגדל את התאים ב 37 ° ....

Results

השיטה שאנו מציעים תלויה בהכנת nanodiscs לספק משטח הממברנה עבור monotopic קרום חלבון מחייב. מאחר ואין חלבון טראנסממברנלי מוטבע לתוך bilayer השומנים nanodisc, את nanodiscs הם כאן מסומן כמו "nanodiscs ריק" (איור 2 א). אלה יש משקל מולקולרי מחושב של 256 kDa עבור רכב שני חלבוני פיגומי MSP1E3D1 ומסביב 260 מולקולות של POPC ^8. באמצעות חלבון זה: יחס שומנים עבור כינון מחדש, שיא מרכזי אחד (איור 2 א) היה.......

Discussion

השיטה ניתן לחלק לשלושה חלקים: הכינון מחדש של nanodiscs ריק, הכנת קומפלקסים חלבונים-nanodisc, ואת מכתים שלילי עבור TEM קומפלקסים אלה. כל חלק יטופל בנפרד בקשר להגבלות על הטכניקה, השלבים קריטיים, ושינויים שימושיים.

כינון של nanodiscs ריק. שלבים ומגבלות קריטיים ייצור ושימוש nanodiscs.

עבור הכנת nanodiscs ריק, זה הכרחי כדי לייעל את יחס MSP-ל-שומנים. עבו.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מיקרוסקופ אלקטרונים שידור: JEOL2100F	מצלמת JEOL
CCD	Tiez מערכת עיבוד וידאו והדמיה GmbH, גרמניה
מפרק זוהר	רשת Baltec
TEM: 400 רשת	TAAB	GM016/C
כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל: Agilent SEC-5	Agilent Technologies	5190-2526
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare מדעי החיים	17-5172-01
פלסמיד: MSP1E3D1	Addgene	20066
חיידקים: BL21DE3	NEB	C2527H
חיידקים: BL21 (DE3) T1R pRARE2	מתקן מדעי חלבון, KI, מטריצת טיהור סולנה
: ATP agarose	Sigma Aldrich	A2767
מטריצת טיהור: HisTrap HP-5 מ"ל	GE Healthcare מדעי החיים	17-5247-01
שומנים: POPC	Avanti ליפידים קוטביים	850457C	25 מ"ג/מ"ל בכלורופורם
חרוזים הידרופוביים: ביו-חרוזים, שרף SM-2	Bio-Rad	1523920
מסנן מזרק 13 מ"מ: 0.2 μ m	Pall Life Sciences	PN 4554T
כתם: נתרן פוספוטונגסטט טרי-בייסי הידרט	סיגמא אולדריץ'	31648
2-מרקפטואתנול	סיגמא אולדריץ'	M3148-250 מ"ל
נתרן דודציל סולפט (SDS)	Bio-Rad	161-0301
קוקטייל מעכב פרוטאז	סיגמא אולדריץ'	4693132001
TCEP	חומר ניקוי Sigma Aldrich	646547
: נתרן כולאט הידרט	Sigma Aldrich	C6445-10G
נתרן כולאט			500 מ"מ נתרן כולאט. השעו במי miliQ ואחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
מלאי			50 מ"מ POPC, 100 מ"מ נתרן כולאט, 20 מ"מ Tris-HCl pH 7.5, 100 מ"מ NaCl. אחסן ב-4 מעלות; C לשבוע; או חנות -80 & deg; C למשך חודש, לאחר טיהור התמיסה בחנקן.
מאגר			20 מ"מ Tris-HCl, pH 7.5, 100 מ"מ NaCl, 0.5 מ"מ EDTA. אחסן ב-4 מעלות צלזיוס.
מאגר אנודה אלקטרופורזה שאינו מתפרק	תרמו פישר סיינטיפיק	BN2001	50 מ"מ ביס-טריס, 50 מ"מ טריקסין, pH 6.8
מאגר קתודה אלקטרופורזה שאינו מפורר	תרמו פישר סיינטיפיק	BN2002	50 מ"מ ביס-טריס, 50 מ"מ טריקסין, pH 6.8, 0.002% Coomassie G-250
אלקטרופורזה לא מפורקת 4x מאגר טעינת דגימה	תרמו פישר סיינטיפיק	BN2003	50 מ"מ ביס-טריס, pH 7.2, 6 N HCl, 50 מ"מ NaCl, 10% (w/v) גליצרול, 0.001% Ponceau S
Denaturaing Electrophoresis			מתכון פנימי: 25 מ"מ Tris-HCl, pH 6.8, 200 מ"מ גליצין, 0.1% (w/v)
SDS Denaturaing Electrophoresis 5x טעינת מאגר			מתכון פנימי: 0.05% (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8, 20% (v/v) גליצרול, 10% (w/v) SDS, 10 מ"מ 2-מרקפטואתנול
מרק			טריפטון - 12.0 גרם, תמצית שמרים - 24.0 גרם, 100 מ"ל 0.17 מ"ל KH2PO4 ו-0.72 M K2HPO4, גליצרול - 4 מ"ל. טריפטון, תמצית שמרים וגליצרול הוכנו ל-900 מ"ל ועברו חיטוי בנפרד. KH2PO4 ו-K2HPO4 הוכנו ועברו חיטוי בנפרד. שניהם עורבבו לפני השימוש במדיום.