השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

Summary

חלבונים רבים מבצעים את תפקידם כאשר הם מחוברים למשטחי הממברנה. ניתן לדמות בעקיפין את הקישור של חלבונים חיצוניים על ממברנות ננו-דיסק על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה. אנו מראים כי הערימה האופיינית (רולו) של ננו-דיסקים הנגרמת על ידי הכתם השלילי נתרן פוספוטונגסטט נמנעת על ידי קשירה של חלבון חיצוני.

Abstract

חלבונים מונוטופיים מפעילים את תפקידם כאשר הם מחוברים למשטח הממברנה, ואינטראקציות כאלה תלויות בהרכב השומנים הספציפי ובזמינות של מספיק שטח לביצוע הפונקציה. ננו-דיסקים משמשים לספק משטח ממברנה בגודל מבוקר ותכולת שומנים. בהיעדר חלבונים חיצוניים קשורים, ננו-דיסקים מוכתמים בנתרן פוספוטונגסטט מופיעים כערימות מטבעות כאשר מסתכלים מהצד על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM). לכן פרוטוקול זה נועד לקדם בכוונה ערימה; כתוצאה מכך, ניתן לפרש את מניעת הערימה כקשירה של החלבון קושר הממברנה לננו-דיסק. בשלב נוסף, ניתן לעבד את תמונות ה-TEM של קומפלקסי החלבון-ננו-דיסק בשיטות סטנדרטיות של חלקיק בודד כדי להניב מבנים ברזולוציה נמוכה כבסיס לעבודת cryoEM ברזולוציה גבוהה יותר. יתר על כן, הננו-דיסקים מספקים דגימות המתאימות לאלקטרופורזה של ג'ל TEM או לאלקטרופורזה של ג'ל שאינו דנטור. כדי להמחיש את השיטה, מוצגת קשירה המושרה על ידי Ca²⁺ של 5-ליפוקסיגנאז על ננו-דיסקים.

Introduction

במחקר רפואי, תשומת לב רבה מתמקדת חלבונים בממברנה, או פנימיים או חיצוניים, מעורבים במגוון אינטראקציות שומנים. עבודה עם חלבונים אינטראקציה השומנים כולל גם בחירת תחליף ליפידים, כגון חומרי ניקוי, amphipols ^1, או חלבונים קטנים ^2, או למצוא תחליף קרום שמחזיק את חלבון מסיס ופעיל. תחליפי קרום ליפואית כוללים ליפוזומים nanodiscs (ND) ^{3, 4.}

Nanodiscs הם פלטפורמות הממברנה כמעט טבעיות שפותחה על ידי הנדסה חלק חלבון, ApoA-1, של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) טבעי בדם. ApoA-1 הנו רשת 243 שאריות-ארוכה של סלילים-α amphipathic קצרים ויש לו קונפורמציה מסיס ליפיד חינם. במבחנה כאשר בנוכחות של שומנים, שני עותקים של חלבון ApoA-1 לסדר מחדש באופן ספונטני לכתר את hydrחלק בשרשרת acyl ophobic של תיקון bilayer השומנים ^5. גרסאות תכנון הנדסי של ApoA-1 נקראים בדרך כלל חלבונים פיגומים הממברנה (MSP), ואת מספר גדל והולך זמינים מסחרית כמו פלסמידים או חלבונים מטוהרים. חזרות או השמטות של הסלילים-α ב תוצאת ApoA-1 ב ⁶ ארוכים או קצרים ⁷ חלבונים בממברנה פיגומים. זה בתורו מאפשר ליצור דיסקים סביב 6 ננומטר ⁷ עד 17 ננומטר ⁸ קוטר. ישנם סוגים שונים של יישומים עבור nanodiscs ^{3, 9.} היישום הנפוץ ביותר הוא לספק סביבת קרום כמעט טבעית לייצוב של חלבון ממברנלי אינטגרלי ^8, ביקורת בעבר ^{3, 9.} אחד משימושים פחות בחנו הם לספק משטח הממברנה ננו לחקר חלבוני פריפרית קרום ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17.} סעיף 1 של פרוטוקול להלן ממחיש את ההליך להכנת nanodiscs מורכב פוספוליפידים וחלבונים פיגומים הממברנה.

הכנת מדגם היא צוואר בקבוק ברוב השיטות. דגימות שיטה ספציפית עשויות להוסיף מידע מסוים, אבל הם גם עושים השוואות של תוצאות קשות. לכן, זה פשוט יותר כאשר הדגימות הן multimodal וניתן להשתמש בו ישירות בכמה שיטות שונות. אחד היתרונות עם השימוש nanodiscs הוא גודלו הקטן של nanodisc בהשוואה ליפוזומים (למשל, דגימות יכול לשמש ישירות לשני TEM ו ג'ל אלקטרופורזה הלא denaturing, כמו בפרוטוקול הנוכחי).

s = "jove_content"> שלפוחית ​​ו ליפוזומים כבר מזמן השתמשו להבין את תפקידם של חלבונים אינטראקציה-קרום. עבור מחקרים מבניים להדמיה, דוגמא של הנחישות המבנית של חלבון טראנסממברנלי ב ליפוזומים היא ¹⁸ זמין. עם זאת, אין מבנה 3D ברזולוציה גבוהה של חלבון הממברנה monotopic מוטבע על קרום ליפוזום פורסמה עדיין, ככל שאנו יודעים. חלקיקים או נוגדני זהב יכולים לשמש כדי לחזות חלבונים מחייבים ליפוזומים או שלפוחית באמצעות ¹⁹ TEM. למרות בדיקות אלה הם מאוד ספציפיים, שהם עלולים להפריע לתהליך חלבונים קושרי הממברנה על ידי מיסוך באתר קרום מחייב או על ידי מיסוך תחומי העניין עם החלקים גמישים. זהב שכותרתו או חלבונים ומורכבי נוגדן בטח יכולים להיות מנותח על ג'ל, אבל זה יגדיל את עלות הניסוי.

למרות ליפוזומים הם פלטפורמה מצוינת, אחד לא יכול להיות בטוח כי פופיש ulation יחס מסוים של חלבון לכל liposome, תכונה שיכולה להיחקר על ידי שימוש nanodiscs ^20. בשנת ליפוזום, קו-פקטורי מצעים יכולים להיות לכוד בפנים המסיס. חומרים שהם קרום מסיסים יחלקו את אותו גורל לשני סוגי mimetics הממברנה. אף על פי כן, כמו אזור bilayer קטן ב nanodiscs, כמות קטנה יותר של חומר נדרשה כדי להרוות את קרומי nanodisc.

תפקוד החלבון הבנת דרך קביעת המבנה האטומי כבר חיוני בתחומים רבים של מחקר. שיטות לקביעת מבנה חלבון כוללות רנטגן ^21; תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ^{22, 23;} במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) ²⁴ בקירור, cryoEM. ההחלטה על ידי cryoEM לאחרונה שופרה מאוד, בעיקר בשל השימוש של דה אלקטרון הישירtectors ^{25, 26.} מקרומולקולות הם צלמו רזה, קרח זגוגי ²⁷ במצב כמעט טבעי. עם זאת, בגלל הקונטרסט הנמוך של מולקולות ביולוגיות, הם הופכים קשים לזהות בטווח הגודל של 100 - 200 kDa. לקבלת דוגמיות בגודל המתאים, איסוף נתונים יכול להתבצע ואת שיטת שחזור חלקיק בודד יכולה להיות מיושמת כדי להשיג מבנה ^28.

עם זאת, קביעת מבנה החלבון על ידי TEM הוא תהליך רב שלבי. זה מתחיל בדרך כלל עם ההערכה של מדגם monodispersity ב ^-29 שלילי כתם TEM באמצעות מלחים של מתכות כבדות כמו phosphotungsten (PT) ³⁰ או אורניום ^31. שחזור של מודל ברזולוציה נמוכה של מקרומולקולה המוכתמת שלילי עשוי בדרך כלל ועלול להניב מידע חשוב על המבנה המולקולרי ^29. במקביל,איסוף נתונים באמצעות cryoEM יכול להתחיל. יש להקפיד בעת הערכת נתוני TEM השלילית-כתם, כדי למנוע את הפרשנות השגויה של היווצרות artefact. Artefact אחד מסוים הוא ההשפעה של כתם PT על פוספוליפידים ליפוזומים ^32, וכתוצאה מכך ההיווצרות של מוטות ארוכות דומות ערימות של מטבעים במבט מהצד ^33. "רולו" או "ערימות" כזה (להלן מסומן כמו "ערימות") נצפו בשלב מוקדם עבור HDL ^34, ומאוחר יותר גם עבור nanodiscs ^35.

ההערמה והעיצוב מחדש של ממברנות עלולות להתרחש מסיבות רבות. לדוגמה, זה יכול להיגרם על ידי שיתוף גורמים כמו נחושת, שמוצג על ידי הדמיה TEM ב כתם אמוניום molybdate ^36. שבריר של ליפידים קרום ליפוזומים כלול לקבוצת ראש חומצת iminodiacetic מחק complexation מתכת ידי EDTA, ובכך לערום ליפוזומים לאחר התוספת של יוני נחושת 36. הנחת יכול להיות גם עקב אינטראקציה בין חלבונים על ידי חלבון או על bilayers שומנים בדם (הכתם בשימוש אינו מוזכר) ^37. היווצרות ערימה של פוספוליפידים ידי PT נצפתה בשלב מוקדם; עם זאת, עבודה לאחר מכן התמקדה סר או ביטול היווצרות חפץ זה ^38.

כאן, אנו מציעים שיטה לנצל את nanodisc NAPT הנגרמת לערום לחקר חלבונים קושרי קרום ידי TEM. בקיצור, חלבון מחייב על nanodiscs שימנע nanodiscs מן הערמה. למרות הסיבות לערום אינן ברורות, הוצע ³⁹ כי קיימת אינטראקציה אלקטרוסטטית בין פוספוליפידים וקבוצת phosphoryl של PT, בגרימת הדיסקים לדבוק כל (איור 1 א) אחר. ההנחה העומדת מאחורי פרוטוקול שלנו היא שכאשר חלבון נקשר nanodisc, רוב השטח פוספוליפידים אינו availa ble לאינטראקציה עם PT עקב הפרעה סטרית ידי החלבון. זה ימנע היווצרות מחסנית (איור 1B). שתי מסקנות אפשר להסיק. ראשית, המניעה לערום כלומר החלבון של העניין הכפיף אותו הקרום. שנית, מורכב החלבון-ND יכול להיות מטופלים עם שיטות עיבוד יחיד חלקיקי תקן ^{24, 40} לקבל מורפולוגיה מחוספסת של המתחם. יתר על כן, מנתח בשיטות כמו ג'ל אלקטרופורזה הלא denaturing או פיזור אור דינאמי יכול להתבצע.

כדי להדגים את ההשערה הזו, השתמשנו החלבון קושר קרום 5 lipoxygenase (5LO), העוסק במחלות רבות דלקתיות ^{41, 42.} חלבון 78-kDa זה דורש יוני סידן להיקשר הממברנה שלה ^43. למרות עמותת קרום זה נחקרה באמצעות בהרחבה ליפוזומיםs = "Xref"> ^{44, 45, 46} ו שברי קרום ^47, אלה לא יכולים לשמש לניתוח TEM ונחישות מבנה.

הכנת nanodiscs מתחיל ידי ערבוב MSP עם השומנים resuspended ב cholate נתרן חומר ניקוי. לאחר דגירה על קרח למשך 1 שעות, אבקת הכביסה מוסרת לאט מתערובת הכינון מחדש תוך שימוש בשרף כושר ספיג. סוג של חומר זה עשוי לעתים קרובות קלקר בצורת לתוך חרוזים קטנים. הם יחסית הידרופובי יש העדפה חזקה מחייב דטרגנט לעומת שומנים ^48. לאחר הסרת חרוזים הידרופובי וביצוע בירור באמצעות צנטריפוגה, nanodiscs הם מטוהרים על ידי כרומטוגרפיה הדרה גודל (SEC). Nanodiscs מטוהר מעורבב עם חלבון הממברנה monotopic (ורכיבים אפשריים) ב יחס equimolar (או יחסי מספר עבור טיטרציה) והם עזבו כדי react (15 דק '). ניתוח על פי TEM מתבצע על ידי החלת μL-סכומי המדגם על-משוחרר זוהרת, רשתות מצופות הפחם ולאחר מכן על ידי ביצוע מכתים שלילי עם NAPT. מדגם זהה וממתי aliquots הוחלו על רשתות TEM יכול לשמש לניתוח על ידי הלא denaturing או SDS עמוד-ג'ל אלקטרופורזה, כמו גם על ידי סוגים שונים של מדידות פעילות, ללא שינויים משמעותיים.

Protocol

1. הכנת Nanodiscs

1. ביטוי וטיהור של פיגומי קרום החלבון ^{8, 35}
   1. לבטא את MSP1E3D1 שלו מתויג ב BL21 E. coli (DE3) זן T1R pRARE2 צלוחיות. הכן תרבות המתנע לילה 50 מ"ל עם מדיום LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​Kanamycin על 37 מעלות צלזיוס. לדלל את תרבות המתנע לילה 2 ליטר של המדיום מרק נהדר בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​kanamycin.
   2. לגדל את התאים ב 37 ° C עד צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD ₆₀₀₎ ומגיע לכ 3. להשרות את ביטוי חלבון עם 0.5 מ"מ איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) במשך 3 שעות ב 18 מעלות צלזיוס.
   3. הכן את החיץ תמוגה (100 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0; 100 מ"מ NaCl; ו -10% גליצרול). הוסף 1 מ"מ TCEP מיד לפני השימוש.
   4. אחרי 3 שעות של אינדוקציה על 18 מעלות צלזיוס, לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 4500 XGו -4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant, לשקול את התאים שנקטפו, מחדש להשעות אותם במאגר תמוגה לפי יחס של 2 מ"ל של תמוגה חיץ לכל גרם של תאים.
   5. Lyse את התאים על ידי sonication פעם (שיעור החזרה: 4 של פועל, כבוי סעיף 4) 3 דקות ב משרעת 80%.
   6. צנטריפוגה lysates במשך 20 דקות ב 49,000 XG ו -4 מעלות צלזיוס. וזורק את הכדור מן צנטריפוגה זה.
   7. להזריק את supernatant לתוך עמוד 5 מ"ל Ni ⁺ chelating מחובר למערכת כרומטוגרפיה נוזלית אוטומטיות שמר רצוי ב 4 ° C..
   8. לפני מדרגת elution (שלב 1.1.9), לשטוף את העמודה עם מאגרי 1 - 3 הבא כדי להסיר כל החלבונים למעט MSP המתויג שלו. לפקח על תכולת החלבון ב 280 ננומטר לבצע את תהליך הטיהור; הקלטת UV ב 280 ננומטר צריכה לחזור בסיס לאחר כל שטיפה.
      1. לשטוף עם חיץ לשטוף 1: 40 מ"מ טריס- HCl, 300 מ"מ NaCl, 10 מ"מ imidazole, ו -1% טריטון, pH 8.0.
      2. לשטוף עם חיץ לשטוף 2: 40 מ"מ טריס- HCl, 300 מ"מNaCl, 20 imidazole מ"מ, 50 מ"מ נתרן cholate, pH 8.0.
      3. לשטוף עם חיץ לשטוף 3: 40 מ"מ טריס- HCl, 300 מ"מ NaCl, ו -50 מ"מ imidazole, pH 8.0.
   9. Elute את MSP עם 40 mM Tris-HCl, 300 מ"מ NaCl, ו -500 imidazole מ"מ, 8.0 pH.
   10. שנה את חיץ MSP בופר סטנדרטיות (20 mM Tris-HCl, pH 7.5; 100 מ"מ NaCl; ו -0.5 מ"מ EDTA) על ידי סינון ג'ל ^{8, 35;} התשואה לכל אצווה צריכה להיות סביב 7 מ"ג ל ^-1.
2. הכנת פתרון מניות פוספוליפידים
   1. להוסיף 305 μL של 1-Palmitoyl-2-oleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (POPC) מומס כלורופורם בריכוז של 25 מ"ג / מ"ל כוס זכוכית ו להתאדות כלורופורם על ידי לטהר אותה עם זרם עדין של חנקן . ייבש את לילה שומני ייבוש ואקום. הערה: שלב זה מתבצע כדי להסיר את ממס השומנים בדם, מה שמשאיר שכבה דקה של שומנים בתחתית של כוס הזכוכית.
   2. Resuspend את העוגה השומנים ב 200 μL של חיץ תקן MSP המכיל 100 cholate נתרן מ"מ על ידי vortexing הצינור עד הפתרון הופך שקוף; זה יספק פתרון עם ריכוז POPC של 50 מ"מ.
      הערה: באופן כללי, היחס הטוחן של שומנים כדי דטרגנט בשלב זה צריך להיות 1: 2 (שומנים בדם: חומר ניקוי) ^8. תערובת שומנים חומר ניקוי זה יכול להיות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס במשך כמעט 2 חודשים.
3. הכנת חרוזים הידרופובי להסרת חומר ניקוי
   1. מניחים 5 גרם של חרוזים (יבש-משקל) בצינור 50 מ"ל.
   2. שטפו את החרוזים עם 30 מ"ל של מתנול 100% ולאחר מכן עם 40 מ"ל מים ultrapure.
   3. שטפו את החרוזים עם 10 חיץ תקן מ"ל של MSP. לבסוף, לאחסן את החרוזים עם 15 מ"ל של בופר סטנדרטיות MSP על 4 מעלות צלזיוס.
4. כינון מחדש Nanodisc
   1. לוותר 190 μL של MSP1E3D1 (0.124 מ"מ) לתוך צינור microfuge ולהוסיף 61.5 μL של פתרון המניות פוספוליפידים (50 מ"מ POPC) לאותו צינור. דגירה את תערובת הכינון מחדש על קרח רטוב במשך 1 שעה. הערה: זה שווה יחס טוחן של 1: 130 (MSP1E3D1: POPC).
   2. להוסיף חרוזים הידרופובי בריכוז של 0.5 גרם של חרוזים לכל מ"ל של תערובת הכינון מחדש ליזום את תהליך ההרכבה העצמית. דגירה באינקובטור רוטרי 16 שעות ב 4 ° C..
   3. לאחר דגירה, צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 13,000 XG ו -4 ° C כדי להסיר את המשקעים אגרגטים. וזורק את הכדור ולשמור את supernatant.
   4. לאזן את עמודת כרומטוגרפיה הדרת גודל (רכובה על מערכת כרומטוגרפיה נוזלית אוטומטית) עם חיץ MSP הסטנדרטית עד הספיגה ב 280 ננומטר היא יציבה. להזריק את supernatant לתוך הטור ולאסוף את השברים השיא.
   5. מדדו את ריכוזי nanodiscs את השברים השיא ב 280 ננומטר. השתמש מקדם הכחדה טוחנת של MSP1E3D1 (ε = 29,910 ^-1 ס"מ M ^-1) לחישוב ריכוז nanodisc. הערה:מספר שומנים לכל nanodisc ניתן למדוד על ידי שילוב של שומנים radiolabeled וניתוח פוספט ⁴ או על ידי ניתוח פוספט לבד.

2. הכנת חלבון Monotopic 5 Lipoxygenase ³⁵

1. הכן תרבות המתנע לילה. מוסף 50 מ"ל של מדיום LB עם 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​אמפיצילין. לחסן המדיום עם E. coli BL21 (DE3) המכיל את הפלסמיד של הגן 5-lipoxygenase (ALOX5). לדלל את תרבות המתנע לילה במדיום ביטוי המכיל 42 מ"מ Na _{2 4} HPO, 24 מ"מ KH _{2 4} PO, 9 מ"מ NaCl, 19 מ"מ NH ₄ Cl, 1 מ"מ MgSO _4, 0.1 מ"מ CaCl _2, 0.2% גלוקוז D, 0.1 %, 5 מיקרומטר FeSO _4, ו אמפיצילין 100 מיקרוגרם / מ"ל. לגדל את התאים עד OD ₆₀₀ הוא ~ 0.5 של 25 מעלות צלזיוס. להשרות ביטוי החלבון עם 0.2 מ"מ IPTG במשך 16 שעות ב 20 ° C ^35.
2. קציר ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 7000 XG ו -4 ° C ו להתעלמות supernatant. לשקול גלולה נמצא בחלק התחתון של הצינור המכיל את התאים נקצרו resuspend התאים שנקטפו חיץ תמוגה (100 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0; 100 מ"מ NaCl; 10% גליצרול; ו 1 מ"מ TCEP) המכיל מעכבי פרוטאז ו -0.5 מ"ג / מ"ל ³⁵ ליזוזים לפי יחס של 2 מ"ל של חיץ תמוגה לכל גרם של תאים.
3. Lyse את התאים על ידי sonication עבור 5 x 15 שניות ב משרעת 80%. הסר את פסולת התא על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 7000 XG ו -4 מעלות צלזיוס. בצע ממטרי אמוניום סולפט 30 - 60% רוויה כדי לזרז את החלבונים בתמיסה ^35. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב XG 16,000 ו -4 מעלות צלזיוס. הערה: גלולת 5LO אפשר להקפיא במהירות ומאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
4. Resuspend גלולה עם 20 מ"ל של חיץ תמוגה ו צנטריפוגות במשך 15 דקות ב 40,000 XG ו -4 מעלות צלזיוס.
5. דגירת supernatant על טור agarose ATP על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לשטוף את העמודה פעם עם נפח עמודה אחת של חיץ תמוגה המכיל 0.5 M NaCl. Elute את 5LO עם 20 מ"מ ATP חיץ תמוגה המכיל 10 מיקרומטר FeSO ₄ ו -20 מיקרוגרם / מ"ל Catalase. בצעו כרומטוגרפיה סינון ג'ל להסרת ATP ^35.
   הערה: 5LO אינו יציב יש להשתמש מיד לאחר טיהור. אחרת, מומלץ לעצור ליד המדרגה של משקעים אמוניום סולפט (ראה את הפתק לאחר שלב 2.1.3).

3. הכנה של קומפלקס Nanodisc-חלבון

1. הכן בנפח כולל של 100 μL של מורכבות. מערבבים 0.8 מיקרומטר ND ו -0.8 מיקרומטר 5LO עם 1 בהווה ²⁺ מ"מ Ca למאגר תקן MSP (20 mM Tris-HCl, pH 7.5; 100 מ"מ NaCl; 0.5 mM EDTA; ו -1.5 מ"מ CaCl ₂₎ ו דגירה של 10 דקות על קרח. הערה: המדגם ניתן לאחסן עד חודש ב 4 ° C ^35.

ניתוח ove_title "> 4. של דוגמאות

1. ג'ל אלקטרופורזה
   1. אלקטרופורזה ללא denaturing
      1. מערבבים 15 μL של המדגם עם 5 μL של חיץ הטעינה (50 מ"מ BisTris, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w / v) גליצרול, ו 0.001% Ponceau S, pH 7.2) ⁴⁹ ולטעון אותו על 4 - 16% Bis-טריס ג'ל לבצע אלקטרופורזה.
      2. מלאו את מיכל קטודה עם חיץ קטודה אור (50 מ"מ Bis טריס; 50 מ"מ tricine, pH 6.8; ו 0.002% Coomassie G-250) והטנק האנודה עם הפעלת המאגר (50 מ"מ Bis טריס ו -50 מ"מ tricine, pH 6.8). הפעל את ההפרדה באמצעות מתח קבוע של 150 V.
      3. עצור את הפרדת electrophoretic כשהחזית Coomassie מגיעה לסוף של הג'ל.
      4. כתם ג'ל עם פרוטוקול כחול Coomassie סטנדרטי.
   2. אלקטרופורזה denaturing
      1. מערבבים 40 μL של המדגם עם 10 μL של חיץ טעינת המכיל SDS (0.05% (w / v) bromophenol כחול; 0.2 M Tris-HCl,pH 6.8; 20% (v / v) גליצרול; 10% (w / v) SDS; ו 10 מ"מ 2-mercaptoethanol) ולטעון אותו על 4 - ג'ל גליצין 20% טריס לבצע אלקטרופורזה.
      2. מלאו את הטנקים הקתודה לבין האנודה עם הפעלת המאגר (25 mM Tris-HCl, pH 6.8; 200 גליצין מ"מ; ו -0.1% (w / v) SDS). הפעל את ההפרדה באמצעות מתח קבוע של 150 V.
      3. עצור את הפרדת electrophoretic כשהחזית לצבוע טעינה מגיעה לסוף של הג'ל.
      4. כתם ג'ל עם פרוטוקול כחול Coomassie סטנדרטי.
2. הכנת תמיסת NAPT
   1. ממיסים 1 גרם של מלח נתרן phosphotungstate ב 50 מ"ל של מים על ידי תסיסה בטמפרטורת החדר כדי לתת 2% (w / v) תמיסה חומצית.
   2. התאם את ה- pH ל -7.4 עם 1 M NaOH. הסר את החלקיקים באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. אחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר או על 4 מעלות צלזיוס.
3. הכנת המדגם עבור ניתוח TEM
   1. זוהר פריקת רשתות נחושת מצופה פחמן (400 רשת) במשך 20 שניות על 30 מילים-אמפר כדי להבהיר את הרשתות הידרופילי לפני הספיחה של המדגם. מניחים 3.5 μL של המדגם (0.8 מיקרומטר ביחס nanodiscs) על הרשת דגירה במשך 30 שניות. הערה: ההיקף המיושם עשוי להשתנות בין 2.5 ל 5 μL, תלוי בריכוז המדגם. מגוון ריכוז מתאים nanodiscs הוא 0.5 - 1 מיקרומטר.
   2. כתם את הפתרון עודף באמצעות נייר סינון.
   3. מיד להכתים את הרשת עם ירידה של 2% NAPT למשך 30 שניות. כתם את הפתרון עודף ולהשאיר את הרשת לייבוש באוויר.
   4. להעריך את הרשתות על ידי TEM. מיקרוסקופ עם 120-200 keV מאיץ מתח די להעריך את היקף לערום. הערה: בשביל הפרוטוקול הנוכחי, מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים מכויל שמש, מצויד באקדח פליטת שדה 200-קאב.
   5. רשום את תמונות TEM. עבור התמונות מראות ערימות ארוכות, לא לעבד יותר; תמונות מראות את מכלול nanodiscs, עם חלבון חיצוני שעשויים להכיל כמהערימות קטנות, אבל רוב החלקיקים נמצאות במתחם. תמונות תהליך שיא כמה אלה על פי שיטות סטנדרטיות להשיג-ממוצעים בכיתה ו ברזולוציה נמוכה, 3 ממדית של המורכבות.
      הערה: עבור איסוף הנתונים שלילי כתמים, רשתות נעשו על לפחות שלושה ימים שונים. עבור כל יום, incubations מדגם הטרי (כמו בשלב 3.1) שנעשה לפני הכתם השלילי יושם.

Results

השיטה שאנו מציעים תלויה בהכנת nanodiscs לספק משטח הממברנה עבור monotopic קרום חלבון מחייב. מאחר ואין חלבון טראנסממברנלי מוטבע לתוך bilayer השומנים nanodisc, את nanodiscs הם כאן מסומן כמו "nanodiscs ריק" (איור 2 א). אלה יש משקל מולקולרי מחושב של 256 kDa עבור רכב שני חלבוני פיגומי MSP1E3D1 ומסביב 260 מולקולות של POPC ^8. באמצעות חלבון זה: יחס שומנים עבור כינון מחדש, שיא מרכזי אחד (איור 2 א) היה...

Discussion

השיטה ניתן לחלק לשלושה חלקים: הכינון מחדש של nanodiscs ריק, הכנת קומפלקסים חלבונים-nanodisc, ואת מכתים שלילי עבור TEM קומפלקסים אלה. כל חלק יטופל בנפרד בקשר להגבלות על הטכניקה, השלבים קריטיים, ושינויים שימושיים.

כינון של nanodiscs ריק. שלבים ומגבלות קריטיים ייצור ושימוש nanodiscs.

עבור הכנת nanodiscs ריק, זה הכרחי כדי לייעל את יחס MSP-ל-שומנים. עבו...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מיקרוסקופ אלקטרונים שידור: JEOL2100F	מצלמת JEOL
CCD	Tiez מערכת עיבוד וידאו והדמיה GmbH, גרמניה
מפרק זוהר	רשת Baltec
TEM: 400 רשת	TAAB	GM016/C
כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל: Agilent SEC-5	Agilent Technologies	5190-2526
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare מדעי החיים	17-5172-01
פלסמיד: MSP1E3D1	Addgene	20066
חיידקים: BL21DE3	NEB	C2527H
חיידקים: BL21 (DE3) T1R pRARE2	מתקן מדעי חלבון, KI, מטריצת טיהור סולנה
: ATP agarose	Sigma Aldrich	A2767
מטריצת טיהור: HisTrap HP-5 מ"ל	GE Healthcare מדעי החיים	17-5247-01
שומנים: POPC	Avanti ליפידים קוטביים	850457C	25 מ"ג/מ"ל בכלורופורם
חרוזים הידרופוביים: ביו-חרוזים, שרף SM-2	Bio-Rad	1523920
מסנן מזרק 13 מ"מ: 0.2 μ m	Pall Life Sciences	PN 4554T
כתם: נתרן פוספוטונגסטט טרי-בייסי הידרט	סיגמא אולדריץ'	31648
2-מרקפטואתנול	סיגמא אולדריץ'	M3148-250 מ"ל
נתרן דודציל סולפט (SDS)	Bio-Rad	161-0301
קוקטייל מעכב פרוטאז	סיגמא אולדריץ'	4693132001
TCEP	חומר ניקוי Sigma Aldrich	646547
: נתרן כולאט הידרט	Sigma Aldrich	C6445-10G
נתרן כולאט			500 מ"מ נתרן כולאט. השעו במי miliQ ואחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
מלאי			50 מ"מ POPC, 100 מ"מ נתרן כולאט, 20 מ"מ Tris-HCl pH 7.5, 100 מ"מ NaCl. אחסן ב-4 מעלות; C לשבוע; או חנות -80 & deg; C למשך חודש, לאחר טיהור התמיסה בחנקן.
מאגר			20 מ"מ Tris-HCl, pH 7.5, 100 מ"מ NaCl, 0.5 מ"מ EDTA. אחסן ב-4 מעלות צלזיוס.
מאגר אנודה אלקטרופורזה שאינו מתפרק	תרמו פישר סיינטיפיק	BN2001	50 מ"מ ביס-טריס, 50 מ"מ טריקסין, pH 6.8
מאגר קתודה אלקטרופורזה שאינו מפורר	תרמו פישר סיינטיפיק	BN2002	50 מ"מ ביס-טריס, 50 מ"מ טריקסין, pH 6.8, 0.002% Coomassie G-250
אלקטרופורזה לא מפורקת 4x מאגר טעינת דגימה	תרמו פישר סיינטיפיק	BN2003	50 מ"מ ביס-טריס, pH 7.2, 6 N HCl, 50 מ"מ NaCl, 10% (w/v) גליצרול, 0.001% Ponceau S
Denaturaing Electrophoresis			מתכון פנימי: 25 מ"מ Tris-HCl, pH 6.8, 200 מ"מ גליצין, 0.1% (w/v)
SDS Denaturaing Electrophoresis 5x טעינת מאגר			מתכון פנימי: 0.05% (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8, 20% (v/v) גליצרול, 10% (w/v) SDS, 10 מ"מ 2-מרקפטואתנול
מרק			טריפטון - 12.0 גרם, תמצית שמרים - 24.0 גרם, 100 מ"ל 0.17 מ"ל KH2PO4 ו-0.72 M K2HPO4, גליצרול - 4 מ"ל. טריפטון, תמצית שמרים וגליצרול הוכנו ל-900 מ"ל ועברו חיטוי בנפרד. KH2PO4 ו-K2HPO4 הוכנו ועברו חיטוי בנפרד. שניהם עורבבו לפני השימוש במדיום.