הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

סינתזה של 1,2-Azaborines ואת ההכנה של קומפלקסי החלבונים שלהם עם מוטאנטים ליזוזים T4

7.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55154

⸱

25 במרץ 2017

 , 
1Department of Chemistry, Boston College

במאמר זה

סיכום

מוצג פרוטוקול לסינתזה של 1,2-אזבורינים והכנת קומפלקסי החלבון שלהם עם מוטציות ליזוזים T4.

תקציר

אנו מתארים סינתזה כללית של 1,2-אזבורינים תוך שימוש בטכניקות סטנדרטיות נטולות אוויר והכנת קומפלקס חלבונים עם מוטציות ליזוזים T4 על ידי דיפוזיה של אדים. תרכובות רגישות לחמצן ולחות מוכנות ומבודדות תחת אטמוספירה אינרטית (N2) באמצעות סעפת גז ואקום או תא כפפות. כדוגמה לסינתזה של אזבורין, אנו מדגימים את הסינתזה והטיהור של ה-N-H-B-ethyl-1,2-azaborine הנדיף על ידי רצף בן חמישה שלבים הכולל זיקוק וכרומטוגרפיה של עמודות לבידוד מוצרים. מוטציות ליזוזים T4 L99A ו-L99A/M102Q באות לידי ביטוי בזן Escherichia coli RR1. פרוטוקולים סטנדרטיים לליזה של תאים כימיים ואחריהם טיהור באמצעות עמודת חילופי יונים קרבוקסימתיל מעניקים חלבון בעל טוהר גבוה מספיק להתגבשות. התגבשות החלבון מתבצעת בריכוזים שונים של משקעים בטווחי pH שונים בשיטת דיפוזיה של אדי טיפה תלויה. הכנה מורכבת עם המולקולות הקטנות מתבצעת בשיטת דיפוזיה של אדים תחת אטמוספירה אינרטית. ניתוח עקיפה של קרני רנטגן של קומפלקס הגביש מספק ראיות מבניות חד משמעיות לאינטראקציות קשירה בין אתר קשירת החלבון ל-1,2-אזבורינים.

מבוא

בורון-חנקן המכיל heterocycles (כלומר 1,2-azaborines) משך תשומת לב משמעותית לאחרונה isosteres של ארנס. Isosterism זה יכול להוביל גיוון של מוטיבים מבניים קיימים כדי להרחיב את השטח הכימי 2, 3, 4. יש Azaborines שירות פוטנציאל היישום במחקר ביו 5, 6, 7, 8, במיוחד בתחום של כימיה רפואית שבה כימאים לבצע סינתזה של ספריות של מבנית ומולקולות רלוונטיות מבחינה תפקודית. ראוי לציין, עם זאת, בעוד ישנם מסלולים סינטטיים מפותחים רבים למולקולות arene המכיל זמינות, רק מספר מצומצם של שיטות לסינתזה של azaborines דווח 9, 10, 11, 12, 13. זאת בעיקר בשל מספר מצומצם של אפשרויות עבור מקור בורון ואת האוויר והטבע רגיש לחות של המולקולה בשלב המוקדם של רצף סינטטי.

בחלקו הראשון של מאמר זה, נתאר סינתזה סולם רב-גרם של N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3) תוך שימוש בטכניקות אוויר ללא תקן. תרכובת זו משמשת ביניים צדדיים שיכול להיות פונקציונלי נוסף למולקולות מורכבות יותר מבחינה מבנית 14, 15. החל מ 3, סינתזה וטיהור N -H- B -ethyl-1,2-azaborine (5) לשימוש במחקרים חלבון מחייב יתוארו. בשל התנודתיות של 5, הבידוד היעיל שלה דורש שליטה מדויקת של טמפרטורת תגובה, זמן, distillation תנאים.

בחלק השני, פרוטוקולים עבור ביטוי חלבון ובידוד של מוטציות ליזוזים T4 (L99A ו L99A / M102Q) 17, 18, 19, 20 יוצגו, ואחריו התגבשות חלבון והכנת מתחמי קריסטל חלבון-ליגנד. מוטציות ליזוזים T4 L99A ו L99A / M102Q נבחרו כמערכות מודל ביולוגי לבחון את יכולת מליטה המימן של NH המכיל מולקולות azaborine 17. באמצעות פרוטוקול ביולוגיה מולקולרית סטנדרטי, החלבון מתבטא המתח Escherichia coli RR1 המושרה עם איזופרופיל- β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). טיהור חלבון מתבצעת באמצעות כרומטוגרפיה טור-חילוף יונים. התגבשות חלבון מתבצעת עם פתרון חלבון מטוהר מרוכז מאוד (> טוהר 95% על ידי ג'ל אלקטרופורזה) באמצעות התלייהטיפת שיטת דיפוזיה אדי. בשל הרגישות של ליגנדים של מחקר זה לחמצן, המתחמים ליגנד החלבון מוכנים בתנאי אוויר חינם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: כל מניפולציות החמצן ולחות רגישה בוצעו תחת אווירת אינרטי (N 2) או באמצעות טכניקות אוויר ללא רמה או תא הכפפות. THF (tetrahydrofuran), Et 2 O (אתר diethyl), 2 CH 2 Cl (dichloromethane), טולואן, ו פנטן היו מטוהרים על ידי עובר דרך טור אלומינה נייטרלי תחת ארגון. אצטוניטריל היה מיובש על CAH 2 (הידריד סידן) ומזוקק תחת אווירה חנקן לפני השימוש. Pd / C (פלדיום על פחמן) היה מחומם תחת ואקום גבוה ב -100 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות לפני השימוש. ג'ל סיליקה (230-400 רשת) היה מיובש במשך 12 שעות ב 180 ° C תחת ואקום גבוה. כרומטוגרפיה פלאש בוצעה עם ג'ל סיליקה זה תחת אווירה אינרטי. כל הכימיקלים וממסים אחרים נרכשו ושימש קבלו.

הערה: שימו לב, יש להתייעץ עם כל גיליונות נתוני בטיחות חומרים רלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. כמה מן הכימיקלים המשמשים סינתזהמחדש בחריפות רעילים ומסרטנים.

1. הכנת 1,2-Azaborines

הערה: נתוני אפיון של כל התרכובות במחקר זה דווחו בעבר 12, 13, 16.

figure-protocol-1
איור 1: ערכה סינטתית של 1,2-azaborines. פרוטוקולים מפורטים לסינתזה של כל מתחם (1-5) מתוארים בסעיף בפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. הכנת N -allyl- N -TBS- B adduct כלוריד -allyl (1)
    1. בתוך תא הכפפות, למדוד את 6.70 גרם (50.0 mmol) triallylborane 22 לתוך בקבוק בתנור יבש 24/40 1 L מסביב לתחתית מצויד בבר מערבב ומוסיף 250 dichloromethane מיליליטר. חותם את הבקבוק עם מחצה גומי. מחוץ לקופסה, מגניב הפתרון -78 ° C תחת חנקן אווירה על סעפת גז ואקום.
    2. הוספת 100 מ"ל של 1.00 M פתרון Trichloride בורון (100 מילימול) בהקסן לפתרון triallylborane ב- C ° -78 באמצעות העברה צינורית. תן ומערבבים לתערובת תגובה בטמפרטורה זו במשך 4 שעות.
      הערה: שימו לב, Trichloride בורון הוא מאוד תגובתי עם מים.
    3. בבקבוק 100 מ"ל נפרד, למדוד החוצה 25.7 גרם N - (-butyldimethylsilyl t) - N -allylamine (150 מילימול) ולהוסיף 20.0 dichloromethane מ"ל. אל בקבוק תגובת 1 L, להוסיף את הפתרון הזה באמצעות העברת צינורית בשמירה על טמפרטורת התגובה על -78 מעלות צלזיוס.
    4. הוסף 21.0 מ"ל triethylamine (150 מילימול) לתגובה. לשמור על תנודות מתחת תזרים חיובי של חנקן ולאפשר לו חם בהדרגה roלילה טמפרטורת אום.
    5. לאחר 18 שעות של ערבובים להסיר כמחצית של ממס דרך סעפת גז ואקום באמצעות ואקום גבוה (300-500 mTorr) עם מלכודת חנקן נוזלי.
    6. קח את בקבוק התגובה לתוך תא כפפות ולסנן את מלח לבן נוצר מתערובת התגובה באמצעות frit הנקבובית-בינוני מיובש בתנור מצויד מתאם 24/40 ואקום בבקבוק 24/40 500 מיליליטר מסביב לתחתית עם ומערבבים בָּר. השתמש dichloromethane להעביר את כל החומרים הנותרים.
    7. הסר כל נדיפים שנותרו מן התסנין מחוץ לקופסא באמצעות סעפת גז ואקום עם ואקום גבוה.
    8. בתוך תא הכפפות, להעביר את תערובת התגובה המרוכזת לתוך מיליליטר בתנור יבש 14/20 100 בקבוק מסביב לתחתית עם בר ומערבב להתכונן זיקוק. כיסוי או הבקבוק עם מחצה.
    9. תחת זרם של חנקן, לפתיחה מהירה של מחצה ולהוסיף הידריד סידן 200 מ"ג כסוכן ייבוש.
    10. הגדרת מנגנון זיקוק ידי התאמת oven-יבשי 14/20 ראש הזיקוק מצורף עם מדחום, צד אחד עם בקבוק אחסון אוויר ללא מיליליטר קבלת 14/20 50 ואת הצד השני עם בקבוק המ"ל 100 מוצר המכיל גולמי. צייד את ראש הזיקוק במים צוננים. (השתמש גריז לכל המפרקים של מנגנון הזיקוק.)
      הערה: המוצר מתחיל לזקק כאשר הטמפרטורה אדי מגיע 60 מעלות צלזיוס ב 300 mTorr.
    11. המשך איסוף המוצר על ידי העלאת הטמפרטורה של אמבט שמנים עד מדחום ראש הזיקוק קורא 75 ° C.
      הערה: המוצר הוא נוזל חסר צבע ברור.
    12. עצור זיקוק על ידי הסרת מקור חום לקרר את המנגנון לטמפרטורת החדר לפני האחסון. לאחר קירור, repressurize המנגנון עם חנקן בשר ומהדקים שסתומים תקע על בקבוק אחסון חינם-האוויר. אחסן את המוצר המבודד במקפיא תא הכפפות.
      הערה: התשואה יכולה לנוע בין 65% ל -84%.
  2. הכנת N -TBS- B -Cl-סגור טבעת מוצר (2)
    1. בתוך תא הכפפות, למדוד החוצה 56.0 גרם N -allyl- N adduct כלוריד -allyl -TBS- B (1) (217 מילימול) בתוך הבקבוק בתנור יבשים 24/40 1 L מסביב לתחתית עם בר ומערבבים ולהוסיף 500 טולואן מ"ל.
    2. מדוד את 1.79 גרם גרובס 1 זרז הדור st (2.17 מילימול).
    3. מוסיפים את הזרז חלק-חכם הפתרון ערבוב של 1 בטמפרטורת החדר בתוך תא הכפפות. טהר את התיבה לפני התוספת להסיר גז אתילן נוצר מן התגובה.
      הערה: התגובה היא בדרך כלל מלאה תוך 30 דקות של הפסקת אבולוצית גז. כפי אינדיקטור נוסף השלמה, צבע התגובה יהיה השתנה לחלוטין מסגול הראשוני שלה להשחים. בשלב זה, המוצר ניתן לבודד באמצעות זיקוק ואקום; ראה התייחסות 12 לפרטים. בפרוטוקול זה, הליך בסיר אחד, שני שלבים לסינתזה הישירה של 3 מתואר.
  3. הכנת N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3)
    1. כדי פתרון התגובה של מוצר הטבעת סגורה (2) טולואן, להוסיף 14.0 גרמו פלדיום על פחם (10% WT Pd, 13.2 mmol).
    2. הסר את הבקבוק מהקופסה להתאים אותו עם מעבה בתנור יבש 24/40 ריפלוקס כי כבר מטוהרת עם חנקן ומצוידי מים צוננים.
    3. מחמם את התגובה באמצעות אמבט שמנים על ריפלוקס נמרץ ב 135 ° C תוך ערבוב.
    4. לאחר שמירה על ריפלוקס במשך 16 שעות, לקרר את התגובה על ידי הסרת הבקבוק מהאמבטיה השמנה. לאחר קירור לטמפרטורת החדר, לסגת aliquot 0.5 מ"ל מתערובת התגובה באמצעות מזרק מצויד במחט מנעול Luer מיובש בתנור. מעבירים את aliquot 0.5 מ"ל לצינור NMR הברגה לנתח באמצעות 11 B תמ"ג 12.
      הערה: שיא המוצר הרצוי בחברת CA. 35.5 ppm 12, בעוד מאטר מתחילשיא ial מופיע ca. 42.9 ppm 12. בדרך כלל בשלב זה 11 B התמ"ג מציין את התגובה אינה שלמה, עם שיא חומר המוצא קטין נותר.
    5. אם התגובה אינה מלאה, להביא את בקבוק התגובה לתוך תא כפפות ולהוסיף פלדיום 3.00 גרם נוסף על פחמן (10% WT Pd, 2.82 מילימול).
    6. Resubject התגובה לריפלוקס תנאי כמתואר 1.3.2 ו 1.3.3.
    7. לאחר 24 שעות נוספות על ריפלוקס, לנתח aliquot אחר של התגובה על ידי 11 B תמ"ג. בשלב זה, התגובה צריכה להיות מוחלטת.
    8. מעביר את הבקבוק בתגובת תא הכפפות ולהעביר את תערובת התגובה דרך עמודת כרומטוגרפיה פלאש הפנויה ארוזה עם מגבוני נייר. אסוף את תסנין ידי שטיפה עם 50.0 מ"ל של טולואן.
    9. הסר כל נדיפים מן התסנין מחוץ לקופסא על סעפת גז ואקום מצוידת ואקום גבוה.
      הערה: הסרת נדיפים יכול לקחת 40 דקות to 90 דקות תלויות בלחץ הוואקום. כאשר מד הוואקום קורא לחץ מקסימאלי, הוא מציין כי הסרת הממס הושלמה. תוך הסרת ממס, לוודא כי באמבט מים מתחת הבקבוק נשאר בטמפרטורת החדר למשך פיזור חום.
    10. בתוך תא הכפפות, להעביר את תערובת התגובה המרוכזת לתוך מיליליטר בתנור יבש 24/40 250 בקבוק מסביב לתחתית עם בר ומערבב. כיסוי או הבקבוק עם מחצה.
    11. להסיר במהירות את מחצה ולהוסיף הידריד סידן 200 מ"ג כסוכן ייבוש.
    12. הגדרת מנגנון זיקוק ידי התאמת ראש זיקוק בתנור יבש 24/40 מצורף עם מדחום, צד אחד עם בקבוק אחסון אוויר ללא מיליליטר קבלת 24/40 100 ואת הצד השני עם 100 המ"ל בבקבוק המכיל מוצר גולמי. צייד את ראש הזיקוק במים צוננים. השתמש גריז לכל המפרקים של מנגנון הזיקוק.
      הערה: המוצר מתחיל לזקק כאשר הטמפרטורה אדי לגיל 65 עד 70 מעלות צלזיוס ב 1000 mTorr עם שמןהטמפרטורה באמבטיה בין 90-100 מעלות צלזיוס. המוצר הינו נוזל חסר צבע ברור.
    13. עצור זיקוק על ידי הסרת מקור חום לקרר את המנגנון לטמפרטורת החדר לפני האחסון. לאחר קירור, repressurize המנגנון עם חנקן בשר ומהדקים שסתומים תקע על בקבוק אחסון חינם-האוויר. אחסן את המוצר המבודד במקפיא תא הכפפות ב- C -30 °.
      הערה: התשואה עבור ההליך בסיר אחד, שני שלבים הוא 52%.

figure-protocol-2
איור 2: ספקטרום NMR 11 B ליצירת ניטור של N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3). א) N -Allyl- N -TBS-B-allyl adduct כלוריד (1), חומר המוצא עבור metathesis סגירת טבעת. B) חמצון לאחר 16 שעות. (Unreacted N -TBS- B -Cl-סגור טבעת המוצר (2) ו isomerized B -vinyl טבעת סגורה מוצר (2 ') יחד עם N-TBS-B-Cl-1,2-azaborine (3) מוצגים.) C) חמצון לאחר 24 שעות נוספות. D) מוצר מבודד (3) לאחר טיהור ידי זיקוק ואקום. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. הכנת N -H- B -OBu-1,2-azaborine (4)
    1. בתוך תא הכפפות, למדוד את 4.00 גרם N- TBS -B- Cl-1,2-azaborine (3) (17.6 mmol) בתוך הבקבוק בתנור יבשים 100 מ"ל מסביב לתחתית עם בר ומערבבים ולהוסיף 35 אצטוניטריל מ"ל. מדוד את 1.14 גרם acetamide (19.3 mmol) ולהעביר את בקבוק התגובה. חותם את הבקבוק עם מחצה גומי.
    2. הסר את בקבוק התגובה מהתיבה ולהשתלב עם oven מיובש 24/40 קבל ריפלוקס כי כבר מטוהר עם חנקן ומצוידי מים צוננים.
    3. מחממים את התגובה לריפלוקס ב 85 מעלות צלזיוס באמבט שמן עם ערבוב.
    4. אחרי 3 שעות ב ריפלוקס, לצנן את התגובה על ידי הסרת הבקבוק מהאמבטיה השמנה. לאחר קירור לטמפרטורת החדר, להסיר את הממס על סעפת גז ואקום מצויד ואקום גבוה.
    5. לאחר הסרת נדיפים תחת ואקום, redissolve שאריות התגובה THF 15.0 מ"ל. לפתרון זה להוסיף 3.21 מ"ל של n -butanol (35.1 mmol).
    6. מערבבים את התגובה בטמפרטורת החדר 1 ח.
    7. הסר את הממס על סעפת גז ואקום מצוידת ואקום גבוה כדי להשיג את המוצר הגולמי.
    8. בתוך תא הכפפות, לבודד את המוצר באמצעות כרומטוגרפיה סיליקה ג'ל טור, באמצעות תערובת של פנטן ואתר diethyl (5: 1) כמו eluent. הסר נדיפים מן השברים המכילים תוצר הלוואי באמצעות סעפת גז ואקום מצוידת ואקום גבוה כדי לקבל את המוצר הטהור כמולבן מוצק.
      הערה: התשואה יכולה לנוע בין 82% ל -87%.
  2. הכנת N -H- B -ethyl-1,2-azaborine (5)
    1. בתוך תא הכפפות, למדוד את 1.00 גרם N- H -B- אובו-1,2-azaborine (4) (6.62 מילימול) בתוך הבקבוק בתנור יבשים 100 מ"ל מסביב לתחתית עם בר ומערבבים ולהוסיף 25 מ"ל Et 2 O. חותם את הבקבוק עם מחצה גומי ומקום תחת N 2 על סעפת גז ואקום.
    2. בבקבוק תחתית עגולה 100 מ"ל בתנור יבשים נפרד, להוסיף 26.5 מ"ל של תמיסת ethyllithium (0.5 M ב בנזן / cyclohexane, 13.2 mmol) תחת אווירה חנקן. הסר את התערובת של הממס (בנזין / cyclohexane) מן מגיב ethyllithium כדי למנוע בעיות עם בידוד המוצר azaborine הרצוי. Redissolve ethyllithium מוצק 13.0 מ"ל Et 2 O.
      הערה: שים לב: ריאגנטים Organolithium הם pyrophoric (דליקים במגע עם אוויר או מים). המוצר הרצוי (5 ) במיוחד נדיף (MW = 106.96). לכן, הסרת ממס הבנזן / cyclohexane מן מגיב ethyllithium נדרשה עבור בידוד יעיל של המוצר הטהור בשל התנודתיות הדומה עם המוצר הרצוי.
    3. מצנן את בקבוק התגובה המכיל 4 עד -30 ° C עם אמבטית קירור.
    4. מוסיף את פתרון ethyllithium אל בקבוק התגובה באמצעות העברת צינורית ב -30 ° C. שמור ערבוב בטמפרטורה זו במשך 1 שעות ולאפשר לו חם לאט לטמפרטורת החדר.
    5. צג את התגובה על ידי 11 B תמ"ג. (שיא הביניים הרצוי בחברת CA. 39.8 ppm.)
    6. עם השלמת התגובה, לקרר את התגובה -30 ° C ולהוסיף 6.62 מ"ל פתרון HCl (2.0 M ב Et 2 O, 13.2 mmol). מערבבים את התגובה של 1 ש 'אך מאפשרים לה חם לאט לטמפרטורת החדר.
    7. הסר את הממס על סעפת גז ואקום מצוידת ואקום נמוך (20-25 Torr) עד לקבלת המוצר הגולמית.
    8. בתוך תא הכפפות,לבודד את המוצר באמצעות כרומטוגרפיה בעמודה סיליקה ג ', באמצעות כפי eluent 2-methylbutane. הסר את נדיפים על סעפת ואקום גז מצויד ואקום מוחלש כדי לקבל את המוצר הטהור כמו נוזל חסר צבע.
      הערה: התשואה היא 56%.

2. הכנת חלבון התגבשות של מוטאנטים ליזוזים T4

  1. ביטוי חלבון וטיהור
    1. לגדל תאים E. coli RR1 הפך עם פלסמידים subcloned (L99A או L99A / M102Q) 17, 20 ב 200 מ"ל LB (מרק lysogeny) התקשורת השלימו עם אמפיצילין 40.0 מ"ג ב 37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.
      הערה: הרכב מדיה LB הוא tryptone 12 גרם, 5 גרם תמצית שמרים, 10 גרם נתרן כלורי, ו 1 גלוקוז גרם לכל 1 LH 2 O.
    2. לחסן 4.00 מדיה L LB (בתוספת אמפיצילין 800 מ"ג) עם 160 מ"ל של תרבות לילה לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 240 סל"ד עם filtereאספקת אוויר ד.
    3. כאשר הצפיפות האופטית מגיעה 0.7 ב 600 ננומטר, לקרר את תרבית החיידקים לטמפרטורת חדר על ידי הסרתו מן החממה.
    4. מדוד את 695 מ"ג של איזופרופיל- β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (ריכוז סופי של 0.7 מ"מ) בצינור צנטריפוגה חרוטים ולהוסיף 4 מיליליטר תקשורת LB לפזר.
    5. מוסיפים את פתרון IPTG לתרבות להשרות ביטוי חלבון. דגירת התרבויות ב 110 סל"ד במשך 21 שעות ב 25 מעלות צלזיוס.
    6. צנטריפוגה התרבות ב 4,412 XG במשך 30 דקות ב 4 °. בטל supernatant ו resuspend גלולה ב 300 מ"ל של 0.1 M פוספט נתרן (pH 6.6), 0.2 M NaCl ולהוסיף 30.0 מ"ל של 0.5 M ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) (pH 8.0). מערבבים את ההשעיה עבור 17 שעות ב 4 ° C.
    7. הוסף 30.0 מ"ל של 1.0 M MgCl 2 ו 0.500 מ"ל של deoxyribonuclease אני (DNase אני) על השעיית ומערבבים בטמפרטורת החדר למשך 8 שעות.
    8. צנטריפוגה השעית תא lysed ב 30,913 XG במשך 30 דקות ב 4 76; C. אסוף את supernatant המכיל חלבון הביע וזורק את הכדור.
    9. Dialyze את lysate נגד פוספט נתרן 20 מ"מ (pH 6.5 עבור L99A ו- pH 6.3 עבור L99A / M102Q) בשעה 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    10. לשטוף לאזן 20.0 מ"ל של חרוזים חילוף יונים carboxymethyl עם חיץ איזון (50 מ"מ טריס, 1 mM EDTA (pH 7.3)) בטור. טען את חלבון המכיל הפתרון על חרוזים לשטוף את העמודה עם 100 מ"ל של חיץ איזון. Elute את העמודה עם שיפוע ליניארית מ"ל 600 של 300 מ"מ NaCl בתוך חיץ איזון.
    11. השתמש במערכת כרומטוגרפיה בלחץ נמוך לטיהור העמודה. השתמש שיעור משאבת של 1 מ"ל / דקה לאסוף שברים של 10 מ"ל. אסוף שברים המכיל חלבון טהור.
      הערה: במהלך elution, לפקח על הצפיפות האופטית (OD) ב 280 ננומטר לאמת נוכחות של החלבון. לקבוע את הטוהר של כל חלק על ידי SDS-PAGE ולאסוף את השברים הטהורים בלבד.
"FO: keep-together.within-page =" 1 "> figure-protocol-3
איור 3: נציג תוצאות עבור טיהור החלבונים של L99A מוטציה ליזוזים T4 / M102Q. א) chromatogram מראה את ספיגת UV שנמדדה AU ב 280 ננומטר (הקו הכחול) ומוליכות ב- MS / ס"מ (קו אדום). שברי 20-23 אוחדו הטוהר נקבע על ידי SDS-PAGE. B) 15% SDS-PAGE ג'ל מראה נוכחות של חלבון מטוהרים של שברים 20-23 ב 18.6 kDa. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. התגבשות חלבון
    1. מעבירים את הפתרון חלבון מטוהרים על צינורות קרום דיאליזה (12,000 ל -14,000 MWCO). מניחים את צינורות דיאליזה לתוך מבחנה המכילה 4.00 ליטר של פוספט נתרן 100 מ"מ, 550 מ"מ NaCl, 0.02% NaN 3 (pH 6.5 עבור L99A ו- pH 6.3 עבור L99A / M102). מערבבים את הפתרון L 4 לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    2. מוסיפים 2-mercaptoethanol (ריכוז סופי של 5 מ"מ) המדגם dialyzed ולהתרכז כדי ~ 40.0 מ"ג / מ"ל ​​באמצעות concentrator צנטריפוגלי (10,000 MWCO). קביעת ריכוז החלבון על ידי מדידת הספיגה ב 280 ננומטר. הסר את כל המשקע על ידי ספינינג לפני התגבשות.
    3. השתמש בשיטת תליית ירידת אדי דיפוזיה עבור התגבשות חלבון. מערבבים 5.00 μL של פתרון חלבון מרוכז עם 5.00 μL של פתרון המאגר (2.0-2.2 M נתרן / אשלגן זרחתי, pH 6.7-7.1, 50 מ"מ 2-mercaptoethanol, 50 מ"מ דיסולפיד 2-hydroxyethyl) בשקופית מכסה זכוכית siliconized.
    4. לאזן את הירידה תערובת נגד 1.00 מ"ל של הפתרון למאגר על ידי הצבת את השקופית לכסות במהופך על גבי פתרון מאגר המכיל כל טוב. השתמש גריז לאטום הרמטית כל טוב עם שקופיות. הגדרת תנאים שונים באמצעות צלחת 24 גם עם פתרון מאגר מוזכר 2.2.3.אחסן את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס במשך צמיחת קריסטל.
      הערה: קריסטלים בדרך כלל לגדול בתוך 1-2 שבועות למאגר equilibrated בשקופית לכסות. ממטרים מיידיים במהלך ערבוב פתרון חלבון עם פתרון המאגר בשלב 2.2.3 מצביע על כשל של התגבשות.

figure-protocol-4
איור 4: תמונה מייצגת של גבישים של L99A מוטציה ליזוזים T4 לפני complexation עם הליגנדים. קריסטלים נמצאים המשקאות אמא (2.1 M נתרן / אשלגן זרחתי, pH 6.9, 50 מ"מ 2-mercaptoethanol, 50 מ"מ דיסולפיד 2-hydroxyethyl). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. הכנת Complex
    1. בחר את הגבישים באמצעות צינורות קריוגני בצורה ללולאה (ראה רשימת חומרים) ולמקם אותם בתוך שפופרת 0.6 מ"ל microcentrifuge. להוסיף 50.0 μL של ליקר אמא אל הצינור כדי למנוע יובש ולשמר את הגבישים.
      הערה: בחירת גביש יחידה נעזרה באמצעות מיקרוסקופ.
    2. מעבירים את שפופרת המכילה גבישים לתוך תא הכפפות. קח 5.00 μL של ליגנד azaborine (5) ומניחים בתוך ה- Snap-כובע של הצינור. שווי ולאחסן את הצינורית מקרר (4 ° C) בתוך תא הכפפות עבור 2-7 ימים עבור איזון על ידי דיפוזיה אדי.
      הערה: התכונות הפיסיקליות (תנודתיות גבוהה מסיס בתמיסה מימית) של ליגנד azaborine (5) מאפשרת complexation עם גבישי החלבון מתבצעים דרך שיטת דיפוזיה אדי.
    3. מעביר את הגבישים באמצעות צינורות קריוגני בצורה ללולאה לשקופית זכוכית המכילה טיפה של N-paratone לפני פלאש-ההקפאה בחנקן נוזלי. פיק הגביש מוגן עם N-paratone במהירות להקפיא פלאש באמצעות תקיעת הקריסטל עללולאה לתוך דיואר המכיל חנקן נוזלי. הר הגביש על לולאה באמצעות טונג קריוגני.
    4. אסוף ערכות נתונים של גביש יחיד באמצעות קרינת synchrotron. בצע החלפה מולקולרית באמצעות מבנים פרסמו 20, 24; לאמת את קיומו של ליגנד בתוך אתר החלבון מחייב על ידי כתם בלתי הדגם של צפיפות אלקטרונים.

figure-protocol-5
איור 5: מודלים אטומיים של L99A מוטציה ליזוזים T4 מחייבים כיס עם צפיפות אלקטרונים. א) L99A חלל עם בועת צפיפות אלקטרונים-פי דגם של האו"ם אתר הקישור. B) L99A חלל עם ליגנד azaborine הדגם 5 בשני conformers חלופי. אנא CLאיכס כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

המסלול סינתטי סכמטי עבור 1,2-azaborines מוצג באיור 1. פרוטוקול זה חל על סינתזה של חמש מולקולות המכילות חנקן בורון שונים. איור 2 מייצג 11 ספקטרום B התמ"ג נמדד במהלך הצעד 1.3 לפקח על היווצרות של המוצר הרצוי (3). טיהור חלבון בוצעה באמצעות מערכת כרומטוגרפיה בלחץ נמוך ו הכרומתוגרמה נציג מוצגת באיור 3. הטוהר של השברים שנאספו נקבע על ידי SDS-PAGE. קריסטלים של L99A מוטציה ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בחלקו הראשון של פרוטוקול זה, תארנו סינתזה שונה של 1,2-azaborines מבוסס על שיטות שדווחו בעבר 12, 13. Triallylborane 22 שימש כתחליף המסלולים באמצעות allyltriphenyl allyltrifluoroborate פח או אשלגן להכין N -allyl- N adduct כלוריד -allyl -TBS- B (1). שיטה זו מאפשרת גישה אטומה-חסכונית וידידותית לסביבה יותר. לסינתזה של N -TBS- B -Cl-1,2-azabori...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

כל המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים בכתב יד זה.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות NIGMS (R01-GM094541) ומכללת בוסטון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
טטרהידרופוראן (THF), ללא מעכבים, עבור HPLC, ≥ 99.9%סיגמא אולדריץ'34865
אתר דיאתיל (Et2O), עבור HPLC, ≥ 99.9%, ללא מעכביםSigma Aldrich309966
מתילן כלוריד  (CH2Cl2), (ACS מיוצב/מוסמך)FisherD37-20
טולואןפישר T290-4
פנטן, HPLCFisherP399-4
אצטוניטרילפישרA21-4
סידן הידריד (CaH2), דרגת ריאגנט, 95%סיגמא אולדריץ'208027פלדיום פירופורי
על פחם פעיל (Pd/C), 10 wt% PdStrem46-1900
תמיסת בורון טריכלוריד 1.0 M בהקסאןסיגמא אולדריץ'211249טריאתילאמין רעיל/פירופורי מאוד
, ≥ 99.5%Sigma Aldrich471283
Grubbs 1st generation זרז materiaC823
אצטמידסיגמא אולדריץ'A0500
n-בוטנול, נטול מים, 99.8%סיגמא אולדריץ'281549
תמיסת אתיליתיום, 0.5  M בבנזן/ציקלוהקסאןסיגמא אולדריץ'561452רעילה מאוד/פירופורית
, 2.0 מ' ב-Et2OSigma Aldrich455180
2-מתילבוטן, נטול מים, ≥ 99%Sigma Aldrich277258
Escherichia coli, (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC® 31343™)ATCC31343
T4 lysozyme WT* (L99A)Addgene18476
T4 מוטציה ליזוזים (S38D, L99A, M102Q N144D)Addgene18477
מלח נתרן אמפיצילין, סיגמא אולדריץ'A0166
איזופרופיל-ובטא;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) InvitrogenAM9464
נתרן פוספט חד בסיסי נטול מיםפישרBP329
נתרן פוספט דו-בסיסי נטול מיםפישרBP332
נתרן כלוריפישרS642212 
Ethylenediaminetetraacetic חומצהפישרBP118
מגנזיום כלורידSigma AldrichM4880קורוזיבי
תרמו מדעי פירס DNaseIFisherPI-90083
GE בריאות  Sepharose Fast Flow Cation Exchange MediaFisher45-002-931
Tris-baseFisherBP152-500 
נתרן אזידTCIS0489רעיל מאוד
2-מרקפטואתנולפישרICN806443 
סרטוריוס  Vivaspin 20 רכזים צנטריפוגלייםפישר14-558-501
אשלגן פוספט מונו-בסיסיסיגמא אולדריץ'P5379
2-הידרוקסיאתיל דיסולפידסיגמא אולדריץ'380474
N-paratone Hampton ResearchHR2-643
4 RC צינורות ממברנת דיאליזה 12,000 עד 14,000 דלטון MWCO פישר08-667E
  CryoLoop Hampton Researchבצורת לולאה
CryoTongThermo Fisherמלקחיים קריוגניים
Cootתמונות צפיפות אלקטרונים נוצרות מהתוכנה
תמיסת HCl , , , צינורות קריוגניים של

מקורות

  1. Ducruix, A., Giége, R. Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach. , IRL Press. Oxford, UK, New York. (1992).
  2. Bosdet, M. J. D., Piers, W. E. B-N as a C-C substitute in aromatic systems. Can. J. Chem. 87 (1), 8-29 (2009).
  3. Campbell, P. G., Marwitz, A. J., Liu, S. -Y. Recent Advances in Azaborine Chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 51 (25), 6074-6092 (2012).
  4. Wang, X. -Y., Wang, J. -Y., Pei, J. B. N. Heterosuperbenzenes: Synthesis and Properties. Chem. Eur. J. 21 (9), 3528-3539 (2015).
  5. Zhou, H. -B., et al. Elemental isomerism: a boron-nitrogen surrogate for a carbon-carbon double bond increases the chemical diversity of estrogen receptor ligands. Chem. Biol. 14 (6), 659-669 (2007).
  6. Ito, H., Yumura, K., Saigo, K. Synthesis, characterization, and binding property of isoelectronic analogues of nucleobases, B(6)-substituted 5-aza-6-borauracils and -thymines. Org. Lett. 12 (15), 3386-3389 (2010).
  7. Vlasceanu, A., Jessing, M., Kilburn, J. P. BN/CC isosterism in borazaronaphthalenes towards phosphodiesterase 10A (PDE10A) inhibitors. Bioorg. Med. Chem. 23 (15), 4453-4461 (2015).
  8. Rombouts, F. J., Tovar, F., Austin, N., Tresadern, G., Trabanco, A. A. Benzazaborinines as Novel Bioisosteric Replacements of Naphthalene: Propranolol as an Example. J. Med. Chem. 58 (23), 9287-9295 (2015).
  9. Culling, G. C., Dewar, M. J. S., Marr, P. A. New Heteroaromatic Compounds. XXIII. Two Analogs of Triphenylene and a Possible Route to Borazarene. J. Am. Chem. Soc. 86 (6), 1125-1127 (1964).
  10. White, D. G. 2-Phenyl-2,1-borazarene and Derivatives of 1,2-Azaboracycloalkanes. J. Am. Chem. Soc. 85 (22), 3634-3636 (1963).
  11. Ashe III, A. J., Fang, X. A Synthesis of Aromatic Five- and Six-Membered B−N Heterocycles via Ring Closing Metathesis. Org. Lett. 2 (14), 2089-2091 (2000).
  12. Marwitz, A. J. V., Matus, M. H., Zakharov, L. N., Dixon, D. A., Liu, S. -Y. A Hybrid Organic/Inorganic Benzene. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (5), 973-977 (2009).
  13. Abbey, E. R., Lamm, A. N., Baggett, A. W., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. Protecting Group-Free Synthesis of 1,2-Azaborines: A Simple Approach to the Construction of BN-Benzenoids. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12908-12913 (2013).
  14. Rudebusch, G. E., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. Rhodium-catalyzed boron arylation of 1,2-azaborines. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (35), 9316-9319 (2013).
  15. Brown, A. N., Li, B., Liu, S. -Y. Negishi Cross-Coupling Is Compatible with a Reactive B-Cl Bond: Development of a Versatile Late-Stage Functionalization of 1,2-Azaborines and Its Application to the Synthesis of New BN Isosteres of Naphthalene and Indenyl. J. Am. Chem. Soc. 137 (28), 8932-8935 (2015).
  16. Knack, D. H. BN/CC Isosteric Compounds as Enzyme Inhibitors: N- and B-Ethyl-1,2-azaborine Inhibit Ethylbenzene Hydroxylation as Non-Convertible Substrate Analogs. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (9), 2599-2601 (2013).
  17. Eriksson, A. E. Response of a Protein Structure to Cavity-Creating Mutations and Its Relation to the Hydrophobic Effect. Science. 255 (5041), 178-183 (1992).
  18. Eriksson, A. E., Baase, W. A., Wozniak, J. A., Matthews, B. W. A cavity-containing mutant of T4 lysozyme is stabilized by buried benzene. Nature. 355 (6358), 371-373 (1992).
  19. Morton, A., Baase, W. A., Matthews, B. W. Energetic Origins of Specificity of Ligand Binding in an Interior Nonpolar Cavity of T4 Lysozyme. Biochemistry. 34 (27), 8564-8575 (1995).
  20. Wei, B. Q., Baase, W. A., Weaver, L. H., Matthews, B. W., Shoichet, B. K. A Model Binding Site for Testing Scoring Functions in Molecular Docking. J. Mol. Biol. 322 (2), 339-355 (2002).
  21. Lee, H., Fischer, M., Shoichet, B. K., Liu, S. -Y. Hydrogen Bonding of 1,2-Azaborines in the Binding Cavity of T4 Lysozyme Mutants: Structures and Thermodynamics. J. Am. Chem. Soc. 138 (37), 12021-12024 (2016).
  22. Brown, H. C., Racherla, U. S. Organoboranes. 43. A Convenient, Highly Efficient Synthesis of Triorganylboranes via a Modified Organometallic Route. J. Org. Chem. 51 (4), 427-432 (1986).
  23. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  24. Liu, L., Baase, W. A., Matthews, B. W. Halogenated Benzenes Bound within a Non-polar Cavity in T4 Lysozyme Provide Examples of I.S and I.Se Halogen-bonding. J. Mol. Biol. 385 (2), 595-605 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

12 AzaborinefoldXNMR 11
סינתזה של 1,2-Azaborines ואת ההכנה של קומפלקסי החלבונים שלהם עם מוטאנטים ליזוזים T4
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.