מוצג פרוטוקול לסינתזה של 1,2-אזבורינים והכנת קומפלקסי החלבון שלהם עם מוטציות ליזוזים T4.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
סינתזה של 1,2-Azaborines ואת ההכנה של קומפלקסי החלבונים שלהם עם מוטאנטים ליזוזים T4
במאמר זה
סיכום
תקציר
אנו מתארים סינתזה כללית של 1,2-אזבורינים תוך שימוש בטכניקות סטנדרטיות נטולות אוויר והכנת קומפלקס חלבונים עם מוטציות ליזוזים T4 על ידי דיפוזיה של אדים. תרכובות רגישות לחמצן ולחות מוכנות ומבודדות תחת אטמוספירה אינרטית (N2) באמצעות סעפת גז ואקום או תא כפפות. כדוגמה לסינתזה של אזבורין, אנו מדגימים את הסינתזה והטיהור של ה-N-H-B-ethyl-1,2-azaborine הנדיף על ידי רצף בן חמישה שלבים הכולל זיקוק וכרומטוגרפיה של עמודות לבידוד מוצרים. מוטציות ליזוזים T4 L99A ו-L99A/M102Q באות לידי ביטוי בזן Escherichia coli RR1. פרוטוקולים סטנדרטיים לליזה של תאים כימיים ואחריהם טיהור באמצעות עמודת חילופי יונים קרבוקסימתיל מעניקים חלבון בעל טוהר גבוה מספיק להתגבשות. התגבשות החלבון מתבצעת בריכוזים שונים של משקעים בטווחי pH שונים בשיטת דיפוזיה של אדי טיפה תלויה. הכנה מורכבת עם המולקולות הקטנות מתבצעת בשיטת דיפוזיה של אדים תחת אטמוספירה אינרטית. ניתוח עקיפה של קרני רנטגן של קומפלקס הגביש מספק ראיות מבניות חד משמעיות לאינטראקציות קשירה בין אתר קשירת החלבון ל-1,2-אזבורינים.
מבוא
בורון-חנקן המכיל heterocycles (כלומר 1,2-azaborines) משך תשומת לב משמעותית לאחרונה isosteres של ארנס. Isosterism זה יכול להוביל גיוון של מוטיבים מבניים קיימים כדי להרחיב את השטח הכימי 2, 3, 4. יש Azaborines שירות פוטנציאל היישום במחקר ביו 5, 6, 7, 8, במיוחד בתחום של כימיה רפואית שבה כימאים לבצע סינתזה של ספריות של מבנית ומולקולות רלוונטיות מבחינה תפקודית. ראוי לציין, עם זאת, בעוד ישנם מסלולים סינטטיי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: כל מניפולציות החמצן ולחות רגישה בוצעו תחת אווירת אינרטי (N 2) או באמצעות טכניקות אוויר ללא רמה או תא הכפפות. THF (tetrahydrofuran), Et 2 O (אתר diethyl), 2 CH 2 Cl (dichloromethane), טולואן, ו פנטן היו מטוהרים על ידי עובר דרך טור אלומינה נייטרלי תחת ארגון. אצטוניטריל היה מיובש על CAH 2 (הידריד סידן) ומזוקק תחת אווירה חנקן לפני השימוש. Pd / C (פלדיום על פחמן) היה מחומם תחת ואקום גבוה ב -100 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות לפני השימוש. ג'ל סיליקה (230-400 רשת) היה מיובש במשך 12 שעות ב 180 ° C תחת ואקום גבוה. כרומטוגרפיה פלאש בוצעה עם ג'ל סיליקה זה תחת אווירה אינרטי. כ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
המסלול סינתטי סכמטי עבור 1,2-azaborines מוצג באיור 1. פרוטוקול זה חל על סינתזה של חמש מולקולות המכילות חנקן בורון שונים. איור 2 מייצג 11 ספקטרום B התמ"ג נמדד במהלך הצעד 1.3 לפקח על היווצרות של המוצר הרצוי (3). טיהור חלבון בוצעה באמצעות מערכת כרומטוגרפיה בלחץ נמוך ו הכרומתוגרמה נציג מוצגת באיור 3. הטוהר של השברים שנאספו נקבע על ידי SDS-PAGE. קריסטלים של L99A מוטציה ל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בחלקו הראשון של פרוטוקול זה, תארנו סינתזה שונה של 1,2-azaborines מבוסס על שיטות שדווחו בעבר 12, 13. Triallylborane 22 שימש כתחליף המסלולים באמצעות allyltriphenyl allyltrifluoroborate פח או אשלגן להכין N -allyl- N adduct כלוריד -allyl -TBS- B (1). שיטה זו מאפשרת גישה אטומה-חסכונית וידידותית לסביבה יותר. לסינתזה של N -TBS- B -Cl-1,2-azabori.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
כל המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים בכתב יד זה.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות NIGMS (R01-GM094541) ומכללת בוסטון.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| טטרהידרופוראן (THF), ללא מעכבים, עבור HPLC, ≥ 99.9% | סיגמא אולדריץ' | 34865 | |
| אתר דיאתיל (Et2O), עבור HPLC, ≥ 99.9%, ללא מעכבים | Sigma Aldrich | 309966 | |
| מתילן כלוריד (CH2Cl2), (ACS מיוצב/מוסמך) | Fisher | D37-20 | |
| טולואן | פישר T290-4 | ||
| פנטן, HPLC | Fisher | P399-4 | |
| אצטוניטריל | פישר | A21-4 | |
| סידן הידריד (CaH2), דרגת ריאגנט, 95% | סיגמא אולדריץ' | 208027 | פלדיום פירופורי |
| על פחם פעיל (Pd/C), 10 wt% Pd | Strem | 46-1900 | |
| תמיסת בורון טריכלוריד 1.0 M בהקסאן | סיגמא אולדריץ' | 211249 | טריאתילאמין רעיל/פירופורי מאוד |
| , ≥ 99.5% | Sigma Aldrich | 471283 | |
| Grubbs 1st generation זרז | materia | C823 | |
| אצטמיד | סיגמא אולדריץ' | A0500 | |
| n-בוטנול, נטול מים, 99.8% | סיגמא אולדריץ' | 281549 | |
| תמיסת אתיליתיום, 0.5 M בבנזן/ציקלוהקסאן | סיגמא אולדריץ' | 561452 | רעילה מאוד/פירופורית |
| , 2.0 מ' ב-Et2O | Sigma Aldrich | 455180 | |
| 2-מתילבוטן, נטול מים, ≥ 99% | Sigma Aldrich | 277258 | |
| Escherichia coli, (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC® 31343™) | ATCC | 31343 | |
| T4 lysozyme WT* (L99A) | Addgene | 18476 | |
| T4 מוטציה ליזוזים (S38D, L99A, M102Q N144D) | Addgene | 18477 | |
| מלח נתרן אמפיצילין | , סיגמא אולדריץ' | A0166 | |
| איזופרופיל-ובטא;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Invitrogen | AM9464 | |
| נתרן פוספט חד בסיסי נטול מים | פישר | BP329 | |
| נתרן פוספט דו-בסיסי נטול מים | פישר | BP332 | |
| נתרן כלורי | פישר | S642212 | |
| Ethylenediaminetetraacetic חומצה | פישר | BP118 | |
| מגנזיום כלוריד | Sigma Aldrich | M4880 | קורוזיבי |
| תרמו מדעי פירס DNaseI | Fisher | PI-90083 | |
| GE בריאות Sepharose Fast Flow Cation Exchange Media | Fisher | 45-002-931 | |
| Tris-base | Fisher | BP152-500 | |
| נתרן אזיד | TCI | S0489 | רעיל מאוד |
| 2-מרקפטואתנול | פישר | ICN806443 | |
| סרטוריוס Vivaspin 20 רכזים צנטריפוגליים | פישר | 14-558-501 | |
| אשלגן פוספט מונו-בסיסי | סיגמא אולדריץ' | P5379 | |
| 2-הידרוקסיאתיל דיסולפיד | סיגמא אולדריץ' | 380474 | |
| N-paratone | Hampton Research | HR2-643 | |
| 4 RC צינורות ממברנת דיאליזה 12,000 עד 14,000 דלטון MWCO | פישר | 08-667E | |
| CryoLoop Hampton Research | בצורת לולאה | ||
| CryoTong | Thermo Fisher | מלקחיים קריוגניים | |
| Coot | תמונות צפיפות אלקטרונים נוצרות מהתוכנה |
מקורות
- Ducruix, A., Giége, R. Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach. , IRL Press. Oxford, UK, New York. (1992).
- Bosdet, M. J. D., Piers, W. E. B-N as a C-C substitute in aromatic systems. Can. J. Chem. 87 (1), 8-29 (2009).
- Campbell, P. G., Marwitz, A. J., Liu, S. -Y.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
