הכנת פרוסות אופקיות של רשתית למבוגרים עכבר עבור אלקטרו מחקרים

סיכום

פתחנו תכשיר חתך אופקי של הרשתית היונקת הבוגרת עם המטוס של חתך במקביל לפני שטח הרשתית. שדות דנדריטים של נוירונים ברשתית אוריינטציה nonradially לא היו מקוצץ, המאפשר חקר עיבוד אותות עם טכניקות תיקון- clamp והדמיה.

תקציר

הכנות פרוסות אנכיות מבוססות היטב ללמוד מעגלים והעבירו אותות ברשתית של יונקי הבוגרים. המטוס של חתך בהכנות אלה הוא בניצב לפני שטח הרשתית, מה שהופך אותו אידיאלי לחקר נוירונים רדיאלית אורינטציה כמו קולטני אור ותאים דו קוטביים. עם זאת, סוכות דנדריטים הגדולות של תאים אופקיים, תאי amacrine רחב בתחום, ותאי גנגליון הן בעיקר קטומות, עזב פעילות סינפטית מופחתת במידה ניכרת בתאים אלה. בעוד תאי גנגליון ותאי amacrine העקורים ניתן ללמוד הכנה שלמה הרכובה של הרשתית, תאים אופקיים ותאי amacrine ממוקמים שכבת הגרעין הפנימית הם רק גרוע נגישים עבור אלקטרודות ברקמת רשתית כולה.

כדי להשיג נגישות מקסימלית ויושרה הסינפטי, פתחנו תכשיר חתך אופקי של רשתית העכבר, ולמדו להעברת אות ב הסינפסה בין קולטני אור ואופקיתאים. חתך אופקי מאפשר (1) זיהוי חזותי קל וחד משמעי של גופי תא אופקיים מיקוד אלקטרודה, ו (2) שמירה על שדות דנדריטים תא אופקי המורחבים, כתנאי מוקדם קלט הסינפטי חרוט שלם ופונקציונלי דנדריטים תא אופקיים.

תאים אופקיים מן הפרוסות אופקיות הציגו פעילות סינפטית טוניק בחושך, והם הגיבו לתדרך הבזקי אור עם ירידה של פעילות סינפטית נוכחית והפחיתה פנימה. ראיות Immunocytochemical מציין שכמעט כל קונוסים בתוך השדה הדנדריטים של תא אופקי להקים סינפסות עם דנדריטים ההיקפיים. בהכנת הפרוסה האופקית ולכן מתאימה גם ללמוד את המאפיינים הפיסיולוגיים של נוירונים ברשתית להאריך אותה אופקית כמו גם להעברת אות חושית ואינטגרציה ברחבי סינפסות שנבחרו.

מבוא

מידע חזותי מקודד כדפוס במרחב ובזמן דינמיקה של הפעלת קולטי אור, ואת סינפסה הסרט בין קולטני אור ונוירונים מסדר השני קובעת את העברת הזרם של מידע חזותי. הכנת החיתוך האנכית של הרשתית היונקת היא כלי בעל ערך רב ללמוד עיבוד אותות במסלולים אנכיים, כלומר בין קולטני אור ותאים דו קוטביים, ובין תאים דו קוטביים סוגים מסוימים של תאי amacrine ^{1, 2, 3, 4.}

עם זאת, חתך אנכי תמיד גורם עיצור חמור של שדות דנדריטים של נוירונים ברשתית רבים, שמוביל לאובדן ניכר של קשרים סינפטיים. במיוחד ברשתית החיצונית, תאים אופקיים מושפעים בשל שדות דנדריטים המורחבים רוחבי להפיץ שלהם ומערכות מסוף האקסון ^5. בעוד אנכילהכנת פרוסה, הקלט הסינפטי של מאה מסופי photoreceptor חרוט אל דנדריטים של תא אופקי ובכך מצטמצמת כמה קשרים דלילים. זה עשוי להספיק כדי ללמוד את המאפיינים של סינפסות בודדות, אך היא עושה בשום פנים ואופן לא מייצג את יכולות עיבוד אותות שבבסיס ההפעלה המסונכרנת של סינפסות סרט קולטי אור.

לפיכך, אנו פתחנו להכנת פרוסה אופקית, מה שמשאיר כמעט כל קולטי האור החרוטים קלט הסינפטי על דנדריטים תא אופקיים שלמות ומתפקד. המטוס של ריצות חתך מקביל פני השטח של הרשתית, אידיאלי חיתוך דרך שכבת הגרעין הפנימי בין תאים אופקיים ותאי amacrine. לפיכך, פרוסות אופקיות של הרשתית החיצונית נוצרות המכילות, באתר presynaptic, קולטני אור עם פלחים פנימיים וחיצוניים וכן מסוף הסינפטי, ותאים אופקיים תאים דו קוטביים באתר הפוסט-סינפטי. הכנה זו מתאימה היטב to לחקור תשומות הסינפטי מתואמות לתוך דנדריטים תא אופקיים על ידי כל קולטני האור חרוט בתוך השדה הדנדריטים שלו. זה ובכך עשוי להיות שימושי כדי להבין טוב יותר את פעולתו של סינפסה סרט קולטי האור, שהוא חיוני להעברת מידע חזותי מהמטריצה ​​של הפעלת קולטי האור לתוך תגובה postsynaptic.

פרוטוקול

כל הנהלים בוצעו בהתאם להנחיות לניסויים בבעלי חיים שהונפקו על ידי הרפובליקה הפדרלית של גרמניה.

הערה: מכיוון רקמת הרשתית תהיה נטולה חמצן במהלך חלקים ממושכים של הליך זה, כל הצעדים צריכים להתבצע מהר ככל האפשר. עכברים צריכים להיות כהים מותאמים לפחות 3 שעות לפני הניתוח. כדי למנוע הסתגלות לאור ברשתית, הכנה חיתוך צריך להתבצע תחת אור אדום עמום.

1. הכנת כימיקלי מדיה אחרת

1. כן איימס בינוני ^6. לאחר דיסקציה, לטבול רקמת הרשתית ב בינוני 'איימס בכל עת.
   1. ממיסים 2.2 גרם של בינוני 'איימס 298 HEPES מ"ג ב 250 מ"ל מים מזוקקים. ריכוז HEPES יהיה 5 מ"מ. מערבבים בעדינות עד שכל החלקיקים המומסים.
   2. בינוני 'הבועה איימס בטמפרטורת החדר עם carbogen (חמצן 95%, 5% המכוניתפחמן דו בון) עבור 5 דקות לפחות. אספקת carbogen עם פיפטה פסטר זכוכית לפתרון. חבר את פיפטה פסטר דרך צינורות מתאימים לשקע של רגולטור הגז.
   3. להוסיף 475 מ"ג-סודיום ביקרבונט לפתרון. התוספת של ביקרבונט לאחר מבעבע מונע משקעים של סידן פחמתי.
2. הכן agarose gelling בטמפרטורה נמוכה. Agarose נדרש להטבעה של רקמת רשתית במהלך חתך vibratome.
   1. ממיסים 180 agarose מ"ג ב 9 מ"ל איימס בינוני ו 1 מ"ל מים מזוקקים. השתמש במיקרוגל כדי לחמם את פתרון agarose לאט עד שכל המוצקים הם מומסים. מחממים 5 - 10 במרווחים שניים כדי למנוע הצפה. הפתרון צריך להיות ברור ושקוף.
   2. חנות מומסת agarose באמבט מים ב 37 ° C למשך זמן של ההליך.

2. הגדרת Vibratome

הערה: כל החתך בוצע עםvibratome הנזכר בטבלת החומרים. ההגדרות שניתנו מתייחסים לסוג זה של vibratome בלבד. לפרטים נוספים על vibratome חתך של רקמה עצבית בבקשה להתייחס התייחסות ^7.

1. מניח vibratome להב מזרק לתוך מחזיק להב.
2. מדוד הטיה אנכית של להב עם המכשיר "vibrocheck". השתמש בורג התאמה על מחזיק הלהב כדי להטות את הלהב עד שהוא מקביל למישור החיתוך. המיקום המדויק של הלהב נחוץ כדי למנוע תופעות תריסים על פני שטח הסעיף וכדי לייצר קטע שטוח המכיל תאי חיים על פני השטח שלו.
3. גדר vibratome להגדרות הבאות: משרעת, 1.00; מהירות, 0.20; עובי, 180 - 200 מיקרומטר.

Dissection 3. רשתית עכבר

1. לטשטש עכבר בוגר C57BL / 6 על ידי אידוי של כ 1 מ"ל isoflurane במיכל אטום לאוויר. כאשר הרדמה תושלם, להרדים בעלי חיים על ידי נקע בצוואר הרחם. העכבר לא צריך להיות מעל גיל 3 חודשים, אחרת איכות הפרוסות תדרדר.
2. הסר כדור העין על ידי הצבת מלקחיים מעוקל תחת עינו. בעדינות הרמת כדור העין יחשוף את עצב הראייה. חותכים את עצב הראייה עם מספריים באביב ולהעביר כדור העין כדי בצלחת פטרי 35 מ"מ המכיל 2 מ"ל בינוני 'איימס.
3. ביצוע כל הצעדים הבאים על הבמה של מיקרוסקופ סטריאו. התאם את ההגדלה לערך המאפשרת שליטה ויז'ואלי מההליכים הבאים (שלבים 3.4 - 3.9).
4. לנקב את הקרנית על המעבר בלובן העין עם מלקחיים מחודדים או מחט 20 G. במהלך שלב זה, לייצב את כדור העין עם מלקחיים אחרים. היזהר שלא לפגוע ברשתית עם מכשיר ניקוב.
5. הכנס את מספרי האביב לתוך החור הקטן עשוי בשלב 3.3 וחותכי עיגול סביב הקרנית. שוב, לייצב את כדור העין עם מלקחיים תוך חיתוך. שמור החתך מאוד קרוב לפני השטח כדי לא גut לתוך הרשתית.
6. מוציאים בזהירות הקרנית, העדשה, הגוף הזגוגי עם מלקחיים. הגוף הזגוגי מהווה רק שכבה שקופה דקה בחלק האחורי של העין. עם זאת, הוא חיוני עבור vibratome חתך כי הגוף הזגוגי יוסר לחלוטין.
7. בצלחת פטרי, מקם את עיינית באופן מסתכל דרך החור למטה על הרשתית. שפת הפתח צריכה להיות מורכבת של רקמות scleral בלבד. אם החתך העגול (שלב 3.4) בוצע קרוב מדי לקו המשווה של עיינית, רקמת רשתית תהיה גם קרוב הווה אל החתך. היזהר אז שלא לפגוע ברשתית בשלב 3.8.
8. תפוס את בלובן העין עם מלקחיים ובזהירות לקרוע את הרקמה בנפרד. זה חיוני שלא לקרוע את הרשתית במהלך שלב זה. במידת הצורך, לנתק את הרשתית מן serrata אורה ידי מייצבת החלק scleral של הרקמה עם מלקחיים ובזהירות קילוף הרשתית עם מלקחיים אחרות. שמור המלקחיים סגורים; מעולם להתמודד מחדשטינה עם מלקחיים מאז הרקמה היא רכות מאוד תיתן לדרך מייד.
   הערה: בשלב זה, הרשתית ושאר עיינית יחוברו רק בראש עצב הראייה.
9. חותך את האתר המצורף בראש עצב הראייה עם מספרי האביב. הרשתית צריכה עכשיו להיות צפה בחופשיות כמקשה אחת של רקמות בינוניות 'איימס.
10. חותכים את הרשתית לתוך 4 - 6 מלבנים קטנים של כ 23 מ"מ באמצעות סכין אזמל מעוקל על ידי החזקת הרשתית בשולי עם מלקחיים, כדי לתפעל אותו למקומו. הימנע צובט את רקמת הרשתית בתוך המלבנים. קח חתיכות מן החלקים המרכזיים של הרשתית, לא בפריפריה הרחוקה.
11. העבר חתיכות רשתית עם פיפטה פסטר פלסטיק בקוטר גדול כדי בצלחת פטרי פלסטיק 35 מ"מ, החלק התחתון של אשר הוחלף על ידי רשת עם גודל הרשת פחות מ -1 מ"מ. תקן את צלחת פטרי בתוך השליש העליון של בקבוק בכוס או חרוטים לצלול חתיכות רשתית bu הבינוני 'איימסbbled עם carbogen.

Embedding 4. רשתית חתיכות Agarose

1. להעביר בזהירות 2 - 3 חתיכות רשתית לתוך צלחת 35 מ"מ פטרי מפלסטיק יחד עם כמה מן הבינוני 'איימס. זה הכי נוח להשתמש פיפטה פסטר מפלסטיק בקוטר גדול עבור ההעברה. בשלב זה, את הכיוון המדויק של חתיכות ברשתית לא משנה.
2. סר ככל האפשר של בינוני 'הנותר איימס עם פיפטה פסטר זכוכית. ברגע הנוזל הוסר להמשיך בשלב 4.3. אל תתנו יבש רקמת הרשתית.
3. מיד לכסות חתיכות רשתית עם 2 מ"ל של מומס agarose (37 מעלות צלזיוס). בהתחשב בגודל שצוין בשלב 3.10, החלקים לא להתכרבל בתוך agarose.
4. בתוך agarose הנוזל, בעדינות לדחוף חתיכות ברשתית אל החלק התחתון של צלחת פטרי. שכבת תא גנגליון צריכה לפנות כלפי מטה. שימוש במיקרוסקופ סטריאו לשיפוט של מיקום מדויק. עבור מיצוב, להתמודד pi רשתיתeces עם מרית קטנה. מקם את הרשתית מהר ומדויק ככל האפשר מאז agarose יהיה לגבש במהירות.
   1. מסדרים חתיכות רשתית במקביל לחלק התחתון של המנה זכוכית; סעיפים אחרים יהיו משיקים או אלכסוני. יצירות בודדות לא צריכות לגעת זה בזה, אך גם לא צריך להיות יותר מדי רחוק אחד מהשני. נסה להניח את חלקי רשתית פחות או יותר על אותה הרמה אופקית.
5. שים בצלחת פטרי זכוכית עם חתיכות רשתית מוטבעות לתוך המקרר (4 - C ° 6) עבור 2 דקות לפחות. זה יקשיח את agarose במהירות לעיבוד נוסף. ברגע agarose יש polymerized להמשיך לשלב הבא.

שמת 5. הרשתית Pieces

1. מוציאים בזהירות את גוש agarose המכיל חתיכות רשתית מצלחת פטרי. השתמש מרית או מכשיר דומה כדי להרים את הגלגלת agarose ממשטח הזכוכית. בשל כוחות דבקים, זה יכול להתברר די קשה. עם זאת, למנוע שבירלחסום agarose. לבצע זאת וכל השלבים הבאים בטמפרטורת החדר.
2. מניחים את גוש agarose על coverslip זכוכית ולהתאים את גודל עם להב סכין המנתחים. השאר 1 - 2 מ"מ של agarose בכל צד של חתיכות רשתית. הגודל הסופי של הבלוק צריך להיות סביב 1,066 מ"מ (10 מ"מ מתייחס לגובה של הבלוק, 6 מ"מ עד אורך קצה שלה).
3. מדביק את בלוק agarose לבעל הדגימה של vibratome באמצעות דבק מיידי. חתיכות רשתית צריכות להיות ממוקמות בחלק העליון של הבלוק הגבוה 10 מ"מימ ו מכוון במקביל פני השטח שלו, בעוד שחלק התחתון מודבק לבעל.
4. מכסה את הבלוק מייד על ידי מזיגה הבינונית בעבר המבעבע 'איימס למגש החיץ של vibratome.

6. הכנת הסעיפים האופקית Vibratome

1. התחל חתך. בתחילה להגדיר את העובי של חיתוך ידני עד שברי רקמת רשתית מופיעים הפרוס. ואז לשנות את ההגדרות בשלב 2.3. מאזרשתית העכבר היא רק כ -200 מיקרומטר עבה, לא תהיינה יותר מ 2 - 3 פרוסות לכל בלוק agarose.
2. הסר סעיפים ממגש חיץ עם מוט זכוכית ולהעבירם 2 מ"ל בינוני 'איימס בצלחת פטרי 35 מ"מ.
3. חנות חלקים מיד באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס (5% CO _2/55% O _2). את agarose המקיף את החלקים יישאר מוצק בחממה והוא יכול לשמש כדי להתמודד עם החלקים ללא פגיעה ברשתית. איכות פרוסת Better מתקבלת בעת אחסון על 37 מעלות צלזיוס בתוך האטמוספרה בהתאמה לעומת הבינוני 'מחומצן איימס ב RT. סעיפים ניתן להשתמש מיד או ניתן לאחסן עד 4 שעות בחממה עם תוצאות פיזיולוגיות טוב.
4. שבץ חתיכות רשתית הבאות בסעיפי agarose וחזור 4 - 6.

תוצאות

ב פרוסות אופקיות של רשתית העכבר, גופי תא אופקיים ניתן היו לזהות בקלות על פי המורפולוגיה הייחודית שלהם עם מספר דנדריטים העיקרי העולה מתוך (איור 1 א) גוף תא מצולעים. גופי התא האופקיים סמוך לפני השטח של הפרוסה היו נגישים באופן שגרתי עבור אלקטרודות מהדק תיקון. במהלך הקלטות, תאים היו מלאים צבע פלואורסצנטי, חושף arborization הדנדריטים שלהם המורכב, שדמה את המורפולוגיה של תאים אופקיים נושאות האקסון של רשתית העכבר השלמה

דיון

בניגוד פרוסות אנכיות, את המורפולוגיה הדנדריטים של נוירונים אורינטציה רדיאלית כמו תאים אופקיים ותאי amacrine נשמרה היטב. לעומת הכנות רשתית כולה, סוגי התאים אלה נגישים בקלות עבור microelectrodes ויכולים להיחקר על ידי שני טכניקות אלקטרו והדמיה. כאן, התמקדנו הרשתית החיצונית; עם זאת, גישה דומה דווחה במיוחד עבור תאי amacrine של הרשתית הפנימית ^10.

המאפיינים של הכנת החתך האופקית יש כמה השלכו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
איימס	סיגמא	A1420
נתרן ביקרבונט	סיגמא	S5761
Hepes	Sigma	H3375
קרבוגן	אוויר נוזלי
אגרוז	סיגמא	A9045
צלחת פטרי 35 מ"מ (פלסטיק)	Nunc Thermofisher	150318
זכוכית פטרי צלחת	Chemoline	50-1470-40
Isoflurane	Dispensary בית חולים
להב מזרק Vibratome	Biosystems	39053250
Vibratome	Leica Microsystems	VT1200
Vibrocheck	Leica Microsystems
אמבט מים למיקרוגל
מלקחיים
20 גרם מחטים
מספריים
להבי
מיקרוסקופ
פסטר פיפטה
זכוכית פסטר פיפטה

בינוני אוניברסיטאיאביבייםאזמל מעוקליםסטריאו פלסטיק