הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

6.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55183

⸱

9 בפברואר 2017

 ,  , 
1Biomedical Engineering, Tulane University

במאמר זה

סיכום

אנגיוגנזה כוללת אינטראקציות רב-תאיות ורב-מערכתיות שיש לחקור בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. מטרת מחקר זה היא להדגים את יכולתו של מודל תרבית המזנטריה של חולדות לבצע השוואות זמן-lapse של רשתות מיקרו-וסקולריות שלמות במהלך אנגיוגנזה.

תקציר

אנגיוגנזה, כהגדרתו צמיחה של כלי דם חדשים מכלי קיימים, כרוך לתאי אנדותל, pericytes, ותאי שריר חלק, תאי מערכת החיסון, ואת התיאום עם כלי הלימפה והעצבים. המולטי-התא, אינטראקציות רבות מערכתיות מחייבות חקירת אנגיוגנזה בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. וכך, בעוד השימוש במודלים תרבית תאים במבחנה סיפקו תובנות מכניסטית, ביקורת נפוצה היא כי הם לא לשחזר את המורכבות הקשורה רשת כלי הדם. מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את היכולת לערוך השוואות זמן לשגות של רשתות כלי הדם ללא פגע לפני ואחרי גירוי אנגיוגנזה ברקמות לפדר עכברוש תרבותי. רקמות בתרבית מכילות רשתות כלי דם מקיים ההיררכיה שלהם. תיוג immunohistochemical מאשרת את נוכחותו של תאי אנדותל, תאי שריר חלק, pericytes, כלי הדם וכלי הלימפה. בddition, תיוג רקמות עם BSI-לקטינים מאפשר השוואת הזמן לשגות של אזורי רשת המקומיים לפני ואחרי הגירוי גורם בסרום או צמיחה מאופיינת הנבטה וצפיפות כלי נימים מוגברות. לשם השוואה למודלי תרבית תאים נפוצים, שיטה זו מספקת כלי ללימודי שושלת תא האנדותל וערכת תרופת angiogenic רקמות ספציפית ברשתות כלי דם רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית.

מבוא

צמיחת שיפוץ רשת כלי דם הם מכנים משותפים לתפקוד רקמות, ריפוי פצעים, ו פתולוגיות מרובות תהליך מפתח הוא אנגיוגנזה, כהגדרתו הצמיחה של כלי דם חדשים קיימים 1, 2. עבור הנדסת רקמות כלי דם חדש או בעיצוב טיפולים מבוססים angiogenic, הבנת חשיבות הדינמיקה הסלולר המעורבת אנגיוגנזה הוא קריטי. עם זאת, תהליך זה הוא מורכב. זה יכול להשתנות במקומות ספציפיים בתוך רשת כלי דם וכרוך סוגי תאים מרובים (כלומר תאי אנדותל, תאי שריר חלק, pericytes, מקרופאגים, תאי גזע) ומערכות מרובות (רשתות לימפטי רשתות עצביות). למרות מודלים במבחנה תרמו מאוד כדי לבדוק את הקשר בין תאים שונים המעורבים אנגיוגנזה 3, הרלוונטי הפיזיולוגית שלהם יכול להתערער בשל thei r מורכבות מוגבלות ואת העובדה שהם מקרוב אינם משקפים תרחיש vivo. כדי להתגבר על המגבלות האלה, מערכות תרבות תלת מימדי 3, לשעבר vivo מודלים רקמות 4, מערכות microfluidic 5, 6, ו מודלים חישוביים 7 פותחו שהונהגה בשנים האחרונות. עם זאת, יש עדיין צורך מודל עם יכולת הזמן לשגות לחקור אנגיוגנזה ברשתות פגעו כלי דם vivo לשעבר. הקמת מודלים חדשים זמן לשגות ללימודי אנגיוגנזה עם כי רמת המורכבות תספק כלי רב ערך כדי להבין את המנגנונים המסדירים אנגיוגנזה לשפר טיפולים.

מודל פוטנציאלי המאפשר חקירת vivo לשעבר של אנגיוגנזה ברחבי רשת כלי דם ללא פגע הוא מודל התרבות לפדר עכברוש> 8. בשנים אחרונה עבודה, אנחנו הוכחנו כי דם ורשתות כלי דם הלימפה להישאר קיימא אחרי התרבות. יתרה מכך, מודל תרבות העכברוש לפדר יכול לשמש כדי לחקור אינטראקציות תא פונקציונליות-אנדותל pericyte, דם וקשרי תא האנדותל הלימפה, הזמן לשגות הדמיה. מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול שלנו שיטת הדמיה זמן לשגות. תוצאות הנציג שלנו לתעד את סוגי התאים המרובים שנותרו קיימא לאחר הגירוי של אנגיוגנזה עם סרום ולהציע דוגמאות לשימוש בשיטה זו לכימות תגובות angiogenic רקמות ספציפיות, כמו גם מחקרי מעקב תא האנדותל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים ואת ההליכים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת טוליין ועדת שימוש (IACUC).

1. הגדרת הליך כירורגי

  1. מכשירי חיטוי, ציוד כירורגי, ואספקת התרבות לפני הניתוח. חומרי מתכלים כירורגיים לכל חולדה כוללים: 1 וילון, 1 וילון עם חור חתוך מראש (0.5 x 1.5 ב) במרכז, פדי גזה, ו -1 underpad סופג. מכשירי ניתוח כוללים: 1 אזמל עם להב מספר 10, 2 זוגות של פינצטה, וזוג מספריים בסדר. אספקת תרבות כוללת: 1 וילון, 1 פינצטה, ומכין מוסיף 6-גם צלחת עם מסנני פוליקרבונט.
  2. לעקר פלטפורמת פרספקס, במה כירורגי ומרחב המעבדתיים כירורגית עם אתנול 70%. שמור על הבמה כירורגי בקערה סטרילי עד השימוש.
    1. צור הבמה כירורגי באמצעות קידוח של כ 2 ב -1 ב חור במרכז של צלחת תרבות 100 מ"מ. לאחר מכן, השתמש נייר זכוכית כדי להחליקכל קצוות חדים ולהוסיף שכבה של דבק סיליקון אל הקצוות של החור כדי ליצור משטח מוגבה עבור הרקמות.
    2. לחלופין, לעצב את הבמה כירורגי באמצעות תוכנת CAD ולהפוך ידי הדפסת 3-D (איור 1).
  3. מניחים underpad סופג סטרילית ושכב פלטפורמה פרספקס על גבי זה. מניח את הווילון, ללא חור חתוך מראש, על משטח לוהט ליד underpad סופג.
  4. פוספט שנאגר תמיסת מלח סטרילית טרום חם (PBS), מדיה מלוחה עד 37 מעלות צלזיוס. מדיה פלייס PBS במנות תרבות נפרדת על גבי כרית חימום ו מלוחים ומכניסים צינור חרוטי 50 מ"ל ליד ההתקנה כירורגית.
  5. ודא כל החבילות נפתחות לפני תחילת הניתוח כדי להבטיח טיפול סטרילי של כל החומרים. רשימה מלאה של הכלים הנפוצים המשמשים בהליך זה מפורט טבלת חומרים וכלים כירורגיים ספציפיים.

2. Mesenterקציר רקמות y

  1. השתמש חולדות Wistar זכר בוגר (350 ± 25 גרם; 6 - 8 שבועות של גיל). זנים אחרים וגילים של חולדות ניתן להחליף.
  2. להרדים חולדה באמצעות זריקה תוך שרירית של קטמין (80 מ"ג / ק"ג משקל גוף) ו xylazine (8 מ"ג / ק"ג משקל גוף). אשר את החולדה היא בהרדמה ידי צובט בין האצבעות כדי לבדוק לתגובה רפלקס; שם צריך להיות אף אחד. שיכוך כאבים מנעו עבור הליך מסוף זה לא הכרחי.
  3. לגלח את אזור הבטן ולהסיר שיער הנותרים באמצעות קרם להסרת שיער. נגב עור הבטן פעמיים עם אלכוהול איזופרופיל 70% ואחריו יוד povidone. עבור המגבונים שהמנתח צריך להתחיל במרכז של האתר כירורגית ולעבור מחוץ לאזור המוכן באופן מעגלי שלא חופף באזורים קרצפו בעבר עם אותה פיסת גזה סטרילי או מקלון צמר גפן סטרילי. ואז להעביר חית התקנת ניתוח סטרילי ולמקם גבי plat פרספקסטופס.
  4. באמצעות סכין אזמל, לבצע 0.75 ב - 1.25 ב חתך במעיים החל מיום 1 ב מתחת עצם החזה. היזהר שלא לנקב את המעי או לפדר (1 שכבת העור, 1 שכבה של רקמת חיבור, ו -1 שכבת השריר).
  5. מניח וילון עם חור חתוך מראש על החתך ומניח במה כירורגי סטרילי על גבי הווילון. ודא מיישרת הפתיחה עם החתך. השתמש applicators כותנה שקצו סטרילי לאתר ולשלוף את המעי דרך הפתח הבמה כירורגי.
  6. משוך 6 - 8 חלונות mesenteric באמצעות לבמה בעזרת אזניים, ולהיזהר לא לגעת חלונות (איור 1). רקמות בדרך כלל נקצרות מאזור המעי של המעי הדק מתחיל ליד cecum. שמור חשוף רקמות לחות עם מלח סטרילית חימם לפי הצורך באמצעות מזרק סטרילי לטפטף הפתרון.
  7. להרדים את העכברוש באמצעות הזרקת intracardiac של נתרן pentobarbital (0.2 מ"ל לכל חולדה). לפני ההסרה ליחלונות senteric, להבטיח העכברוש הוא מורדם על ידי מישוש הלב; לא אמור להיות שום דופק.
  8. הסר רקמות לפדר רצויות באמצעות פינצטה לתפוס את כרית השומן ומספריים בסדר לחתוך את החלון. השאר גבול של שומן (2 מ"מ) סביב החלון. לשטוף רקמות פעם חימם PBS סטרילי ופעם התקשורת.
  9. חזור מעי exteriorized אל חלל הבטן ולהיפטר מן החי על פי הנחיות מוסדיות.

3. תרבות רקמות לפדר ללימודים זמן לשגות

  1. אספקת העברת תרבות autoclaved (ראה סעיף 1.1) ורקמות כדי ברדס זרימה למינרית סטרילי.
  2. להשתמש בפינצטה כדי להעביר את כל רקמות על גבי קרום מסנן פוליקרבונט. רקמות תפוס על ידי כרית שומן כדי למנוע נזק בכלי הדם.
  3. במהירות להפיץ את הרקמות באמצעות כרית השומן, נזהר שלא לגעת החלון. הפוך את הכנס עם רקמה לתוך החלק התחתון של צלחת 6-היטב ומכסים 3 מ"ל של התקשורת (איור 1 ). תקשורת אופיינית בשימוש לצורך הליך זה כוללת מדיה Essential Minimum (ממ) עם 1% פניצילין סטרפטומיצין (PenStrep) ו -10% עובריים שור סרום (FBS). מדיה זו יכולה להיות מלווה סרומים אחרים ו / או גורמי גדילה כדי לעורר אנגיוגנזה.
  4. חזור על שלבי 3.2 - 3.3 כל רקמות ותרבות בתנאי חממה סטנדרטיות (5% CO 2, 37 מעלות צלזיוס) במשך עד 5 ימים.

4. זמן לשגות הדמיה של רקמות לפדר

  1. ביום ההדמיה, להשלים את התקשורת בכל טוב עם מצומדות BSI-לקטיני דגירה בתנאי תרבות סטנדרטיים למשך 30 דקות. לשטוף רקמות פעמים עם תקשורת לקטינים ללא. BSI-לקטינים הכתם יישאר גלוי על הרקמה לפדר עד 3 ימים בתרבות.
  2. מעביר את הצלחת על במת מיקרוסקופ. זיהוי כלי הדם הלימפה מבוסס על מבנה המורפולוגיה שלהם ברשת.
  3. אתר אזור רשת רצוי על כל רקמות לקחת תמונות. כדאי לשים לב במיוחד ההדמיהמיקום מנת להבטיח את אותה באזור יהיה בשבי עבור תמונות עוקבות. אם באמצעות במה ממונעת, לתעד את הקואורדינטות.
  4. חזור רקמות אל האינקובטור ולהמשיך תרבות עד לנקודת הסיום הרצויה. חזור על צעדי 4.1 - 4.3 דרוש תלוי בנקודות זמן ניסוי רצויות.

5. רקמות immunolabeling

  1. תיוג BSI-לקטינים
    1. דגירה הרקמות למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס 1:40 לקטינים FITC- מצומדות בתקשורת (פתרון נוגדנים 2.5 מ"ל לכל היטב צלחת 6-באר) ואחריו שני שטיפות עם התקשורת. עבור שטיפות, להוסיף מדיה ומיד להחליף.
  2. תיוג Live / Dead
    1. דגירה רקמות במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 1: 500 homodimer-1 ethidium 2 מ"מ ו 1: AM calcein 500 1 מ"מ בתקשורת (פתרון נוגדנים 2.5 מ"ל לכל היטב צלחת 6-באר) ואחריו שני שטיפות עם התקשורת.
  3. BSI-לקטינים / תיוג NG2
    1. רקמות מורח על מיקרוסקופ החליקודואר (1 - 2 רקמות / שקופית) ולאפשר לו להתייבש. הסר עודף שומן עם אזמל ידי לחיצה איתנה מטה שיחתוך את השומן.
    2. תקן רקמות מתנול קר במשך 30 דקות ב -20 מעלות צלזיוס. לשטוף רקמות עם PBS (3 x 10 דקות).
    3. תיוג נוגדן ראשוני דגירה רקמות 1 שעות בטמפרטורת החדר עם 1: נוגדן 100 ארנב polyclonal NG2 ו -5% בסרום עז נורמלי (NGS). לשטוף רקמות עם PBS (3 x 10 דקות).
    4. תיוג נוגדנים משני דגירה רקמות 1 שעות בטמפרטורת החדר עם 1: 100 נוגדן נגד ארנב עז Cy2 מצומדות (GAR-Cy2) ו -5% NGS. לשטוף רקמות עם PBS (3 x 10 דקות).
    5. דגירה הרקמות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר 1:40 לקטינים FITC- מצומדות ב PBS ואחריו שני שטיפות עם PBS. עבור שטיפות, להוסיף PBS ומיד להחליף.
    6. כדי לעגן את השקופיות, לכסות רקמות עם 50:50 PBS פתרון גליצרול coverslip מקום על גבי. חותם את הקצוות שקופית באמצעות לק.
  4. LYVE-1 / תיוג PECAM
    1. מורחים רקמות על שקופיות מיקרוסקופ (1 - 2 רקמות / שקופית) ולאפשר לו להתייבש. הסר עודף שומן עם אזמל ידי לחיצה איתנה מטה שיחתוך את השומן.
    2. תקן רקמות מתנול קר במשך 30 דקות ב -20 מעלות צלזיוס. לשטוף רקמות עם saponin PBS + 0.1% (3 x 10 דקות).
    3. תיוג נוגדן ראשוני דגירה רקמות 1 שעות בטמפרטורת החדר עם 1: 200 עכבר נוגדנים CD31 biotinylated חד שבטיים ו 1: 100 ארנב polyclonal נוגדן LYVE-1 ב PBS + 0.1% saponin + 2% אלבומין בסרום שור (BSA) + 5% NGS . לשטוף רקמות עם saponin PBS + 0.1% (3 x 10 דקות).
    4. תיוג נוגדנים משני, דגירה רקמות 1 שעות בטמפרטורת החדר עם 1: 500 נוגדן streptavidin CY3 מצומדות ו 1: 100-Cy2 GAR ב PBS + 0.1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. לשטוף רקמות עם saponin PBS + 0.1% (3 x 10 דקות).
    5. כדי להרכיב שקופיות, רקמות כיסוי עם 50:50 PBS פתרון גליצרול במקום coverslip על גבי. חותם את הקצוות שקופית באמצעות לק.
  5. BrdU / BSI-לקטינים תיוג
    1. הוסף 1 מ"ג / מ"ל ​​BrdU למדיה ולהחליף התקשורת רקמות עם פתרון BrdU. דגירה של 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
    2. מורחים רקמות על שקופיות מיקרוסקופ (1 - 2 רקמות / שקופית) ולאפשר לו להתייבש. הסר עודף שומן עם אזמל ידי לחיצה איתנה מטה שיחתוך את השומן.
    3. תקן רקמות מתנול קר במשך 30 דקות ב -20 מעלות צלזיוס. לשטוף רקמות עם PBS (3 x 10 דקות).
    4. לפגל DNA רקמה 2 M HCl עבור h 1 ב 37 מעלות צלזיוס. לשטוף רקמות saponin PBS + 0.1% (3 x 10 דקות).
    5. תיוג נוגדן ראשוני, דגירה רקמות 1 שעות בטמפרטורת החדר עם 1: 100 העכבר חד שבטיים אנטי BrdU ב PBS + 0.1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. לשטוף רקמות עם saponin PBS + 0.1% (3 x 10 דקות).
    6. תיוג נוגדנים משני, דגירה רקמות 1 שעות בטמפרטורת החדר עם 1: 100 עיזים אנטי עכבר נוגדנים Cy3 מצומדות (GAM-Cy3) ב- PBS + 0.1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. לשטוף רקמות עם saponin PBS + 0.1% (3 x 10 דקות).
    7. דגירה רקמות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר 1:40 לקטינים FITC- מצומדות ב PBS ואחריו שני שטיפות עם PBS.
    8. כדי להרכיב שקופיות, רקמות כיסוי עם 50:50 PBS פתרון גליצרול coverslip מקום על גבי. חותם את הקצוות שקופית באמצעות לק.
  6. BSI-לקטינים / תיוג CD11b
    1. מורחים רקמות על שקופיות מיקרוסקופ (1 - 2 רקמות / שקופית) ולאפשר לו להתייבש. הסר עודף שומן עם אזמל ידי לחיצה איתנה מטה שיחתוך את השומן.
    2. תקן רקמות מתנול קר במשך 30 דקות ב -20 מעלות צלזיוס. לשטוף רקמות עם saponin PBS + 0.1% (3 x 10 דקות).
    3. תיוג נוגדן ראשוני דגירה רקמות 1 שעות בטמפרטורת החדר עם 1: 100 CD11b אנטי עכברוש העכבר ב PBS + 0.1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. לשטוף רקמות עם saponin PBS + 0.1% (3 x 10 דקות).
    4. תיוג נוגדנים משני דגירה רקמות 1 שעות בטמפרטורת החדר עם 1: 100 GAM-Cy3 ב PBS + 0.1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. לשטוף רקמות עם PBSעלייה של 0.1% saponin (3 x 10 דקות).
    5. דגירה הרקמות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר 1:40 לקטינים FITC- מצומדות ב PBS ואחריו שני שטיפות עם PBS.
    6. כדי להרכיב שקופיות, רקמות כיסוי עם 50:50 PBS פתרון גליצרול coverslip מקום על גבי. חותם את הקצוות שקופית באמצעות לק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לאחר 3 ימים בתרבות, רקמות תויגו עם ערכת cytotoxicity חי / מת הכדאיות / כדי להוכיח את הכדאיות של microvasculature במודל תרבות עכברוש לפדר (איור 2 א). רוב התאים הנמצאים לפדר נשארים קיימא בתרבות שבה תאי אנדותל זוהה על סמך המיקום שלהם במגזרי כלי דם. התפשטות תאים האנדותל גם אושרה על ידי תיוג לקטינים / BrdU (איור 2 ד). תא שריר חלק ונוכחות pericyte לאורך כלי אושרה עם תיוג NG2 (איור 2 ב). תיוג עבור LYVE1 ו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתעד שיטה לשימוש במודל תרבות עכברוש לפדר ככלי vivo לשעבר הדמיה זמן לשגות של צמיחה רשת כלי הדם. עבודה קודמת שנערכו במעבדה שלנו הקימה את השימוש במודל שלנו עבור 1) אנגיוגנזה 8, 2) lymphangiogenesis 8, 3) אינטראקציות תא pericyte-אנדותל 8, ו -4) תרופה אנטי-אנגיוגנזה בדיקות 9. יכולת הדמית רקמות לפדר עכברוש תרבותיים בנקודות זמן מרובות מציעה assay כמוני להערכת תגובות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק 5-P20GM103629 ל-WLM ולמרכז טוליין להזדקנות. ברצוננו להודות למתיו נייס על עזרתו בעריכת טקסט הפרוטוקול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
וילונותקרדינל בריאות401212 אינץ' x 12 אינץ' Bio-Shield עיקור רגיל עוטף
ידית אזמלמכשיר כירורגי RobozRS-9843ידית אזמל, #3; מוצק;
להב כירורגי סטריליסינסינטי כירורגי0110נירוסטה; גודל 10
צלחת תרבות (60 מ"מ)Thermo Scientific13018110/שרוול
מלקחיים Graefe (פינצטה מעוקלת)מכשיר כירורגי RobozRS-5135מיקרו מלקחיים; משונן; עקומה קלה; רוחב קצה 0.8 מ"מ; מלקחיים באורך 4 אינץ'
(פינצטה ישרה)מכשיר כירורגי RobozRS-5130מיקרו מלקחיים; משונן, ישר; רוחב קצה 0.8 מ"מ; 4 אינץ'
אורך Noyes מיקרו מספרייםRoboz מכשיר כירורגיRS-5677Noyes מספריים קפיציים לניתוח;
נקודות ישרות, חדות-קהות; קצה חיתוך 13 מ"מ; רוחב קצה 0.25 מ"מ, 4 1/2 אינץ'
רפידות גזהFisherBrand13-761-52ספוגי גזה כותנה לא סטריליים; 4 אינץ' x 4 אינץ' 12 שכבות
כותנה אפליקטוריםFisherBrand23-400-124אורך 6 אינץ'; פיר עץ; שימוש חד פעמי רק
6 בארות צלחתפישר סיינטיפיק08-772-49תחתית שטוחה עם מכסה אידוי נמוך; פוליסטירן; מזרק סטרילי לא פירוגני
5 מ"לפישר סיינטיפיק14-829-45Luer-Lok Tip
קערה סטריליתתעשיות פעולה רפואית בע"מ0123232 אונקיות נרתיק קליפה; כחול; תוספות צלחת סטריליות לשימוש חד פעמי
6 בארות (מוסיף CellCrown)SIGMAZ681792-3EAמוסיף צלחת 6 בארות;
קרום מסנן פוליקרבונטSIGMATMTP04700מסנן קרום איזופור; פוליקרבונט; הידרופילי; 5.0  ומיקרו; מ', 47  mm, לבן פשוט<
חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות/תיאור
BeuthanasiaSchering-Plough Animal Health Corp. Union (הוזמן מ-MWI Veterinary Supply)MWI #: 011168מרכיב פעיל: לכל 100 מ"ל, 390 מ"ג נתרן פנטוברביטל, 50 מ"ג פניטואין נתרן 
קטמיןפורט דודג' בריאות בעלי חיים (הוזמן מ-MWI Veterinary Supply)MWI #: 000680Kateset 100 מ"ג/מ"ל
XylazineLLOYD. Inc. (הוזמן מ-MWI Veterinary Supply)MWI #: 000680Anased 100 מ"ג/מ"ל
מי מלחבקסטר2F7122
PBSInvitrogen14040-133
MEMInvitrogen11095080
PenStrepInvitrogen15140-122
FBSInvitrogen16000-044
BSAJackson ImmunoResearch001-000-162
Saponin SIGMAS7900-100G
איזופרופיל אלכוהולפישר סיינטיפיקS25372
פובידון-יודאופרנד82-226
חומצה הידרוכלוריתSIGMA320331
מתנולפישר סיינטיפיק67-56-1
גליצרולפישר סיינטיפיק56-81-5
מצומד FITC לקטיןSIGMAL9381-2MG
אנטי-NG2 כונדרויטין סולפט נוגדן פרוטאוגליקןSIGMAAB5320
PECAM (CD31) נוגדןBD Biosciences555026
LYVE-1 נוגדןAngioBio Co.11-034
נוגדן מצומד נגד ארנב Cy2 עיזיםImmunoResearch111-585-144
נוגדן מצומד נגד עכבר Cy3 עיזוןImmunoResearch115-227-003
נוגדן מצומד סטרפטווידין Cy3Jackson ImmunoResearch016-160-084
ערכת חיות/ציטוטוקסיות חיה/מתהInvitrogenL3224
סרום עיזים רגיל Jackson ImmunoResearch005-000-121
5-Bromo-2'-DeoxyuridineSIGMAB5002
עכבר חד-שבטי אנטי-ברומודוקסיורידין                                              שיבוט Bu20aDakoM074401-8
עכבר נגד חולדות CD11b AbD SerotecMCA275R
באורך 4 אינץ' באורך כולל לא סטרילי Jackson

מקורות

  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).
  2. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
  3. Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress. Cell Mol Bioeng. 4 (4), 547-559 (2011).
  4. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).
  5. Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15342-15347 (2011).
  6. Chan, J. M., et al. Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting. PLoS One. 7 (12), e50582(2012).
  7. Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis. Curr Opin Hematol. 19 (3), 184-191 (2012).
  8. Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H235-H245 (2013).
  9. Azimi, M. S., et al. An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks. PLoS One. 10 (3), e0119227(2015).
  10. Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab Invest. 63 (1), 115-122 (1990).
  11. Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels. Front Cell Dev Biol. 3, 52(2015).
  12. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat Protoc. 5 (10), 1659-1665 (2010).
  13. Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2347-2355 (2010).
  14. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
  15. Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks. Front Physiol. 4, 108(2013).
  16. Kelly-Goss, M. R., et al. Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth. BMC Physiol. 12, 7(2012).
  17. Skalak, T. C., Price, R. J. The role of mechanical stresses in microvascular remodeling. Microcirculation. 3 (2), 143-165 (1996).
  18. Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival. J Cell Physiol. 212 (1), 244-251 (2007).
  19. Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo. Microcirculation. 8 (4), 229-241 (2001).
  20. Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis. Microcirculation. 23 (2), 95-121 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Ex VivoBSI
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.