מאמר שיטה

תא דם אדום פשוט שיטת תמוגה להקמת שורות תאי B Lymphoblastoid

DOI:

10.3791/55191

⸱

14 בינואר 2017

 ,  , 
1Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, 2Genetic Resources Center, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטת תמוגה תאי דם אדומה פשוט לצורך ביסוס B-LCLS פותחה עם יעילות גבוהה הנצחה, מחייב כמות קטנה של דם חיסכון בזמן מן החניכה cryopreservation.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קיימות מספר שיטות להפיכת לימפוציטים מסוג B על ידי נגיף אפשטיין בר במבחנה לשורות תאים אימורטליות. פיתחנו שיטה חדשה עם אסטרטגיה עוצמתית ופשוטה להקמת B-CL, שיטת הליזיס של כדוריות הדם האדומות. שיטה זו פשטה את הליך ההפרדה של PBMC עם הסרת כדוריות דם אדומות, והשתמשה ב-0.5 מ"ל של דם מלא לביסוס קווי תאים אימורטליים של EBV, שיכולים להתרבות למספר תאים גדול בפרק זמן קצר יחסית עם שיעור הצלחה של 100%. השיטה פשוטה, אמינה, חוסכת זמן וישימה לטיפול במספר רב של דגימות קליניות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי B במנוחה יכולים להפוך על ידי נגיף אפשטיין-בר (EBV) במבחנה לשורות תאי לימפובלסטואיד B המתרבים באופן פעיל (B-LCLs). B-LCLs דומים לתאי נבט בהתמיינות ובהתפתחות, ושיעור המוטציות הסומטיות של B-LCLS היה רק 0.3%1, עם שינוי גנטי ופנוטיפי זניח. לכן, B-LCLs, כתחליפים לתאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs), האיצו באופן משמעותי את התקדמות מחקר הגנומיקה, הטרנסקריפטומיקה והפרוטאומיקה של מחלות הקשורות ל-EBV2,3. יתר על כן, ל-B-LCLs יש גם יישום חשוב בבדיקת נוגדנים חד-שבטיים4,5.

פותחו מספר שיטות לאימורטליזציה של לימפוציטים מסוג B על ידי EBV. ההליכים הנפוצים העיקריים כוללים בידוד של לימפוציטים מסוג B ושימוש בשורות תאי B95-8 לייצור EBV זיהומי. מבידוד לטרנספורמציה, שיטות אלה מחולקות לשלוש אסטרטגיות. לימפוציטים מופרדים מדם טרי על ידי צנטריפוגה של שיפוע צפיפות וטרנספורמציה של EBV ישירות6-8, המכונה שיטת הפרדת שיפוע צפיפות במחקר זה. עם זאת, טכניקות אחרות מתגברות על הקושי בהעברת דם טרי ומשתמשות בהליך להקפאת לימפוציטים מטוהרים ולאחר מכן הפשרה וזיהום EBV9-11. דם מלא שמור בהקפאה יכול לשמש גם לבידוד של לימפוציטים B וטרנספורמציה12,13. בנוסף לצנטריפוגה של שיפוע צפיפות להפרדת לימפוציטים B, חלק מהחוקרים משתמשים במיון תאים מגנטיים כדי לבחור לימפוציטים B12. עם זאת, הפרדה מגנטית היא תהליך יקר, מורכב וגוזל זמן. למרות ששיטות אלו שימושיות להנצחת לימפוציטים מסוג B עם אחוזי הצלחה גבוהים, הצורך לטפל במספר רב של דגימות קליניות ונפח הדם הקטן יחסית דורשים שיטה פשוטה יותר להקמת קו תאים קבוע.

שיטה נוספת פחות נפוצה היא שימוש בדם מלא כמקור לתאים גרעיניים לזיהום EBV והקמת B-LCL. שיטות אלו מפשטות את הטכניקה על ידי השמטת הליך ההפרדה. רק כמות קטנה של דם מלא,טרי 14 או קפוא15,16, מספיקה כדי להשיג את שורות התאים. למרבה הצער, יש שונות גדולה בהצלחה ממסמכים15,16 וכמה מבדיקות האימות שלנו. יתר על כן, מושבות שעברו טרנספורמציה כמעט ולא מזוהות במיקרוסקופ בגלל הזיהומים המזהמים הגדולים. לפיכך, נדרשת שיטה אמינה יותר לטרנספורמציה.

בהתבסס על השיקולים לעיל, פיתחנו שיטה חדשה להקמת B-LCLs ללא טיהור קודם של הלימפוציטים, הנקראת שיטת הליזיס של תאי הדם האדומים. שיטה זו נוחה, חוסכת זמן וישימה למספר רב של דגימות. רק 0.5 מ"ל של דם מלא הספיקו כדי להשיג B-LCLs שניתן להשיג בקלות מתינוקות וקשישים מבלי לפגוע משמעותית בבריאותם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של לשכת גנטיקה וביולוגיה התפתחותית, ואת הפרוטוקול עוקב אחר ההנחיות המוסדיות על רווחת אדם.

1. הכנת וירוס EB

  1. ביום 1, להפשיר B95-8 תאים והתרבות 6 מ"ל להשלים RPMI 1640 בינוני, בתוספת 10% בסרום שור עוברית, 2 מ"מ L- גלוטמין, ואנטיביוטיקה (100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל, 100 פניצילין U / mL) בבית בקבוק תרבות T25. מניח את בקבוק התרבות ב- CO 2 באינקובטור 5% ב 37 מעלות צלזיוס.
  2. ביום 2, לשמור על מורפולוגיה התאים תחת מיקרוסקופ. תאים הם במצב טוב כשהם מוארים ועגולים. הוסף 10 מ"ל בינוני RPMI להשלים 1640.
  3. ביום 4, להוסיף 10 מ"ל בינוני טרי שלם RPMI 1640, ולאחר מכן להעביר בקבוק תרבות T75.
  4. ביום 8, להוסיף 20 מ"ל בינוני RPMI להשלים 1640.
  5. לשמור על התאים למשך 8 ימים מבלי להוסיף בינוני טרי, כלומר, רעב.
  6. ביום 16, להתבונן תאיםשנצפו תחת מיקרוסקופ. אוספים את התאים בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל, 12 מ"ל / צינור.
  7. קריו לשמר ב -80 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה, ולאחר מכן להפשיר במהירות על 37 מעלות צלזיוס. חזור 3 פעמים עד חלקיקי הנגיף משתחררים מהתאים.
  8. צנטריפוגה ב 240 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. סנן את supernatant באמצעות C 0.22 מיקרומטר מסנן, aliquot, 12 מ"ל / צינור, ולאחסן ב -80 °.

2. טיפול דם מלא עם הצפת תמוגה תא דם האדום

  1. הוסף 0.5 מ"ל דם מלא anticoagulated ידי EDTA · K 2 לצינור 15 מ"ל.
  2. שים 1 חיץ דם תא תמוגה אדום מ"ל (מסוננים לפי 0.22 מיקרומטר לסנן מופשר לטמפרטורת החדר לפני השימוש) אל הדם כולו ומערבבים היטב. מניחים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 4 דקות. לאחר מכן להוסיף 5 - 7 מ"ל 1x PBS במהירות התגובה להפסיק.
  3. צנטריפוגה ב 240 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. תאי דם לבנים יהיה להאיץ בתחתית של התחתית.
  4. בטל supernatant, ולשטוף את המשקעים על ידי הוספה בינונית בסיסי 7 מיליליטר 1640. צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 240 XG בטמפרטורת החדר. חזור פעמיים.
  5. Resuspend התא גלולה במדיום טרנספורמציה 300 μL (בינוני RPMI 1640, המכילה סרום שור העובר 20% ו -10 מיקרוגרם / מ"ל ​​phytohemagglutinin (PHA)).

3. EBV זיהום

  1. הוסף 60 μL של 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​ציקלוספורין A (CsA) על השעיית התא.
  2. במהירות להפשיר aliquot של EBV על 37 מעלות צלזיוס. להוסיף 240 μL EBV על השעיית התא.
  3. מערבבים היטב ומניחים ההשעיה תא לצלחת 96-היטב, 200 μL לכל טוב. כדי למנוע אידוי, להוסיף 200 μL 1x PBS לכל היטב סביב הצלחת 96-היטב. מניחים את הצלחת CO 2 באינקובטור 5% ב 37 מעלות צלזיוס.

4. הרחבה Cryopreservation של B-LCLS

  1. שנה וחצי של המדיום פעם בשבוע במשך החודש הראשון לאחר ההדבקה EBV. רק Laye עבהr של שברי תאים גלוי תחת מיקרוסקופ על יום 7 (איור 2). לאחר חודש אחד של זיהום EBV, אשכולות תא lymphoblastoid גלויים תחת שכבה עבה של שברי תאים מתחת למיקרוסקופ (איור 2).
  2. שנה וחצי של המדיום כל 3 ימים עד צבירי תאים גלויים לעין תחת מיקרוסקופ (איור 2). בדרך כלל, תהליך זה לוקח בין 10 ל -20 ימים.
  3. לאחר ערבוב, pipet התאים ולהעביר לצלחת 24 באר. להכפיל את נפח בינוני תרבות עם שלם RPMI 1640 בזמן שהוא הופך צהוב. תהליך זה תלוי בקצב צמיחת תאים.
  4. בהמשך לכך, ולהעביר את התאים בקבוק תרבות T25. להכפיל את נפח בינוני תרבות כפי שמתברר צהוב עד נפח בינוני מתרחב עד 10 - 15 מ"ל.
  5. שנה בינונית 24 שעות לפני ההקפאה. השעית תא צנטריפוגה במשך 5 דקות ב g 240 x. ספירת תאים עם דלפק תא ולהקפיא בצפיפות של 5 - 10 x 10 6 / מ"ל ב frפתרון המניות אוזן המכיל FBS 90% ו -10% dimethylsulfoxide (DMSO). להקפיא בשיעור של 1 ° C לדקה ל -80 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להעביר ישירות לתוך חנקן נוזלי.

5. 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-י.ל.) -2,5-diphenyl-tetrazolium ברומיד (MTT) Assay 17

  1. כן השעית תא בודד B-LCLS עם המדיום 1640 המכיל סרום שור העובר 10%. זרע 3 x 10 4 תאים לכל טוב על צלחת 96-היטב, 100 μL לכל טוב.
  2. מניח את הצלחת ב 5% CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12 - 16 שעות.
  3. להוסיף MTT (5 מ"ג / מ"ל) לבארות שבו תאים גדלים להתרחק אור עבור 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
  4. צלחת תא צנטריפוגה במשך 10 דקות ב g 168 x.
  5. הסר supernatant ולהוסיף 100 μL DMSO לכל טוב.
    הערה: תיזהר. אל תיגעו גבישי צבע דמוי מחט.
  6. לנער את הצלחת במשך 10 דקות במהירות נמוכה כדי לפזר את הגבישים לחלוטין.
  7. קליטה מדודה ב 570 ננומטר על ידיבאמצעות ספקטרופוטומטר microplate.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך התהליך של טרנספורמציה, השינויים המורפולוגיים של תאים הם דמיינו ידי מיקרוסקופ אור (איור 2). אשכולות קטנים של תאים נראו בבירור עם שיטת הפרדת שיפוע הצפיפות לאחר 7 ימים של זיהום, בעוד שרק שכבה עבה של שברי תאים גלויות משייט ימס דם אדום תא. עם זאת, צבירי תאי lymphoblastoid גלויים תחת השכבה העבה של שברי תאים 30 יום שלאחר זיהום. עם שינוי בינוני תכוף יותר, הירידות הפסולות תא ואת צבירי התאים גלויים לעין ולהציג אותה התמונה הוקמה בשיטת ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מדווחים על פיתוח של שיטה חדשה המנציחה תאי B האדם מן הדם כולו על ידי lysing כדוריות דם אדומות, ואת כדאיות התא שלה הוקמה ב-LCLS הוערכה על ידי assay MTT. התוצאות הראו כי כדאיות התא של B-LCLS הוקמה בשיטת תמוגה תא דם אדום הוא גבוה הרבה יותר מזה של שיטת ההפרדה שיפוע צפיפות. היתרון העיקרי של שיטת תמוגה תא דם אדום הוא שזה פשוט ודורש נפח קטן (קטן כמו 0.5 מיליליטר) של דם עבור הקמת קו תא קבע עם שיעור הצלחה גבוה כדאיויות תא גבוהות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הפרויקטים המרכזיים של האקדמיה הסינית למדעים (KFZD-SW-205), מערכת תמיכה טכנולוגית אסטרטגית של משאבים ביולוגיים של האקדמיה הסינית למדעים (CZBZX-1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צנטריפוגהTechcompCT6Tצנטריפוגה
מונה תאים אוטומטי קאונסטאר  IC 1000 לספירת תאים 
Epoch Microplate ספקטרופוטומטרBioTek מכשיריםSN263839למדידת הספיגה
96 באר אשכול תרבית תאיםקורנינג משולב3599לוחות פוליסטירן
24 אשכול תרבית תאיםבאר Corning Incorporated3524לוחות פוליסטירן
25 ס"מ2 בקבוק תרבית תאיםקן707001פוליסטירן& נ.ב.פ;
FBSGibco10270רכיב של B-LCLs בינוני
RPMI בינוני 1640Gibco31800-022עבור B-LCLs בינוני
L-Glutamine   אמרסקו0374רכיב של תמיסת B-LCLs בינונית
100x סטרפטומיצין פניצילין BioRoYeeBRY-2309BioRoYeeBRY-2309רכיב של B-LCLs
בינוני Ficoll paque בתוספתGE  בריאות17-1440-03לבידוד in vitro של לימפוציטים
PHA-MSigmaL8902לגירוי התפשטות לימפוציטים
ציקלוספורין Aקיימן  כימי12088לעיכוב השפעת הציטוטוקסיות של תאי T
מאגר ליזה של תאים אדומיםTiangenRT122-01לליזינג תאי דם אדומים
MTTאמרסקו0793לזיהוי כדאיות התאים
DMSOSigmaD2650להקפאת תאים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mohyuddin, A., et al. Genetic instability in EBV-transformed lymphoblastoid cell lines. Biochim Biophys Acta. 1670 (1), 81-83 (2004).
  2. Hu, V. W., Frank, B. C., Heine, S., Lee, N. H., Quackenbush, J. Gene expression profiling of lymphoblastoid cell lines from monozygotic twins discordant in severity of autism reveals differential regulation of neurologically relevant genes. BMC Genomics. 7, 118(2006).
  3. Toda, T., Sugimoto, M. Proteome analysis of Epstein-Barr virus-transformed B-lymphoblasts and the proteome database. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 197-206 (2003).
  4. Chiorazzi, N., Wasserman, R. L., Kunkel, H. G. Use of Epstein-Barr virus-transformed B cell lines for the generation of immunoglobulin-producing human B cell hybridomas. J Exp Med. 156 (3), 930-935 (1982).
  5. Traggiai, E., et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).
  6. Hussain, T., Kotnis, A., Sarin, R., Mulherkar, R. Establishment & characterization of lymphoblastoid cell lines from patients with multiple primary neoplasms in the upper aero-digestive tract & healthy individuals. Indian J Med Res. 135 (6), 820-829 (2012).
  7. Neitzel, H. A Routine Method for the Establishment of Permanent Growing Lymphoblastoid Cell-Lines. Hum Genet. 73 (4), 320-326 (1986).
  8. Oh, H. M., et al. An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes. Cell Prolif. 36 (4), 191-197 (2003).
  9. Louie, L. G., King, M. C. A Novel-Approach to Establishing Permanent Lymphoblastoid Cell-Lines - Epstein-Barr-Virus Transformation of Cryopreserved Lymphocytes. Am J Hum Genet. 48 (3), 637-638 (1991).
  10. Tremblay, S., Khandjian, E. V. Successful use of long-term frozen lymphocytes for the establishment of lymphoblastoid cell lines. Clin Biochem. 31 (7), 555-556 (1998).
  11. Reidy, J. A., Wheeler, V. A. Sample age and Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 28 (6), 383-384 (1992).
  12. Amoli, M. M., Carthy, D., Platt, H., Ollier, W. E. R. EBV immortalization of human B lymphocytes separated from small volumes of cryo-preserved whole blood. Int J Epidemiol. 37, suppl 1 41-45 (2008).
  13. Lacelle, C., Wang, E. Establishing lymphoblastoid cell lines from frozen blood of extremely old individuals. Mech Ageing Dev. 123 (10), 1415-1418 (2002).
  14. Tohda, H., Oikawa, A., Kudo, T., Tachibana, T. A greatly simplified method of establishing B-lymphoblastoid cell lines. Cancer Res. 38 (10), 3560-3562 (1978).
  15. Ventura, M., et al. Use of a Simple Method for the Epstein-Barr Virus Transformation of Lymphocytes from Members of Large Families of Reunion Island. Hum Hered. 38 (1), 36-43 (1988).
  16. Chenevixtrench, G., Kerr, B., Walters, M. Lymphoblastoid Cell-Lines from Frozen Whole-Blood - a Quick and Economical Safeguard for Linkage Analysis. Am J Hum Genet. 46 (1), 635-636 (1990).
  17. Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-Examination and Further Development of a Precise and Rapid Dye Method for Measuring Cell-Growth Cell Kill. J Immunol Methods. 119 (2), 203-210 (1989).
  18. Bogoslovsky, T., et al. Preservation and enumeration of endothelial progenitor and endothelial cells from peripheral blood for clinical trials. Biomark Med. 9 (7), 625-637 (2015).
  19. Ambach, A., Bonnekoh, B., Gollnick, H. Routine flow cytometric immuno-staining of T-cell perforin is preserved using diethylene glycol for erythrocyte-lysis but lost by the use of ammonium chloride. Exp Dermatol. 12 (6), 825-831 (2003).
  20. Beck, J. C., Beiswanger, C. M., John, E. M., Satariano, E., West, D. Successful transformation of cryopreserved lymphocytes: A resource for epidemiological studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 10 (5), 551-554 (2001).
  21. Tosato, G., Cohen, J. I. Generation of Epstein-Barr Virus (EBV)-immortalized B cell lines. Curr Protoc Immunol. , Chapter 7, Unit 7 22(2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

EBVPBMCCyclosporin AMTTCryopreservationEBV

מאמרים קשורים