משלוח Intraductal אל ארנב חלב בלוט

סיכום

כאן, אנו מתארים טכניקה לאספקה מקומית של ריאגנטים לבלוטת החלב של הארנב באמצעות זריקה תוך-צינורית. בנוסף, אנו מתארים פרוטוקול להדמיה ואישור מסירה על ידי הדמיית אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה של חומרי ניגוד.

תקציר

טיפולי intraductal המרוכזות לסרטן השד להציע יתרונות פוטנציאליים, כולל אספקה יעילה אל הגידול רעיל סיסטמית מופחתים ותופעות לוואי ^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7.} עם זאת, מספר אתגרים להישאר לפני טיפולים אלו יכולים להיות מיושמים באופן נרחב יותר. פיתוח ואימות של הרפוי intraductal במודל חיה מתאים להקל על פיתוח של אסטרטגיות טיפוליות intraductal לחולים. בעוד בלוטת חלב עכבר כבר בשימוש נרחב כמערכת מודל של פיתוח חלב tumorigenesis, האנטומיה היא נבדל בלוטת האדם. במודל חי גדול יותר, כמו הארנב, עשוי לשמש מודל טוב יותר עבור מבנה בלוטת חלב ופיתוח טיפולי intraductal. ב- Contrast לעכברים, שבה עשרה עצים ductal מופצים מרחבית לאורך ציר הגוף, כל שמסתיים בבית פטמה נפרדת, בלוטת חלב ארנב יותר דומה בלוטת האדם, עם מערכות ductal חופף מרובות כי יציאה דרך פתחים נפרדים פטמה אחת. כאן, אנו מציגים שיטות זעירות-פולשנית המסירה של ריאגנטים ישירות לתוך צינור חלב הארנב להדמיה של המשלוח עצם עם הדמיה אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה.

מבוא

משלוח intraductal ממוקד של תרופות נחקר במודלים של מכרסמים ו בניסויים בבני אדם בשלב מוקדם ^{3, 4, 5, 6, 11, 12.} שלב א אחרון אני לומד הדגים את הבטיחות והיתכנות של קרבופלטין intraductal או דוקסורוביצין liposomal pegylated intraductal בנשים ממתינות כריתת שד לטיפול סרטן פולשני ^2.

פרוטוקולים קודמים למסירה intraductal פותחו עבור בלוטות עכבר וחולדה החלב ^{6, 7, 8, 9.} למטרות מחקר, זריקות תאים סרטניים intraductal ואת משלוח וקטור lentiviral של אונקוגנים גם בוצעו במודלים של מכרסמיםנ"צ "> ^{13, 14, 15, 16.} עם זאת, אידאל במודל vivo של תהליך מסירת intraductal צריך לאפשר הפיתוח של כיתות רומן של תרכובות טיפוליות ולהקל הערכה פרה-קלינית. הבדלים אנטומיים בין מכרסמים ובני האדם יש מסובך התרגום של אלה לימודים.

בניגוד עכברים, שבו כל צינור מסתיים פטמה נפרדת, השד האנושי מורכב 5 עד 9 מערכות ductal עצמאיות, כל אחד עם פתיחה נפרדת ומסתיימת הפטמה. בלוטות חלב ארנב נמל ארבע מערכות ductal עצמאיות, כל אחד בנפרד, נגישה באמצעות אחד מארבעה פתחים בבית פטמה אחת. דגם ארנב יותר תואם במידה רבה את האנטומיה של גוף האדם, ומרשה המחקר של אספקת סמים intraductal בהקשר רלוונטי יותר.

כאן, אנו משתמשים בשתי טכניקות כדי להעריך משלוח intraductal. שיתוף הממשל שלחיוני לצבוע היתרים להדמיה דרך העור ומספק אישור פשוט ומהיר של השיטה. עבור יישומים מסוימים, מיפוי ברזולוציה גבוהה של צינוריות עשוי להיות מועדף. אנו מציגים כאן פרוטוקול הדמיה אולטרסאונד של צינוריות דרך משלוח intraductal של ריאגנט בניגוד הלא ממוקד.

פרוטוקול

נהלים באמצעות בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש מאוניברסיטת טקסס באוסטין.

1. הכנה לפני הניתוח

1. רשום את משקל הגוף של כל ארנבת. כמו בכל במחקרים פרה, לפקח משקולות חיה בקביעות כדי להעריך את רעילות אפשרית.
2. לפני הרדמה הארנב, למלא צינור חרוטי 50 מ"ל עם ג'ל ספין אולטרסאונד זמינים מסחרית ב XG 500 עבור 30 s; לא אמור להיות שום בועות גלויות בתוך הג'ל עם השלמת צנטריפוגה.
3. נהל תת עורי glycopyrrolate במינון של 0.1 מ"ג / ק"ג ו acepromazine לשריר במינון של 0.75 מ"ג / ק"ג. מתן 15-20 דקות עבור ההרגעה ייכנס לתוקף תוך מעקב אחר סימנים והתנהגות חיוניים.
   הערה: Glycopyrrolate הוא סוכן אנטי-כולינרגיות שמונע ברדיקרדיה ומפחית פרשות נשימת עיכול. Acepromazine היא תרופת הרגעה, אשר משמשת premedicatiעל הרדמה.
4. נהל 35 מ"ג / ק"ג של קטמין ו 5 מ"ג / ק"ג של xylazine תת עורי כמו הרדמה. עם זאת, כמפעיל הופך להיות יותר מנוסה יכול לבצע את משלוח intraductal במהירות רבה יותר, להקטין את המינונים התרופה ל -15 מ"ג / ק"ג של קטמין ו 3 מ"ג / ק"ג של תת-עורית xylazine; זה יקצר את זמן ההרדמה ואת הזמן הנדרש עבור החיה להתאושש מההרדמה.
5. בדוק ולתעד את קצב הלב, _{2 SPO,} טמפרטורה, קצב נשימה, וצבע קרום ריר כל 15 דק '. החל סיכת עין לשתי העיניים.
   הערה: רק טכנאים שעברו הכשרה מתאימה אושרו על ידי IACUC של המוסד שלהם צריך לנהל או לפקח הרדמה. שימוש צג הרדמת וטרינרים יכול לסייע ברכישת סימנים חיוניים והוא מומלץ. צג הרדמת הווטרינרים, לעומת זאת, אינו מחליף את הצורך לבדוק באופן ידני את החיה כל 15 דק '. ראו את הוראות היצרן fאו את השימוש הנכון של צג וטרינרים.
6. בדוק את התחלתה של הרדמה על ידי קמצוץ בוהן עדין; הארנב צריך להיות ללא תגובה לפני שתמשיך.
7. בזהירות לגלח את הבטן הזנב של הארנב באזור סביב זוגות השלישי והרביעי של מוצצים מפשעתי.
8. עם רוב של השיער הוסר, להחיל קרם להסרת שיער Over-the-counter לאזור המגולח. הסר את דקות שמנת 10 לאחר יישום באמצעות מגבות נייר לחה רטובות עם מים חמים.
   הערה: ארנב עור הוא מאוד שביר / רגיש. הקרם להסרת השיער אמור לשמש לא יותר מ -10 דקות. למעשה, זה בטוח לנסות "נקודת מבחן" ב 5 דקות ורק לעזוב על זמן רב יותר אם במקום בדיקה מצביע על זמן ארוך יותר תקופה נדרשת.
9. נגב את האזור עם פדי גזה ספוג באלכוהול לניקוי הזריקה.
10. מניח את הארנב על dorsum שלה שוקת נ בצורה מרופדת שמיכת מים חמה הסירקולציה מחודשת וכרית סופגת.

2. Preparation של חומר ניגוד

1. מחדש את מגיב בניגוד הלא ממוקד על פי הוראות היצרן. פיפטה למעלה ולמטה בעדינות לתערובת.
   הערה: חומר הניגוד להשתמש בפרוטוקול זה הוא יציב בטמפרטורת חדר למשך 4 - 6 שעות לאחר כינון מחדש. נער בעדינות את הבקבוקון בין כל אחזור.
   הערה: היקף הפתרון הנדרש יהיה תלוי במספר הצינוריות להיות מוזרק. הארנב יש 4 פתחים ductal לכל פטמה, ו -0.2 מ"ל של תמיסת מספיקה כדי למלא עץ ductal אחד של הארנב הלבן מבוגר ניו זילנד (Oryctolaguscuniculus). לכן, בהיקף כולל של 0.8 מיליליטר עשוי להישלח בלוטת חלב אחד.

3. משלוח Intraductal

1. אתר את הפטמות המתאים להיות מוזרק; זוגות ^-3 וה -4 ^th של מוצצי מפשעה מומלצים, כפי שהם דמיינו בקלות כאשר החיה ממוקמת על dorsum שלה.
2. טען 0.2 מ"ל של תמיסת מלח 0.9% סטרילי לתוךמזרק טוברקולין 1 מ"ל Luer נעילת עם מחט 22 G. כראוי להשליך את המחט 22 G פעם מלוחים הוא בתוך המזרק ולהחליף אותו עם מחט 25-מד סטרילית. נגב בעדינות את האזור עם אלכוהול איזופרופיל 85% על פד גזה.
3. עם השיפוע של עד המחט במקביל המזרק לגוף של בעלי החיים, להכניס את השיפוע של המחט לתוך הצד של הפטמה לאט להזריק 0.1-0.2 מיליליטר של תמיסת מלח; זה יאפשר להדמיה טובה יותר של פתחי ductal.
4. טען 0.2 מ"ל של תמיסת ההזרקה לתוך מזרק טוברקולין מ"ל Luer נעילת 1.
5. החזק את הפטמה בעדינות עם האגודל ואצבע מורה ומרים אותו מעט כדי למקם אותו על הזרקת intraductal; זכוכית מגדלת עינית לביש עשויה לסייע לדמיין את פתחי ductal.
6. תוך שמירה על עמדת הרים של הפטמה, בזהירות cannulate צינור עניין באמצעות מחט 25 G קהה קצה.
7. לאחר cannulation, בעדינות לסובב את מזרק נעילת Luer ברכזת של-t הבוטהמחט עירוי ip עד שהוא ננעל במקומו.
8. הרם את פטמה ולהזריק הפתרון לאט כדי למזער את הנזק הפוטנציאלי שנגרם על ידי העברת נוזל במהירות בתוך צינור; ללא בזמן אם יש התנגדות כאשר הזרקת הפתרון.

4. הדמיה אולטראסאונד

1. למרוח כמות ליברלית של ג'ל אולטרסאונד centrifuged על העור של האזור של עניין. ודא שאין בועות בתוך הג'ל, כמו אלה יתפשרו על איכות התמונה.
2. הגדר את עומק הדמיה עד 6 מ"מ. מניחים את מתמר 21 מגה-הרץ במגע עם ג'ל ולסרוק את האזור של עניין במצב B. שים את חומר הניגוד באזור הסרוקים לרבות פתיחת ductal וברחבי הדביקים.
   הערה: הגדרות אלו פותחו לשימוש עם מכונת אולטרסאונד ספציפית photoacoustic. עיין בטבלה של חומרים לקבלת פרטים נוספים. זה עשוי להיות נחוץ כדי להתאים את עוצמת השידור ועומק הדמיה של מערכות הדמיה אחרות כדי לייעל חלבלהדמיה בלוטת.
3. הסר את ג'ל אולטרסאונד מעורו של בעלי החיים עם פד גזה.

5. טיפול לאחר הניתוח

1. שים את הזריקה: לא אמור להיות שום סימנים של טראומה לאזור הפטמה או הרקמה הסובבת, ונפיחות באזור המקיף את הפטמה מציינת שקיימת זריקת כרית שומן חלב ולא הזרקה intraductal מוצלחת.
2. מניחים את הארנב בעמדה sternal. במידת הצורך, לתת 0.2 מ"ג / ק"ג של yohimbine לווריד אל הווריד האוזן שולית; זה יהיה לבטל את ההשפעה של xylazine ולאפשר החיה להתאושש מהר יותר מן ההרדמה.
3. צג הארנב כל 15 דקות במהלך תקופת ההתאוששות עד שהחיה היא התראה, בעלי תגובה שומרת על מעמדה sternal.
   הערה: הליך זה לא צריך לגרום נזק לרקמות או נפיחות. אם אדמומיות או נפיחות הם נצפו, לנהל מנה של מ"ג meloxicam 0.1-0.2 / קילו PO פעם החיה ערנית ומסוגליםלקחת תרופות דרך הפה. יצירת קשר עם צוות הווטרינרים של המוסד לקבלת הדרכה נוספת.

תוצאות

כאן, אנו מראים כי משלוח intraductal של ריאגנטים בניגוד צינוריות החלב של ארנב יכול להיות מושגת ללא טראומה לרקמה (איור 2). בארנבות, ארבע מערכות ductal נפרדות להתכנס פטמה אחת ולכן ניתן לגשת צלמו בנפרד באמצעות שיטה זו. פתחי ductal פרט הם דמיינו בקלות; לציין את ראש החץ סימון פתח ductal השני סמוך צינור cannulated באיור 2B.

דיון

שיטה זו של מסירת intraductal אל בלוטת חלב הארנב עשויה לשמש ריאגנטים בניגוד אולטרסאונד ותמיסות מימיות רבות אחרות, כוללים הצבעים ותרופות חיוניים. מחקרים קודמים הדגימו את משלוח intraductal של הורמונים ^{17, 18, 19.} במודלים של מכרסמים, מסירת intraductal של חומצות גרעין ^8, כימותרפיות ^{6, 7,} ונושאות nanoparticle

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מגיב ניגודיות לא ממוקד MicroMarker	VisualSonics	VS-11694
Luer Lock 1 מזרקים	BD	309628
גליקופירולאט 0.2 מ"ג/מ"ל	Wedgewood Compounding Pharmacy	GLYCOP-INJ013VC	חיי מדף של 6 חודשים, האספקה עשויה להיות מוגבלת.
אטרופין סולפט 0.5 מ"ג/מ"ל	בריאות בעלי חיים 15320764 אם		גליקופירולאט אינו זמין. אין לשלב עם גליקופירולאט.
קטמין הידרוכלוריד 100 מ"ג/מ"ל	Animal Health International	21250699	http://www.animalhealthinternational.com/
אצפרומזין 10 מ"ג/מ"ל	Animal Health International	17640541
קסילזין 20 מ"ג/מ"ל	Animal Health International	20101547
יוהימבין 0.2 מ"ג/מ"ל	בעלי חיים Health International	14588965
קרם להסרת שיער	Veet		תמיסה לעור רגיש. ניתן להשיג דרך קמעונאים מקומיים.
מחטי עירוי עם קצה קהה	Sai Infusion Technology	B14-50	http://www.sai-infusion.com/collections/blunt-needles
אוקסימטר דופק וטרינרי	EdanUSA	VE-H100B	http://www.edanusa.com/Product/ VE-H100B-Veterinary-Pulse-Oximeter.html
משאבת מים חמים	Gaymar	TP700
שמיכת מים חמים בריאות	בעלי חיים בינלאומי	21232696	Maxi-Therm Lite רפידות חימום
מערכת אולטרסאונד	VisualSonics	Vevo 2100