מאמר שיטה

צבירת Cell מגנטי גזע 3D והתבגרות Bioreactor להתחדשות סחוס

DOI:

10.3791/55221

⸱

27 באפריל 2017

 ,  , 
1Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC), UMR 7057 CNRS and University Paris Diderot

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chondrogenesis מתאי גזע דורש כוונון עדין תנאי התרבות. כאן, אנו מציגים גישה מגנטית עבור עיבוי תאים, צעד חיוני ליזום chondrogenesis. בנוסף, אנו מראים כי התבגרות דינמית בתוך bioreactor חלה גירוי מכאני כדי המבנים הסלולר ומשפרת ייצור תאי מטריקס סחוסים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנדסת סחוס עדיין מהווה אתגר בשל קשיים ביצירת שתל במבחנה תפקודית דומה רקמות הילידים. גישה בחנה לאחרונה לפיתוח תחליפים אוטולוגי כרוך הבידול של תאי גזע לתוך כונדרוציטים. כדי ליזום chondrogenesis זה, מידה של דחיסה של תאי הגזע נדרש; ומכאן, הראינו את הכדאיות של תאי עיבוי מגנטי, הוא בתוך פיגומים עבים פיגום ללא שימוש במקורות שדה מגנטיים מיניאטורי כמו משיכת תא. גישה מגנטית זה גם שמשה להנחות היתוך צבירה לבנות פיגום ללא, מאורגן, תלת ממדי (3D) רקמות כמה מילימטרים בגודלם. בנוסף בעל גודל משופר, הרקמה הנוצרת על-ידי היתוך מגנטי מונחה הציגה גידול משמעותי בביטוי של קולגן השנייה, ומגמה דומה נצפתה עבור ביטוי aggrecan. כמו סחוס הילידים היה נתון הכוחות tכובע השפיע מבנה 3D שלה, התבגרות דינמית גם בוצעה. Bioreactor המספק גירויים מכאניים שמש לתרבות הפיגומים המגנטיים הזורעים לאורך תקופה של 21 יום. התבגרות Bioreactor השתפרה במידה רבה chondrogenesis לתוך פיגומי cellularized; מטריקס שהושג בתנאים אלה היה עשיר קולגן השני aggrecan. עבודה זו מתארת ​​את הפוטנציאל החדשני של התעבות המגנטית של תאי גזע שכותרתו והתבגרות דינמית בתוך bioreactor לבידול chondrogenic משופר, הוא פיגומי פוליסכריד הפיגום ללא ובתוך.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלקיקים מגנטיים משמשים כבר במרפאת בתור סוכנים בניגוד עבור דימות תהודה מגנטית (MRI), והיישומים הטיפוליים שלהם ולשמור על רחבה. לדוגמא, הוכח לאחרונה כי תאי שכותרתו ניתן להשפיע in vivo באמצעות שדה מגנטי חיצוני ויכולים להיות מופנים ו / או נשמרו אתר מוגדר של השתלה 1, 2, 3. ברפואת רגנרטיבית, הם יכולים לשמש כדי להנדס רקמות מאורגנות במבחנה 4, כוללים כלי דם ברקמה 5, 6, 7, 8 עצם, ואת סחוס 9.

סחוס במפרק שקוע בסביבת avascular, עושה תיקונים של רכיבי מטריקס מוגבלים מאוד כאשר הנזקים להתרחש. מסיבה זו, research מתמקדת כרגע על ההנדסה של החלפות סחוס hyaline שניתן מושתלות באתר הפגם. על מנת לייצר תחליף עצמי, כמה קבוצות מחקר בוחנות את השימוש של כונדרוציטים אוטולוגי כמקור תא 10, 11, בעוד שאחרים מדגישים את היכולת של תאי גזע מזנכימיים (MSC) להתמיין chondrocytes 12, 13. במחקרים קודמים סכמו כאן, בחרנו MSC, כמו דגימת מח העצם שלהם היא פשוטה למדי ואינו דורשת את ההקרבה של כונדרוציטים בריאים, אשר עלולים לאבד פנוטיפ שלהם 14.

מוקדם צעד חיוני כדי ליזום את בידול chondrogenic של תאי גזע הוא ההתעבות שלהם. אגרגטים תא נוצרים בדרך כלל באף אחת צנטריפוגה או micromass תרבות 15; עם זאת, שיטות התעבות האלה neither להציג את הפוטנציאל ליצור צבירי תאים בתוך פיגומים עבים ולא את הפוטנציאל לשלוט ההיתוך של אגרגטים. במאמר זה, אנו מתארים גישה חדשנית עיבוי בתאי גזע באמצעות תיוג MSC מגנטי משיכה מגנטית. טכניקה זו הוכחה כדי ליצור מבני 3D ללא פיגום באמצעות שילוב של אגרגטים אחד עם השני כדי להשיג רקמות סחוס בקנה מידת מילימטר 9. זריעת מגנטי של פיגומים עבים וגדולים גם אפשרה את האפשרות של הגדלת הגודל של הרקמות המהונדסות, עיצוב צורה יותר בקלות שימושית עבור השתלה, ולגוון את הפוטנציאל עבור יישומים קליניים תיקון סחוס. כאן, אנו בפירוט את הפרוטוקול עבור הזריעה המגנטית של MSC לתוך פיגומים נקבוביים מורכבים סוכרים טבעיים, pullulan, פולימרים, פיגומים השתמשו בעבר כדי להגביל תאי גזע 16, 17. בידול Chondrogenic היה finally המבוצעת bioreactor כדי להבטיח מזין רציף דיפוזיה גז לתוך ליבת המטריצה ​​של הפיגומים שנזרעו עם צפיפות גבוהה של תאים. מלבד מתן חומרים מזינים, גורמי גדילה chondrogenic, וגז אל התאים, bioreactor המוצעים גירוי מכני. בסך הכל, הטכנולוגיה המגנטית נהגה להגביל תאי גזע, בשילוב עם התבגרות דינמית bioreactor, יכולה לשפר בידול chondrogenic ניכרה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בניית התקנים מגנטיים

הערה: המכשירים המשמשים זריעת תאים משתנים בהתאם ליישום (איור 1). כדי ליצור אגרגטים, מספר התאים מוגבל 2.5 × 10 5 / המצרפי, כך העצות המגנטיות חייבות להיות דקות מאוד (750 מיקרומטר קוטר). כדי לזרוע את פיגומי 1.8 סנטימטר 2/7-עבה מ"מ, המגנטים חייבים להיות גדולים יותר (3 מ"מ קוטר) ויבטיחו נדידת תאי הדרך הנקבובית של הפיגום.

  1. בניית מכשיר עם-מגנטים מיקרו עבור היווצרות המצרפי (איור 1A)
    1. הפוך-חורים מיקרו עם מקדח 0.8 מ"מ באמצעות צלחות אלומיניום (3 ס"מ קוטר ו 6 מ"מ עובי).
    2. הכנס קצה מגנטי (750 מיקרומטר קוטר) לתוך כל חור של הצלחת.
    3. מניחים דיסק זה מעל מגנט ניאודימיום קבע, אשר מבטיח המגנטיזציה רוויה.
  2. בניית מכשיר זריעת פיגום ( 1B איור)
    1. חותכים פוליסטירן קשה לתוך 2.4 ס"מ 2 ריבועים.
    2. הכנס 9 מגנטים קטנים (3 מ"מ קוטר, 6 מ"מ ארוך) במרחק שווה על פני שטח של 1.6 ס"מ 2.
    3. מניחים את המכשיר על פני מגנט ניאודימיום קבע.

2. תיוג תא גזע

הערה: גזע תאים תויגו עם 0.1 מ"מ חלקיקים מגנטיים עבור 30 דק '(2.6 ± 0.2 pg ברזל / תא) כדי ליצור אגרגטים, תוך שהם תויגו עם 0.2 מ"מ חלקיקים מגנטיים עבור 30 דקות (5 ± 0.4 pg ברזל / תא) לזרע פיגומים. ריכוזי ננו-חלקיקים אלו פעמי דגירה שמשו בעבר ופורסם עבור MSC ותאים אחרים 18, 19, וזה כבר נקבע כי חלקיקים השפיעו לא כדאי תא ולא יכולת בידול MSC. מסת הברזל המשולבת על ידי תאי הגזע נמדדה באמצעות יחיד CEll magnetophoresis 19, 20.

  1. תאי גזע ותרבות המזנכימה האנושי (MSC) במצע גידול תאי גזע mesenchymal שלם (MSCGM) בשעה 37 ° C ו 5% CO 2 עד סמוך למפגש (~ 90%).
  2. הכן את הפתרון תיוג מגנטי על ידי ערבוב 0.1 או 0.2 מ"מ מגהמיט תחמוצת ברזל מצופה ציטרט (γFe 2 O 3; הליבה: 8 בקוטר ננומטר) במדיום 5A של סרום ללא מקוי שונה במכון ממוריאל פארק רוזוול (RMPI) ללא גלוטמין ו המכיל 5 נתרן ציטרט מ"מ.
  3. מחק את המדיום, לשטוף את התאים עם המדיום RPMI סרום ללא ללא גלוטמין, ולהוסיף 10 מ"ל של תמיסת הננו-חלקיק תחמוצת ברזל לכל בקבוק תרבות 150 ס"מ 2, נפח המינימלי הנדרש כדי לכסות את כל התאים.
  4. דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2 ואז להשליך את הפתרון ננו-חלקיקים. השרייה במשך 5 דקות עם סרום ללא בינוני RPMI ללא גלוטמין כדי להפנים את נאןoparticles עדיין מחוברת הממברנה.
  5. מחק את המדיום RPMI ולהוסיף 25 מ"ל של מדיום MSCGM מלאה לכל בקבוק. דגירה לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO 2.

3. זריעת תאים מגנטית

  1. טרי להכין את המדיום chondrogenic באמצעות בינוני הנשר Modified של Dulbecco (DMEM) גלוקוז גבוהה עם L- גלוטמין ידי הוספת 50 מיקרומטר L-אסקורבית חומצה 2-פוספט, 0.1 מיקרומטר dexamethasone, 1 מ"מ פירובט נתרן, 0.35 מ"מ L- פרולין, 1% התרבות האוניברסלית תוסף המכיל אינסולין, transferrin האנושי וחומצה selenous (ITS-Premix), ו 10 ng / mL 3 והפיכת צמיחה גורם-בטא (-β3 TGF).
  2. לנתק את התאים מגנטי באמצעות 8 מ"ל של 0.05%-EDTA טריפסין לכל בקבוק תרבות 150 ס"מ 2 ו צנטריפוגות התאים ניתק ב 260 × g עבור 5 דקות. לשאוב את המדיום ולספור את התאים מושעה מחדש.
  3. מניחים בצלחת פטרי תרבית תאים תחתית זכוכית (35 מ"מ) על גבי שני המכשירים מגנטי.
  4. מ'agnetically ליצור אגרגטים, להוסיף 3 מ"ל של מדיום chondrogenic אל צלחת פטרי להפקיד את נפח הקטן בעדינות האפשר (לא יותר מ 8 μL) המכיל 2.5 × 10 5 תאים שכותרתו לכל המצרפי (עד 16 אגרגטים ניתן להפקיד). השאירו את צלחת פטרי במשך 20-30 דקות מבלי להזיז אותו, שמאפשר לו ליצור spheroids, ולאחר מכן למקם את המכשיר שלם, כולל צלחת פטרי המכילה את 16 אגרגטים, לתוך החממה ב 37 ° C ו 5% CO 2.
  5. אגרגטים מלאה הטופס הבא באותו פרוטוקול ולהחליף המדיום להשלים עם בינוניות chondrogenic ללא TGF-β3.
    1. כדי ליצור את המבנה המצרפי 3D, למקם 2 אגרגטים במגע ביום 8 כדי ליצור 8 כפילויות וליזום ההיתוך. ביום 11, למזג 2 כפילויות כדי ליצור 4 רביעיות. לבסוף, פתיל 4 רביעיים ביום 15 כדי להשיג את המבנה הסופי.
    2. במקביל, ליצור אגרגטים על ידי צנטריפוגה 2.5 × 10 5 שכותרתו בתאי גזע ב 26015; g עבור 5 דקות צינורות 15 מ"ל עם 1.5 מ"ל של מדיום chondrogenic עם או בלי TGF-β3 (עבור מדגם ובקרה, בהתאמה).
  6. כדי מגנטי פיגומי זרע, למקם כל פיגום יבש לתוך צלחת פטרי. השתמש פיגומים פוליסכריד נקבוביים עשויים pullulan / dextran 21. במשך כל פיגום, לדלל 2 × 10 6 בתאי גזע שכותרתו 350 μL של המדיום chondrogenic ללא-β3 TGF ובזהירות פיפטה תאים על הפיגום.
    1. דגירה של 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר חדירה לתא מלא בתוך הפיגום ואז בעדינות להוסיף 3 מ"ל של מדיום chondrogenic עם או בלי-β3 TGF (עבור מדגם או מלאה, בהתאמה) על צלחת פטרי.
    2. דגירת גרדום cellularized במכשיר המגנטי שלה ב 37 ° C ו 5% CO 2 עבור 4 ימים כדי לאפשר נדידת תאי הדרך הנקבובית פיגום הריתוק.
  7. במקביל, זרע פיגומים עם 2 × 10 6 תאי גזע שכותרתו באים באותה שיטת דגירה ללא המגנט להשיג פיגומי זרע אחיד שולטים חיובי.

בידול 4. אל chondrocytes

הערה: לאחר 4 ימים של דגירה, להסיר את המגנטים ולהמשיך הבשלת chondrogenic או בצלחת פטרי (תנאים סטטי) או בתוך bioreactor (תנאים דינמיים). דגימות בקרה שליליות התבגרו בתנאים סטטיים עם מדיום chondrogenic ללא-β3 TGF.

  1. בתנאים סטטיים, לשמור על פיגומים או אגרגטים cellularized באותה צלחת פטרי. שינוי המדיום chondrogenic פעמים בשבוע במשך 21 ימים.
  2. בתנאים דינאמיים, להכין את bioreactor.
    1. חותך צינורות סיליקון ב באורך המתאים על פי הפרוטוקול של היצרן.
    2. חיטוי כל החומרים: תא תרבות 500 מיליליטר, צינורות, מסובבי 2-דרך, ואת כלובים.
    3. מניחים את חלקי bioreactor לתוך microbio סטרילי תחנת בטיחות הגיונית. חבר את הצינורות אל מסובבי 2-way לתא ההתרבות בעקבות הוראות היצרן.
    4. להעביר בזהירות את הפיגומים cellularized לתוך כלובים מעוקר באמצעות מרית סטרילי. מניחים 2 פיגומים בכל כלוב. כאשר הכלובים מוכנים, להכניס אותם לתוך המחטים של המכסה כדי לשמור אותם לנוע במהלך סיבוב נוסף. ממלא את חדר התרבות עם מדיום chondrogenic ולסגור אותו עם המכסה המכיל את הכלובים.
  3. הפעל את משאבת peristaltic למלא את הצינורות עם מדיום chondrogenic וכדי לחסל בועות אוויר.
  4. מניח ולאבטח את הלילה המלאים לתוך המנוע של bioreactor ולהדליק את המחשב, אשר שולט סיבובים הן של הזרוע ובית הנבחרים.
  5. החלת מהירות סיבוב של 5 סיבובים לדקה (סל"ד) משתי הזרוע ובית הנבחרים. כוון את המשאבה peristaltic בקצב זרימה של 10 סל"ד עבור האכלה רציפה של הפיגומים cellularized.

התחת = "jove_title"> 5. הפקת רנ"א ניתוח ביטוי גנים

הערה: לפני מיצוי RNA, לעכל את הפיגומים עם פתרון אנזימטי.

  1. הכן 1 מ"ל של פתרון אנזימטי על ידי הוספת 100 μL של pullulanase (40 U / mL) ו 50 μL של dextranase (60 מ"ג / מ"ל) כדי 850 מ"ל של מדיום סרום ללא DMEM.
  2. יש לשטוף את הפיגומים פעמיים עם מדיום סרום ללא DMEM, להשליך את המדיום, ולהוסיף 800 μL של פתרון אנזימטי לכל הגרדום. דגירה של 15-30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס מתחת תסיסה עדינה.
  3. כאשר הפיגום נמס לגמרי, להעביר את פתרון המכיל את התאים לצינור 1.5 מ"ל, צנטריפוגות ב g 300 × עבור 10 דקות, בזהירות לשאוב את המדיום, לשטוף פעמיים עם סטרילי 1 × פוספט שנאגרו מלוחים (PBS), צנטריפוגות ב 300 × g עבור 10 דקות, מחדש להשעות את התאים בתמיסת בידוד RNA.
  4. כדי לחלץ את RNA מן אגרגטים, למקם הספרואידים בפתרון בידוד RNA ולחלוטין למחוץ אותם באמצעות homogenizer לפני ביצוע חילוץ RNA.
  5. לבודד את RNA באמצעות ערכה להפקת RNA הכוללת על פי הוראות היצרן.
  6. לסנתז DNA משלים מ 400 ננוגרם של רנ"א הכל באמצעות transcriptase הפוכה על פי הוראות היצרן, באמצעות 250-ng פריימרים אקראיים, 1 μL של תמהיל dNTP (10 מ"מ כל אחד), ו 40 U / mL RNase מעכב; היקף התגובה הסופי הוא 20 μL. בסוף התגובה, להוסיף 80 μL של מים מזוקקים להשיג נפח סופי של 100 μL.
  7. לקבלת תגובת שרשרת של פולימראז כמותיים (PCR), להשתמש בשילוב PCR המכיל ריאגנט פלורסנט לכמת את הביטוי היחסי של הגנים של עניין, כגון aggrecan (AGC) וקולגן השנייה (Col II), עם 10 × cDNA מדולל. לנרמל את רמות של ביטוי גנים עם חלבון ריבוזומלי גן התייחסות, גדול, P0 (RPLP0). בצע את החישובים עם 2 - נוסחא ΔΔCT, שבו ΔΔCT = ΔCT של מצב מובחן - אומר ΔCT של מצב מלא, וכל ΔCT מייצג את CT של הגן של עניין - CT של גן ההתייחסות (RPLP0).
  8. לקבוע מדידות סטטיסטיות כמו ערכים ממוצע ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM). לבצע את הניתוח עם ניסויים עצמאיים 2 n ≥. השתמש מבחן t לנתח את ההבדלים הסטטיסטיים בין כדורי centrifuged ו בשילובים מגנטיים (* p <0.05). לקבוע את המשמעות עם מבחן Kruskal-Wallis (פרמטרית חד סטרית ANOVA) לנתח הבדלים סטטיסטיים בין פיגומים מבודלים עם הפיגום המלא (* p <0.05).

6. ניתוח היסטולוגית

  1. יש לשטוף את הפיגומים או אגרגטים cellularized עם 1 סטרילי × PBS, ולתקן אותן בתמיסת פורמלין 10% עבור 1 שעות בטמפרטורת חדר, ולשטוף עם 1 × PBS.
  2. הסר את PBS, להטביע את הדגימות עוקצות אופטימליהטמפרטורה מתחם G (אוקטובר), ולהקפיא אותם באמבט איזופנטאן שקוע חנקן נוזלי. חנות המדגם ב -20 מעלות צלזיוס. חותך את הדגימות עם cryostat להשיג cryosections 8-מיקרומטר ליחידות או 12 מיקרומטר עבור פיגומי cellularized.
  3. הכתם cryosections עם פתרון toluidine כחול 0.5% עבור 2 דקות, לשטוף במי ברז, מייבשים עם 100% אתנול, להבהיר באמצעות טולואן, ולעגן את השקופיות עם הרכבה בינונית עבור מיקרוסקופ אור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ראשית, אגרגטים יכול להיווצר בנפרד באמצעות מיקרו-מגנטים על ידי הפקדת 2.5 × 10 5 תאי גזע שכותרתו (איור 2 א). אגרגטים יחידים אלה (~ 0.8 מ"מ גודל) לאחר מכן ניתן התמזגו לתוך בזכות מבנים גדולים כדי היתוך רציף, מושרה מגנטי. למשל, ביום 8 של התבגרות chondrogenic, אגרגטים הונחו במגע בזוגות כדי ליצור כפילויות; רביעיות הורכבו ביום 11 על ידי מיזוג 2 כפילויות; ולבסוף, ביום 15, 4 רביעיות היו התמזגו ליצור מבנה 3D המכיל 16 של אגרגטים יצר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ראשית, בגלל הטכניקות שהוצגו כאן מסתמכים על ההפנמה של חלקיקים מגנטיים, נושא חשוב אחד הוא תוצאה של חלקיקים ברגע שהם למקם בתוך התאים. נכון חלקיקי ברזל עלולים לגרום לרעילויות פוטנציאל או יכולת בידול לקויה תלוי בגודל, הציפוי שלהם, וזמן חשיפה 19, 22. עם זאת, מספר מחקרים הראו שום השפעה על פיזיולוגיה הסלולר כאשר חלקיקי ברזל כמוסים שמשו 23 בצורת magnetoferritin, ננו-חלקיק מגנטי ביולוגי 24,<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות QuinXell טכנולוגיות CellD, במיוחד לותר Grannemann ודומיניק Ghozlan עזרתם עם bioreactor. אנו מודים קתרין Le Visage, אשר סיפק לנו את הפיגומים פוליסכריד pullulan / dextran. עבודה זו נתמכה על ידי האיחוד האירופי (ERC-2014-Cog פרויקט מאטיס 648,779) ועל ידי AgenceNationalede la משוכלל ונדיר (ANR), צרפת (פרויקט MagStem ANR-11 SVSE5).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ננו-חלקיקים של תחמוצת ברזל (מגמיט) (γ-Fe2O3)PHENIX - University Paris 6מיוצר וניתן על ידי C. Mé nagerקוטר ממוצע של 8.1 ננומטר ומטען פני שטח שלילי
פיגומי פוליסכריד פולולן/דקסטרןLIOAD - אוניברסיטת נאנטמיוצר וניתן על ידי C. Le Visageמוכן מתערובת 75:25 של פולולן/דקסטרן בתנאים אלקליין (10  M NaOH). נקבוביות: 185-205  ומיקרו; m; עובי: 7  מ"מ; שטח פנים: 1.8  cm2.
מערכת התחדשות TisXellQuinXell TechnologiesQX900-002ביו-ריאקטור דו-צירי עם תא תרבית של 500 מ"ל 
כלוב לפיגומים: Histosette II M492 VWR720-0909
תאי גזע מזנכימליים (MSC)LonzaPT-2501נעשה שימוש בשלוש קבוצות עצמאיות
MSCGM BulletKit מדיוםLonzaPT-3001עבור המדיום השלם, הוסף את ה-BulletKit המסופק (המכיל סרום, גלוטמין ואנטיביוטיקה) למדיום MSCGM
DMEM עם Glutamax ILife Technologies31966-021ללא נתרן פירובט, ללא HEPES
RPMI בינוני 1640, ללא GlutamineLife Technologies31870-025ללא נתרן פירובאט, ללא HEPES
PBS ללא CaCl2 w/o MgCl2Life Technologies14190-094
0.05% טריפסין-EDTA (1x)Life Technologies25300-054
פניצילין (10,000  U/מ"ל) / סטרפטומיצין (10,000  ומיקרו; גרם/מ"ל)Life Technologies15140-122
ITS Premix תוסף תרבית אוניברסלי (20x)תמיסת נתרן פירובט 354352
100 מ"מסיגמאS8636
L-חומצה אסקורבית 2-פוספטסיגמאA8960הכן את התמיסה המרוכזת (25 מ"מ) במים מזוקקים באופן זמני
L-פרוליןסיגמאP5607מכינים את תמיסת המלאי של 175 מ"מ מדוללת במים מזוקקים ומאחסנים בטמפרטורה של 4  ° C
DexamethasoneSigmaD4902הכן את תמיסת המלאי של 1 מ"מ מדולל באתנול 100% ואחסן ב-20  °
C TGF-בטא 3 חלבון 10  ומיקרו; gInterchim30R-AT028
תלת-נתרן ציטראטVWR33615.268הכן את ה-1  תמיסת מלאי M מדוללת במים מזוקקים ומאחסנת ב-4  ° C
Pullulanase מ-Bacillus acidopullulyticusSigmaP2986
Dextranase מ-Chaetomium erraticumSigmaD0443
ערכת מיצוי RNA NucleoSpinMacherey-Nagel740955.5
SuperScript II Reverse TranscriptaseLife Technologies18064-014
אקראי פריימר - הקסמר PromegaC1181500 ומיקרו; גרם/מ"ל: השתמש בדילול 1/2 ושים 1 ומיקרו; L לדגימה
RNA רקומביננטי במעכב ריבונוקלאזPromegaN251140 U/µ L: לשים 1 ומיקרו; L לכל דגימה
תערובת נוקלאוטיד PCR dNTP (10  מ"מ כל אחד)Roche10842321
SyBr Green PCR Master MixLife Technologies4368708
Step One Plus Real-Time PCR SystemLife Technologies4381792
תמיסת פורמלין 10% ניטרלי מאגרSigmaHT5012
תמיסת OCTVWR361603E
איזופנטןסיגמאM32631
טולואידין כחול OVWR1.15930.0025
אתנול מוחלטVWR20821.310
טולואןVWR1.08323.1000
בינוני הרכבה PertexHistolab840
RPLP0 פריימר עבור qPCREurogentec5'-TGCATCAGTAC
CCCATTCTATCAT-3';
5'-AAGGTGTAATC
CGTCTCCACAGA-3'Aggrecan
Primer for qPCREurogentec5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5'Collagen
II Primer for qPCREurogentec5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5'
קורנינג

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. Clinical imaging in regenerative medicine. Nat Biotechnol. 32 (8), 804-818 (2014).
  2. Edmundson, M., Thanh, N. T., Song, B. Nanoparticles based stem cell tracking in regenerative medicine. Theranostics. 3 (8), 573-582 (2013).
  3. Di Corato, R., et al. High-resolution cellular MRI: gadolinium and iron oxide nanoparticles for in-depth dual-cell imaging of engineered tissue constructs. ACS Nano. 7 (9), 7500-7512 (2013).
  4. Xu, F., et al. Three-dimensional magnetic assembly of microscale hydrogels. Adv Mater. 23 (37), 4254-4260 (2011).
  5. Kito, T., et al. iPS cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for reparative angiogenesis. Sci Rep. 3, 1418(2013).
  6. Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Nanotechnology in vascular tissue engineering: from nanoscaffolding towards rapid vessel biofabrication. Trends Biotechnol. 26 (6), 338-344 (2008).
  7. Mattix, B. M., et al. Janus magnetic cellular spheroids for vascular tissue engineering. Biomaterials. 35 (3), 949-960 (2014).
  8. Henstock, J., El Haj, A. Controlled mechanotransduction in therapeutic MSCs: can remotely controlled magnetic nanoparticles regenerate bones? Regen Med. 10 (4), 377-380 (2015).
  9. Fayol, D., et al. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Adv Mater. 25 (18), 2611-2616 (2013).
  10. Bartlett, W., et al. Autologous chondrocyte implantation versus matrix-induced autologous chondrocyte implantation for osteochondral defects of the knee: a prospective, randomised study. J Bone Joint Surg Br. 87 (5), 640-645 (2005).
  11. Batty, L., Dance, S., Bajaj, S., Cole, B. J. Autologous chondrocyte implantation: an overview of technique and outcomes. ANZ J Surg. 81, 18-25 (2011).
  12. Song, L., Baksh, D., Tuan, R. S. Mesenchymal stem cell-based cartilage tissue engineering: cells, scaffold and biology. Cytotherapy. 6 (6), 596-601 (2004).
  13. Boeuf, S., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells: role of tissue source and inducing factors. Stem Cell Res Ther. 1 (4), 31(2010).
  14. Kock, L., van Donkelaar, C. C., Ito, K. Tissue engineering of functional articular cartilage: the current status. Cell Tissue Res. 347 (3), 613-627 (2012).
  15. Schon, B. S., et al. Validation of a high-throughput microtissue fabrication process for 3D assembly of tissue engineered cartilage constructs. Cell Tissue Res. , (2012).
  16. Robert, D., et al. Magnetic micro-manipulations to probe the local physical properties of porous scaffolds and to confine stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1586-1595 (2010).
  17. Luciani, N., et al. Successful chondrogenesis within scaffolds, using magnetic stem cell confinement and bioreactor maturation. Acta Biomaterialia. 37, 101-110 (2016).
  18. Wilhelm, C., Gazeau, F. Universal cell labelling with anionic magnetic nanoparticles. Biomaterials. 29 (22), 3161-3174 (2008).
  19. Fayol, D., Luciani, N., Lartigue, L., Gazeau, F., Wilhelm, C. Managing magnetic nanoparticle aggregation and cellular uptake: a precondition for efficient stem-cell differentiation and MRI tracking. Adv Healthc Mater. 2 (2), 313-325 (2013).
  20. Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. Eur Biophys J. 31 (2), 118-125 (2002).
  21. Autissier, A., Le Visage, C., Pouzet, C., Chaubet, F., Letourneur, D. Fabrication of porous polysaccharide-based scaffolds using a combined freeze-drying/cross-linking process. Acta Biomater. 6 (9), 3640-3648 (2010).
  22. Singh, N., Jenkins, G. J. S., Asadi, R., Doak, S. H. Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Reviews. 1, (2010).
  23. Lee, J. H., Hur, W. Scaffold-free formation of a millimeter-scale multicellular spheroid with an internal cavity from magnetically levitated 3T3 cells that ingested iron oxide-containing microspheres. Biotechnol Bioeng. 111 (5), 1038-1047 (2014).
  24. Mattix, B., et al. Biological magnetic cellular spheroids as building blocks for tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10 (2), 623-629 (2014).
  25. Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
  26. Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
  27. Shimizu, K., Ito, A., Honda, H. Enhanced cell-seeding into 3D porous scaffolds by use of magnetite nanoparticles. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 77 (2), 265-272 (2006).
  28. Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine (Lond). 7 (9), 1425-1442 (2012).
  29. Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur Cell Mater. 13, 66-74 (2007).
  30. Takahashi, I., et al. Compressive force promotes sox9, type II collagen and aggrecan and inhibits IL-1beta expression resulting in chondrogenesis in mouse embryonic limb bud mesenchymal cells. J Cell Sci. 111 (14), 2067-2076 (1998).
  31. Campbell, J. J., Lee, D. A., Bader, D. L. Dynamic compressive strain influences chondrogenic gene expression in human mesenchymal stem cells. Biorheology. 43, 455-470 (2006).
  32. Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. J Orthop Res. 17 (1), 130-138 (1999).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

II

מאמרים קשורים