הערכה תפקודית של צומת עצב-שריר (NMJ) יכול לספק מידע חיוני על התקשורת בין שריר ועצב. כאן נתאר פרוטוקול להעריך באופן מקיף פונקציונליות NMJ והן שריר באמצעות שני תכשירים שריר-עצב שונים, קרי הסוליה-פציעה, דיאפרגמה-הסרעפת.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
צומת עצב-שריר (NMJ) פונקציונליות ממלא תפקיד מרכזי כשלמדתי מחלות בהן התקשורת בין נוירון מוטורי השריר הוא לקוי, כגון הזדקנות נוירודגנרטיביות (ALS). כאן נתאר טיפול נסיוני זה יכול לשמש כדי למדוד NMJ פונקציונליות על ידי שילוב של שני סוגים של גירוי חשמלי: ישיר שריר ממברנה גירוי, הגירוי דרך העצב. השוואת השריר בתגובה stimulations שונים שני אלה יכולים לעזור להגדיר, ברמה תפקודית, שינויים NMJ פוטנציאל להוביל לירידה תפקודית בשריר.
Ex vivo תכשירים מתאימים ללימודים ומבוקרות היטב. כאן נתאר פרוטוקול אינטנסיבית כדי למדוד את מספר הפרמטרים של שריר ופונקציונליות NMJ עבור הכנת עצב הסוליה-פציעה, הכנת עצב הסרעפת-הסרעפת. הפרוטוקול נמשך כ- 60 דקות, והוא מנוהל רציפה ותקינה של בעלי על-ידי מחוייט תוכנה המודדת את המאפיינים קינטיקה עווית הגומלין בתדר כוח עבור שריר וגם עצב stimulations, שני פרמטרים ספציפיים NMJ פונקציונליות, קרי עצבית כשל ועייפות intratetanic. מתודולוגיה זו נעשה שימוש כדי לזהות נזקים בהכנות עצב-שריר הסוליה והסרעפת באמצעות העכבר הטרנסגניים SOD1G93A , מודל ניסיוני של ALS זה ubiquitously overexpresses את חמצון מוטציה האנזימים סופראוקסיד דיסמוטאז 1 (SOD1).
מבוא
צומת עצב-שריר (NMJ) היא סינפסה כימית שהוקמה על ידי הקשר בין את motor endplate של סיבי השריר הדנדריטי לאקסון מוטור נוירון מסוף. NMJ הוכח לשחק תפקיד מכריע כאשר התקשורת בין שריר עצב הוא לקוי, כמו הזדקנות או נוירודגנרטיביות (ALS). כמו שריר ועצב לתקשר דו-כיוונית דרך1,2, היכולת למדוד פגמים NMJ בנפרד מן השריר פגמים עשויים לספק תובנות חדשות הגומלין physiopathological שלהם. אכן, הערכה תפקודית זו עשוי לעזור כדי להעריך אם שינויים מורפולוגיים או ביוכימי להפחית עצבית איתות פונקציונליות.
ההשוואה של שריר כויץ תגובה שהפיק גירוי עצבי ואת התגובה של אותו שריר עורר על ידי גירוי ישיר של הממברנה שלו הוצע כמו מדידה עקיפות של NMJ פונקציונליות. ואכן, מאז ממברנה גירוי על ידי עובר עצבית איתות, ייתכן ולשייך כל ההבדלים ביומן שתי התגובות כויץ לשינויים ב- NMJ. גישה זו יש בהרחבה תעצומ חולדות3,4,5,6,7, והוא משמש גם כדי לאסוף מידע על העכבר מודלים8,9,10,11,12.
כאן, אנו מתארים בפרוטרוט הליך בלו ולבדוק שני שריר-עצב ההכנות, כלומר את ההכנות הסוליה-פציעה, דיאפרגמה-הסרעפת. שימוש של מחוייט תוכנה, עיצבנו פרוטוקול בדיקה רציפה המשלבת את המדידה של מספר פרמטרים המאפיינות פונקציונליות NMJ והן שריר, ובכך מניב הערכה מקיפה של נזק NMJ בנפרד מזה של השריר. בפרט, הפרוטוקול מודד הכוח עווית, קינטיקה של שרירים, עקומת כוח-תדירות עבור ישיר, עצב stimulations, כשל עצבית13 פיטורים ואת התדרים tetanic, וגם את עייפות intratetanic7.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ניסויי בעלי החיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת Sapienza ברומא-היחידה להיסטולוגיה ומבריולוגיה רפואית, ובוצעו בהתאם לגרסה העדכנית של החוק האיטלקי להגנה על בעלי חיים.
1. הגדרה ניסיונית
- הקימו את המערכת הניסויית המורכבת מ-1 אקטיואטור/טרנסדוסר, 2 מעוררים, מכשיר שריר אחד in-vitro, אמבט רקמה להכנה אחת, אלקטרודת שאיבה אחת, אוסצילוסקופ דיגיטלי אחד, סטריאומקרוסקופ אחד, מאיר באור קר אחד, כרטיס רכישה אחד, בלוק מחברים ומחשב אישי.
הערה: כאן תוכנת הבקרה תוכנתה ב-LabView ותוכננה כדי להבטיח גמישות גבוהה, דיוק וחזרתיות של הגירויים. עבור כל גירוי, המשתמש יכול לבחור את רוחב הפולס, התדירות, המשך, ולהחליט אם הוא יועבר לממברנה או דרך העצב. המשתמש יכול גם לבחור את אורך תקופת המנוחה לפני כל גירוי.
2. הערכות של תכונות התכווצות ה-NMJ של שרי הסולאוס והסרעפת
- חימום המערכת
- הכינו את תמינת Krebs Ringer14 והניחו אותה באמבט של מכשיר הקיבוע ובאמבט הרקמות להכנה. הניחו צלחת בקוטר 60 mm המוכנה עם 4 ml של סיליקון באמבט הרקמות להכנה.
- הפעילו את אמבט המים במעגל סירקולציה וכווןו את הטמפרטורה ל-30 °C עבור שריר הסולאוס (soleus) ול-27 °C עבור שריר הסרעפת.
- אפשרו לתערובת של 95% O2 - 5% CO2 לזרום לשני האמבטים.
- הפעילו את המפעיל/מתמר (actuator/transducer) ואת שני מעוררי הפולסים וכוונו את ערכי הזרם ל-30 mA עבור גירוי ממברנה ול-5 mA עבור גירוי עצבי.
הערה: הוכח בעבר כי ערך זרם של 30 mA אינו גורם להתכווצות משמעותית של ענפי העצב כאשר D-tubocurarine מתווסף לתמיסה15. ערך הזרם של 5 mA תואם לכמות הזרם הדרושה לגירוי השריר דרך העצב מבלי ליצור חפיפה עם גירוי ממברנה המושרה באמצעות התמיסה. כיוון שהמרחק בין אלקטרודת היניקה לשריר תלוי באורך העצב, יש לכוון ערך זרם זה בקפידה לפני כל ניסוי, כפי שמתואר להלן.
- דיסקציה של הסולאוס והסרעפת
- בצעו השחאת עכבר באמצעות דיסלוקציה צווארית כדי למזער את הסבל, והוציאו מיד את השרירים לבדיקה באופן הבא.
- הכנה, דיסקציה והקמה של מודל סולאוס-עצב סיאטיקה
- רססו את רגלי העכבר ב-70% אתנול והסירו את העור המכסה את הרגל. בצעו חתך בחלק העליון של הרגל בעזרת מספריים ולאחר מכן משכו את העור בחוזקה. בודדו את גיד אכילס מהטיביה (tibia) ולאחר מכן גזרו את גיד אכילס בעזרת מספריים.
- תפסו את הגיד בחוזקה בעזרת פינצטה ומשכו בעדינות את שריר הגסטרוקנמיאוס (gastrocnemius) יחד עם הסולאוס. ברגע שהגיד הפרוקסימלי של הסולאוס נחשף, גזרו את כל השוק בעזרת מספריים תוך כדי החזקת גיד אכילס. הניחו מיד את דגימת הרקמה באמבט הרקמות להכנה.
- הניחו את אמבט ההכנה תחת מיקרוסקופ סטריאומטרי וקבעו את השוק לצלחת הסיליקון באמצעות סיכות פלדה אל-חלודה בקוטר 0.20 mm. בעזרת פינצטה תפסו את הגיד הפרוקסימלי של הסולאוס ומשכו אותו בעדינות כדי לחשוף את העצב הסיאטי.
- ברגע שהעצב נחשף (איור 1), הסירו בזהירות את הרקמה שמסביב כדי לחשוף כ-5 mm של העצב. השתמשו במספריים עדינות כדי לגזור את העצב. תוך כדי תפיסה חזקה של הסולאוס בגיד הפרוקסימלי בעזרת פינצטה, משכו אותו שוב והוציאו אותו על ידי גזירת גיד אכילס במספריים.
- השחילו חוט ניילון דרך החור של זרוע המנוף של המפעיל/מתמר. צרו לולאה בקצה החוט ותפסו את גיד אכילס לפני משיכת החוט חזרה עד שהשריר מגיע לאמבט של מכשיר הקיבוע. קבעו את הגיד הפרוקסימלי בתוך התפסן הקבוע וקשרו את חוט הניילון סביב זרוע המנוף. אפשרו לשריר להגיע לשיווי משקל בתמיסה.
- קבעו את האורך האופטימלי הראשוני (L0).
- ראשית, מתוחו את השריר כדי להחיל עליו עומס מוקדם של 10 mN (ערך זה מבטיח את כוח העקירה המקסימלי (על בסיס ניסיון)). לאחר מכן, מתוחו בעדינות את השריר כדי לשנות את העומס המוקדם ועוררו אותו בסדרת פולסים בודדים. האורך האופטימלי מושג כאשר נמדד כוח העקירה המקסימלי.
- הכנה, דיסקציה והקמה של מודל סרעפת-עצב פרני
- רסו את עור העכבר ב-70% אתנול. הסירו את העור המכסה את שריר הסרעפת על ידי ביצוע חתך מעל העצם הסטרנום (sternum) בעזרת מספריים ומשיכת העור בחוזקה.
- בעזרת מספריים, גזרו את הבטן באופן אופקי מתחת לסטרנום והסירו בעדינות את המעי והאיברים בעזרת פינצטה. השתמשו במספריים עבות כדי לגזור את עמוד השדרה.
- גזרו את הצלעות כ-1 cm מעל הסטרנום והמשיכו באופן אופקי. הסירו בעדינות את האיברים החיצוניים בעזרת פינצטה וגזרו את עמוד השדרה כדי לקבל טבעת עגולה של צלעות המכילה את הסרעפת.
- שטפו את ההכנה בצלחת המכילה תמינת Krebs Ringer ולאחר מכן הניחו אותה בצלחת הסיליקון בתוך אמבט הרקמות להכנה, כאשר הצד העליון פונה למעלה והסטרנום פונה קדימה.
- באמצעות המיקרוסקופ הסטריאומטרי, הסירו בזהירות את הריאות ואת שאר האיברים; העצב הפרני (phrenic nerve) יהיה גלוי בצד ימין (איור 2A).
- גזרו את הצלעות כך שתישאר טבעת של כ-2 mm לאורך כל הסרעפת.
- בעזרת פינצטה, קבעו סיכת פלדה אל-חלודה אחת בקוטר 0.20 mm על הגיד המרכזי של הסרעפת בנקודה התואמת לעצב הפרני, וסיכה נוספת על הצלעות באותו ציר כדי לזהות את רצועת הסרעפת הרלוונטית.
- קבעו שתי סיכות נוספות על הגיד המרכזי ושתי סיכות נוספות על הצלעות משני צדי הרצועה הנבחרת כדי לפרוס את הסרעפת. במידת הצורך, נקו את העצב הפרני מרקמת חיבור מסביבה בעזרת פינצטה.
- בעזרת להב מעוקל, גזרו את הסרעפת משני צידי העצב כדי לזהות רצועה של גיד-שריר-צלע כפי שמוצג ב-איור 2B.
- השחילו חוט ניילון דרך החור של זרוע המנוף של המפעיל/מתמר. צרו לולאה בקצה החוט ותפסו את הגיד לפני משיכת החוט חזרה עד שהשריר מגיע לאמבט של מכשיר הקיבוע.
- קבעו את הצלעות בתוך התפסן הקבוע וקשרו את חוט הניילון סביב זרוע המנוף.
- אפשרו לשריר להגיע לשיווי משקל בתמיסה וקבעו את האורך האופטימלי הראשוני (L0).
- מתוחו את השריר כדי להחיל עליו עומס מוקדם של 5 mN. מתוחו בעדינות את השריר כדי לשנות את העומס המוקדם ועוררו אותו בסדרת פולסים בודדים. האורך האופטימלי מושג כאשר נמדד כוח העקירה המקסימלי.
איור 1 - פרפרה של השריר הסולאוס ועצב השוק (Soleus-sciatic nerve). השריר הסולאוס ועצב השוק במהלך ניתוח לצורך בדיקות תפקודיות. עצב השוק נחשף באמצעות פינצטה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 - הכנה של הסספנות ועצב הסרעפת. התמונה מראה שלב של חילוץ הכנה של הסספנות ועצב הסרעפת (A) ואת הרצועה המיועדת להרכבה לצורך בדיקות תפקודיות (B). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
- מדידת תכונות ה-NMJ בנפרד מהכיווץ השרירי
- קבעו את עוצמת הזרם האופטימלית לגירוי דרך העצב וודאו שפולסי הזרם המועברים דרך אלקטרודת השאיבה אינם גורמים לכיווץ שריר עקב התפשטות הזרם באמבט.
- מקמו את אלקטרודת השאיבה סמוך לשריר ושאבו את העצב פנימה. תוך כדי העלאה מתונה של עוצמת הזרם (החל מ-5 mA), גריי את השריר בסדרת פולסים בודדים. ערך הזרם האופטימלי נקבע כאשר כוח העקירה (twitch force) הוא מקסימלי.
- דחפו את העצב החוצה מהאלקטרודה והעבירו מספר פולסים בודדים. ודאו שהשריר אינו מתכווץ עקב חפיפה עם גירוי הממברנה באמצעות התמיסה. שאבו את העצב שוב פנימה.
- הפעילו את התוכנה ובחרו את קובץ הקלט להרצת פרוטוקול הבדיקה הרצוי.
הערה: קובץ הקלט כולל את כל פרמטרי הגירוי הדרושים להרצת הפרוטוקול המלא. למרות שמשתמשים באותו מבנה פרוטוקול עבור שני השרירים, פרמטרי הגירוי שונים בהתאם לשאלה אם הפרוטוקול מתייחס לשריר הסולאוס (soleus) או לשריר הסרעפת (diaphragm).- גירוי סולאוס-עצב הסיאטיק (ראו טבלה 1)
- השתמשו ברוחבי הפולס הבאים עבור כל הגירויים החשמליים: 1.4 ms לגירוי עצב הסיאטיק ו-0.1 ms לגירוי ישיר של הסולאוס. הפרוטוקול המלא נמשך כ-65 דקות.
- גירוי סרעפת-עצב הפרניק (ראו טבלה 2)
- השתמשו ברוחבי הפולס הבאים עבור כל הגירויים החשמליים: 1.8 ms לגירוי עצב הפרניק ו-0.2 ms לגירוי ישיר של הסרעפת. הפרוטוקול המלא נמשך כ-55 דקות.
- בסיום הפרוטוקול הניסיוני, מדדו את האורך ואת המשקל הרטוב של השריר באמצעות פלר אנלוגי בדיוק של 0.05 mm ומאזניים מדויקים בדיוק של 0.1 mg, בהתאמה.
- חשבו את שטח החתך (CSA) על ידי חלוקת מסת השריר במכפלה של אורך הסיב האופטימלי (Lf) וצפיפות שריר שלד של יונקים (1.06 mg/mm3)16.
הערה: את Lf מקבלים על ידי הכפלת L0 ביחס אורך הסיב/אורך השריר (0.71 עבור שריר הסולאוס16 ו-1 עבור שריר הסרעפת17).
- חשבו את שטח החתך (CSA) על ידי חלוקת מסת השריר במכפלה של אורך הסיב האופטימלי (Lf) וצפיפות שריר שלד של יונקים (1.06 mg/mm3)16.
- גירוי סולאוס-עצב הסיאטיק (ראו טבלה 1)
- קבעו את עוצמת הזרם האופטימלית לגירוי דרך העצב וודאו שפולסי הזרם המועברים דרך אלקטרודת השאיבה אינם גורמים לכיווץ שריר עקב התפשטות הזרם באמבט.
| סוג הניסוי | שכיחות | משך זמן | חזרות | גירוי שרירים או עצבים | מטרה |
| (הרץ) | (ים) | ||||
| התכווצות (Twitch) | פולס בודד | 1 | שריר | כוח התכווצות (Twitch force) וקינטיקה | |
| מנוחה | 30 | ||||
| התכווצות שריר (Twitch) | פולס בודד | 1 | עצב | ||
| מנוחה | 30 | ||||
| התכווצות (Twitch) | פולס בודד | 1 | שריר | ||
| מנוחה | 30 | ||||
| התכווצות (Twitch) | פולס בודד | 1 | עצב | ||
| מנוחה | 120 | ||||
| טנוס לא-מחובר | 40 | 0.8 | 1 | עצב | עקומות כוח/תדר עבור גריי בצביעת עצבים ושרירים |
| מנוחה | 180 | ||||
| טנוס לא מחובר | 60 | 0.8 | 1 | שריר | |
| מנוחה | 180 | ||||
| טנוס ממוזג | 80 | 0.8 | 1 | עצב | |
| מנוחה | 180 | ||||
| טנוס לא-מחובר (Unfused tetanus) | 20 | 0.8 | 1 | שריר | |
| מנוחה | 180 | ||||
| טנוס לא מחובר | 60 | 0.8 | 1 | עצב | |
| מנוחה | 180 | ||||
| טנוס מודחק | 80 | 0.8 | 1 | שריר | |
| מנוחה | 180 | ||||
| טנוס לא מחובר | 20 | 0.8 | 1 | עצב | |
| מנוחה | 180 | ||||
| טנוס לא ממוזג | 40 | 0.8 | 1 | שריר | |
| מנוחה | 300 | ||||
| פרוטוקול עייפות | 35 | 0.8 | גירוי שריר אחד ולאחריו 14 גירויי עצב עם זמן מנוחה של 1.2 שניות לכל אחד, שחזרו 20 פעמים | כשל בהולכה עצבית (NF) | |
| מנוחה | 900 | ||||
| פרדיגמת עייפות | 80 | 0.8 | גירוי שריר אחד ולאחריו 14 גירויי עצב עם זמן מנוחה של 1.2 שניות לכל אחד, בחזרות של 20 פעמים | כשל בהעברה עצבית (NF) ועייפות תוך-טנית (IF) | |
טבלה 1 - פרוטוקול גירוי של עצב הסולאוס-סקיאטיקה (Soleus-sciatic nerve). הטבלה מפרטת את רצף הבדיקות המרכיבות את הפרוטוקול המלא לבדיקת תכשירי עצב סולאוס-סקיאטיקה.
| סוג הניסוי | תדירות | משך זמן | חזרות | גירוי שריר או עצב | מטרה |
| (Hz) | (s) | ||||
| כיווץ בודד (Twitch) | פולס בודד | 1 | שריר | כוח וקינטיקה של כיווץ בודד | |
| מנוחה | 30 | ||||
| כיווץ בודד (Twitch) | פולס בודד | 1 | עצב | ||
| מנוחה | 30 | ||||
| כיווץ בודד (Twitch) | פולס בודד | 1 | שריר | ||
| מנוחה | 30 | ||||
| כיווץ בודד (Twitch) | פולס בודד | 1 | עצב | ||
| מנוחה | 120 | ||||
| טנוס לא מאוחד (Unfused tetanus) | 60 | 0.5 | 1 | עצב | עקומות כוח/תדירות לגירויי עצב ושריר |
| מנוחה | 120 | ||||
| טנוס מאוחד (Fused tetanus) | 10 | 0.5 | 1 | שריר | |
| מנוחה | 180 | ||||
| טנוס לא מאוחד (Unfused tetanus) | 40 | 0.5 | 1 | עצב | |
| מנוחה | 120 | ||||
| טנוס לא מאוחד (Unfused tetanus) | 20 | 0.5 | 1 | שריר | |
| מנוחה | 120 | ||||
| טנוס לא מאוחד (Unfused tetanus) | 80 | 0.5 | 1 | עצב | |
| מנוחה | 150 | ||||
| טנוס לא מאוחד (Unfused tetanus) | 80 | 0.5 | 1 | שריר | |
| מנוחה | 150 | ||||
| טנוס לא מאוחד (Unfused tetanus) | 20 | 0.5 | 1 | עצב | |
| מנוחה | 120 | ||||
| טנוס מאוחד (Fused tetanus) | 10 | 0.5 | 1 | שריר | |
| מנוחה | 150 | ||||
| טנוס מאוחד (Fused tetanus) | 10 | 0.5 | 1 | עצב | |
| מנוחה | 180 | ||||
| טנוס לא מאוחד (Unfused tetanus) | 60 | 0.5 | 1 | שריר | |
| מנוחה | 30 | ||||
| פרוטוקול עייפות | 35 | 0.3 | גירוי שריר אחד ולאחריו 14 גירויי עצב עם זמן מנוחה של 0.67 s כל אחד, חוזר 20 פעמים | כשל בהולכה עצבית (NF) | |
| מנוחה | 90 | ||||
| פרוטוקול עייפות | 80 | 0.3 | גירוי שריר אחד ולאחריו 14 גירויי עצב עם זמן מנוחה של 0.67 s כל אחד, חוזר 20 פעמים | כשל בהולכה עצבית (NF) ועייפות תוך-טנית (IF) | |
טבלה 2 - פרוטוקול לגירוי של עצב הסרעפת-פרניקה. הטבלה מפרטת את רצף הבדיקות המהוות את הפרוטוקול המלא לבדיקת תכונות של תכשירים של עצב הסרעפת-פרניקה.
3. ניתוח נתונים
הערה: בסוף הפרוטוקול חשבו את כל הפרמטרים הרצויים באופן הבא.
- מגירוי פעימה בודדת
- חשבו את כוח העוודה (mN; הכוח הפעיל המקסימלי הנוצר במהלך עוודה) ואת כוח העוודה הסגולי (mN/mm^2)2חשבו זאת על ידי חיסור ערך עומס המוקדם (preload) הראשוני מהכוח המקסימלי שהופק על ידי השריר. חשבו את כוח העירור הסגולי ככוח העירור חלקי שטח החתך (CSA) של השריר.
- חשב את הזמן עד למתח השיא (TTP) (במילי-שניות) כזמן מרגע שחרור הדחף ועד לכוח התכווצות (twitch force).
- חשב את זמן חציית רפיית השריר (1/2RT) (במילישניות) כזמן מרגע הגעת כוח העוויתה (twitch force) עד להגעה ל-50% מכוח העוויתה.
- חשב את dF/dt (mN/ms) כערך המקסימלי של נגזרת הכוח במהלך שלב ההתכווצות.
- חשב את -dF/dt (mN/ms) כערך המקסימלי של נגזרת הכוח במהלך שלב ההרפיה.
- מגירויים של רצפי פולסים
- חשב כוח לא מותח (mN) וכוח סגולי לא מותח (mN/mm²)2חשבו זאת על ידי חיסור ערך העומס המקדים (preload) הראשוני מהכוח המקסימלי שהופק על ידי השריר. חשבו את הכוח הבלתי-מחובר הספציפי (specific unfused force) ככוח הבלתי-מחובר חלקי שטח החתך הרוחבי (CSA) של השריר.
הערה: הכוח הבלתי-ממוזג (unfused force) הוא הכוח הפעיל המקסימלי הנוצר במהלך רצף פולסים בתדר הנמוך מהתדר הטטני. - חשב את הכוח הטטני (mN) ואת הכוח הטטני הספציפי (mN/mm2); הכוח המקסימלי הוא הכוח הפעיל המקסימלי הנוצר במהלך רצף דחפים המועבר בתדר טטני. חשב אותו על ידי הפחתת ערך העומס המקדימי (preload) הראשוני מהכוח המקסימלי שהשריר ייצר. חשב את הכוח הטטני הספציפי כחלוקה של הכוח הטטני ב-CSA (שטח חתך) של השריר.
- חשבו את עקומת הכוח-תדר. שרטטו את ערך הכוח (או הכוח הסגולי) שהתקבל עבור כל גירוי אל מול תדר הגירוי העולה. בדרך כלל, העקומה מתחילה בגירוי של פולס בודד ומסתיימת בתדר הטטני.
- חשב כוח לא מותח (mN) וכוח סגולי לא מותח (mN/mm²)2חשבו זאת על ידי חיסור ערך העומס המקדים (preload) הראשוני מהכוח המקסימלי שהופק על ידי השריר. חשבו את הכוח הבלתי-מחובר הספציפי (specific unfused force) ככוח הבלתי-מחובר חלקי שטח החתך הרוחבי (CSA) של השריר.
- מתוך פרגדיימות של עייפות
- חשבו את כשל ההעברה העצבית (neurotransmission failure - NF) באופן הבא:
כאשר MF היא הירידה בכוח בעקבות גירוי שריר ו-F היא הירידה בכוח בעקבות גירוי עצב, שנמדדה ברכבת הפולסים הראשונה לאחר גירוי שריר. - חשב את העייפות האינטרטטנית (IF) באופן הבא:
כאשר Flp הוא הכוח שנוצר על ידי השריר בפעימה האחרונה של הגירוי, ו-Fמטריקה הוא הכוח המקסימלי שהשריר ייצר במהלך אותו רצף דחפים. בנוגע לגירוי העצבי, חשבו את העייפות האינטרטטנית (intratetanic fatigue) ברצף הדחפים הראשון מיד לאחר הגירוי הישיר.
- חשבו את כשל ההעברה העצבית (neurotransmission failure - NF) באופן הבא:
4. ניתוח סטטיסטי
הערה: יש לבחור את מודלי הניתוח הסטטיסטי בהתאם לשאלה האם התגובה השרירית לגירויי עצב וממברנה מושווית בתוך אותו מודל חיה או בין 2 מודלי חיות שונים18,19.
- השתמש במבחן t של Student עבור TTP, 1/2RT, dF/dt, -dF/dt כאשר משווים רק תגובות שריר לגירויים ישירים ועקיפים. אם משווים דגימות שריר שהתקבלו משני זני עכברים שונים, השתמש ב-2-way ANOVA כאשר סוג הגירוי וזן העכבר הם הגורמים הקבועים. כאשר ה-2-way ANOVA מניב תוצאה מובהקת, השתמש במבחני השוואות מרובות כדי לחפש הבדלים סטטיסטיים.
- עבור עקומת כוח-תדירות (במידה ומשווים רק תגובות שריר לגירויים ישירים ועקיפים), השתמש ב-2-way ANOVA כאשר סוג הגירוי ותדירות הגירוי הם הגורמים הקבועים. השתמש במבחני השוואות מרובות במידת הצורך.
- אם משווים דגימות שריר שהתקבלו משני זני עכברים שונים, השתמש ב-3-way ANOVA כאשר סוג הגירוי, תדירות הגירוי וזן העכבר הם הגורמים הקבועים.
- כאשר ה-3-way ANOVA מניב השפעה מובהקת של הגורמים זן החיה וסוג הגירוי, השתמש ב-2-way ANOVA כדי לזהות הבדלים מובהקים בין שתי קבוצות בכל פעם. לדוגמה, ניתן להעריך הבדלים בין תגובת השריר של שתי הקבוצות לגירוי ממברנה, או בין תגובת השריר לגירויים ישירים ועקיפים בתוך קבוצה אחת.
- אם משווים דגימות שריר שהתקבלו משני זני עכברים שונים, השתמש ב-3-way ANOVA כאשר סוג הגירוי, תדירות הגירוי וזן העכבר הם הגורמים הקבועים.
- עייפות תוך-טנית (Intratetanic fatigue)
הערה: מכיוון שהפרוטוקול תוכנן לגרום לעייפות בתגובה לגירוי עצבי גם בעכברי ביקורת, ניתן להשתמש בפרמטר זה רק לבדיקת הבדלים בין שני זני עכברים, ואנליזה סטטיסטית בתוך קבוצה אחת תניב תמיד הבדלים מובהקים.- להשוואה בין שתי קבוצות, השתמש ב-3-way ANOVA כאשר סוג הגירוי, הזמן וזן העכבר הם הגורמים הקבועים. כאשר ה-3-way ANOVA מניב השפעה מובהקת של הגורמים זן החיה וסוג הגירוי, השתמש ב-2-way ANOVA כדי לזהות הבדלים מובהקים בין שתי קבוצות בכל פעם, בדומה לעקומת כוח-תדירות.
- עבור כשל בהעברה עצבית (neurotransmission failure), השתמש ב-2-way ANOVA כאשר זן החיה והזמן הם הגורמים הקבועים. אם התוצאות מובהקות, השתמש במבחני השוואות מרובות כדי לחפש הבדלים סטטיסטיים.
הערה: מכיוון שפרמטר זה מניב ערך אחד בלבד עבור כל זן עכברים, הוא מאפשר השוואה בין מודלים שונים של עכברים. - עבור משקל השריר, אורכו ו-CSA, השתמש במבחן t של Student כדי לבדוק הבדלים בעת השוואת דגימות שריר-עצב ממודלים שונים של בעלי חיים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול שהסברנו מספק מידע על denervation פונקציונלי במספר מחלות נוירומוסקולריות או הזדקנות-sarcopenia. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לקבוע אם (, אם כן, באיזה רמה) שרירים המהווים עקב סלקטיבי שינויים המתרחשים בשריר עצמו או התמסורת neuromuscular. הנתונים המוצגים להלן הם תוצאה של עבודה קודמת מאת שלנו קבוצה18, שנערך על הדגם העכבר הטרנסגניים SOD1G93A של נוירודגנרטיביות בשלב הסופי של המחלה20. העכבר הטרנסגניים SOD1G93A overexpress...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול הניסוי המתואר לעיל מספק דרך אידיאלית של מדידת וברמת להפלות שינויים פונקציונליים שהתרחשו ישירות בשריר או בעקיפין צומת עצב-שריר. מאז טכניקה זו מבוססת על מדידה עקיפות של פונקציונליות NMJ, זה לא יכול לשמש כדי לקבוע אם כל פגם קשורה שינויים מורפולוגיים או שינויים ביוכימיים. לעומת זאת, הוא מספק דרך יעילה לקבוע אם שינויים מורפולוגיים או ביוכימי הפחיתו עצבית איתות פונקציונליות. עם זאת, לאחר השלמת כוח מדידות, השריר יכול להיות להסיר את האמבטיה, מחק, מוצמדת-האורך האופטימלי, מוקף מתחם ההטבעה, במהירות קפוא התכה איזופנטאן. השר...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
העבודה במעבדה של המחברים נתמכה על ידי רומא דל'אנג'לו ולהעניק הטלויזיונית (לא. GGP14066).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מערכת מנוף דו-מצבית | אורורה סיינטיפיק בע"מ | מפעיל/מתמר | 300B |
| ממריץ דו-פאזי בעוצמה גבוהה | אורורה סיינטיפיק בע"מ | 701B | (עצב) |
| ממריץ דו-פאזי בעל עוצמה גבוהה | אורורה סיינטיפיק בע"מ | 701C | (שריר) |
| מנגנון שרירים במבחנה | אורורה סיינטיפיק בע"מ | הכנה 800A | |
| Radnoti | 158400 | ||
| מערכות יניקה מונופולריות | A-M | 573000 | עם הפניה תוצרת בית |
| אוסצילוסקופ | Tektronix | TDS2014 | |
| סטריאומיקרוסקופ | Nikon | SMZ 800 | |
| תאורת אור קר | אופטיקה פוטונית | PL 3000 | |
| לוח רכישה | National Instruments NI | PCIe-6353 | |
| בלוק מחבר | National Instruments | NI 2110 | |
| מחשב אישי | AMD Phenom II x4 970 | מעבד 3.50 Ghz עם Windows 7 | |
| LabView 2012 תוכנה | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonate מאגר | סיגמא-אולדריץ' | K4002 | חיץ פיזיולוגי |
| נתרן ביקרבונט | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| סידן כלורי CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | נטול מים, אבקה, ≥ 97% |
| חוצץ HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥ 99.5% (טיטרציה) |
| כלים 60 מ"מ x 15 מ"מ | פלקון | 353004 | פוליסטירן |
| סיליקון | סילגארד | 184 סיליקון | ערכת אלסטומר 0.5 ק"ג. |
| תרמוסטט | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| משאבת | Newa Mini | MN 606 | לאקווריום |
| עמידות בחום Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| דלי | כל 10 ליטר | פוליפרופילן | |
| O2 + 5% | CO2 siad | ערבב גז | |
| #5 מלקחיים | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 פריטים |
| מספריים קפיצים - 8 מ"מ להבים | Fine Science Tools | 15024-10 | כריתת עצבים |
| מספריים חדים | כלים מדעיים | 14059-11 | הסרת שרירים |
| מספריים עדינים | Wagner | 02.06.32 | חיצוני של החיה |
| ידית אזמל סטודנט #3 | כלי מדע עדין | 91003-12 | |
| להבי אזמל #10 | כלים מדעיים עדינים | 10010-00 | |
| להבי אזמל #11 | כלים מדעיים | 10011-00 | |
| חוט ניילון ואוסלאש; 0.16 מ"מ | כל |
מקורות
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
- Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
- Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
- Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
- Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
- Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
- Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
- Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871(2008).
- Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
- Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
- Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
- Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
- Soliani, L. Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
- Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
