מאמר שיטה

מדידת פונקציונליות צומת עצב-שריר

DOI:

10.3791/55227

⸱

6 באוגוסט 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Sapienza University of Rome, 2Institute Pasteur Cenci-Bolognetti, DAHFMO-Unit of Histology and Medical Embryology, Sapienza University of Rome, 3Center for Life Nano Science@Sapienza, Istituto Italiano di Tecnologia

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערכה תפקודית של צומת עצב-שריר (NMJ) יכול לספק מידע חיוני על התקשורת בין שריר ועצב. כאן נתאר פרוטוקול להעריך באופן מקיף פונקציונליות NMJ והן שריר באמצעות שני תכשירים שריר-עצב שונים, קרי הסוליה-פציעה, דיאפרגמה-הסרעפת.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צומת עצב-שריר (NMJ) פונקציונליות ממלא תפקיד מרכזי כשלמדתי מחלות בהן התקשורת בין נוירון מוטורי השריר הוא לקוי, כגון הזדקנות נוירודגנרטיביות (ALS). כאן נתאר טיפול נסיוני זה יכול לשמש כדי למדוד NMJ פונקציונליות על ידי שילוב של שני סוגים של גירוי חשמלי: ישיר שריר ממברנה גירוי, הגירוי דרך העצב. השוואת השריר בתגובה stimulations שונים שני אלה יכולים לעזור להגדיר, ברמה תפקודית, שינויים NMJ פוטנציאל להוביל לירידה תפקודית בשריר.

Ex vivo תכשירים מתאימים ללימודים ומבוקרות היטב. כאן נתאר פרוטוקול אינטנסיבית כדי למדוד את מספר הפרמטרים של שריר ופונקציונליות NMJ עבור הכנת עצב הסוליה-פציעה, הכנת עצב הסרעפת-הסרעפת. הפרוטוקול נמשך כ- 60 דקות, והוא מנוהל רציפה ותקינה של בעלי על-ידי מחוייט תוכנה המודדת את המאפיינים קינטיקה עווית הגומלין בתדר כוח עבור שריר וגם עצב stimulations, שני פרמטרים ספציפיים NMJ פונקציונליות, קרי עצבית כשל ועייפות intratetanic. מתודולוגיה זו נעשה שימוש כדי לזהות נזקים בהכנות עצב-שריר הסוליה והסרעפת באמצעות העכבר הטרנסגניים SOD1G93A , מודל ניסיוני של ALS זה ubiquitously overexpresses את חמצון מוטציה האנזימים סופראוקסיד דיסמוטאז 1 (SOD1).

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צומת עצב-שריר (NMJ) היא סינפסה כימית שהוקמה על ידי הקשר בין את motor endplate של סיבי השריר הדנדריטי לאקסון מוטור נוירון מסוף. NMJ הוכח לשחק תפקיד מכריע כאשר התקשורת בין שריר עצב הוא לקוי, כמו הזדקנות או נוירודגנרטיביות (ALS). כמו שריר ועצב לתקשר דו-כיוונית דרך1,2, היכולת למדוד פגמים NMJ בנפרד מן השריר פגמים עשויים לספק תובנות חדשות הגומלין physiopathological שלהם. אכן, הערכה תפקודית זו עשוי לעזור כדי להעריך אם שינויים מורפולוגיים או ביוכימי להפחית עצבית איתות פונקציונליות.

ההשוואה של שריר כויץ תגובה שהפיק גירוי עצבי ואת התגובה של אותו שריר עורר על ידי גירוי ישיר של הממברנה שלו הוצע כמו מדידה עקיפות של NMJ פונקציונליות. ואכן, מאז ממברנה גירוי על ידי עובר עצבית איתות, ייתכן ולשייך כל ההבדלים ביומן שתי התגובות כויץ לשינויים ב- NMJ. גישה זו יש בהרחבה תעצומ חולדות3,4,5,6,7, והוא משמש גם כדי לאסוף מידע על העכבר מודלים8,9,10,11,12.

כאן, אנו מתארים בפרוטרוט הליך בלו ולבדוק שני שריר-עצב ההכנות, כלומר את ההכנות הסוליה-פציעה, דיאפרגמה-הסרעפת. שימוש של מחוייט תוכנה, עיצבנו פרוטוקול בדיקה רציפה המשלבת את המדידה של מספר פרמטרים המאפיינות פונקציונליות NMJ והן שריר, ובכך מניב הערכה מקיפה של נזק NMJ בנפרד מזה של השריר. בפרט, הפרוטוקול מודד הכוח עווית, קינטיקה של שרירים, עקומת כוח-תדירות עבור ישיר, עצב stimulations, כשל עצבית13 פיטורים ואת התדרים tetanic, וגם את עייפות intratetanic7.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת סאפיאנצה ברומא - היחידה להיסטולוגיה ואמבריולוגיה רפואית ובוצעו בהתאם לגרסה הנוכחית של החוק האיטלקי להגנת בעלי חיים.

1. מערך ניסיוני

  1. הגדר את המערכת הניסיונית המורכבת ממפעיל/מתמר אחד, 2 ממריצים, 1 מכשיר שרירים במבחנה, 1 אמבט רקמות מכין, 1 אלקטרודת יניקה, 1 אוסצילוסקופ דיגיטלי, 1 סטריאומיקרוסקופ, 1 תאורת אור קר, 1 לוח רכישה, 1 בלוק מחברים ומחשב אישי.< /> הערה: כאן תוכנת הפקודה תוכנתה ב-LabView ותוכננה להבטיח גמישות גבוהה, דיוק וחזרתיות של הגירויים. עבור כל גירוי, המשתמש יכול לבחור את רוחב הדופק, תדירותו, משך הזמן ולהחליט אם הוא מועבר לממברנה או דרך העצב. המשתמש יכול גם לבחור את משך תקופת המנוחה לפני כל גירוי.

2. הערכות של תכונות ההתכווצות NMJ של שרירי הסוליה והסרעפת

  1. חימום מערכת
    1. הכן את Krebs Ringer buffer14 והנח אותו באמבטיה של מנגנון ההרכבה ואמבט הרקמות המכין. מניחים צלחת 60 מ"מ שהוכנה עם 4 מ"ל סיליקון באמבט הרקמות המכין.
    2. הפעל את אמבט המים במחזור והגדר את הטמפרטורה ל-30 מעלות צלזיוס עבור שריר הסוליה ול-27 מעלות צלזיוס עבור שריר הסרעפת.
    3. אפשר לתערובת 95% O2 - 5% CO2 לזרום לשתי האמבטיות.
    4. הפעל את המפעיל/מתמר ואת שני ממריצי הדופק והגדר את הערכים הנוכחיים ל-300 mA לגירוי הממברנה ול-5 mA לגירוי עצבי.
      הערה: הוכח בעבר כי ערך הזרם של 300 mA אינו גורם להתכווצות משמעותית בענפי העצב כאשר D-tubocurarine מתווסף לתמיסה15. ערך הזרם של 5 mA תואם את כמות הזרם הנדרשת כדי לעורר את השריר דרך העצב מבלי ליצור חפיפה עם גירוי הממברנה המושרה באמצעות התמיסה. מכיוון שהמרחק בין אלקטרודת היניקה לשריר תלוי באורך העצב, יש להתאים בקפידה את הערך הנוכחי הזה לפני כל ניסוי, כמתואר להלן.
  2. דיסקציה של סולאוס וסרעפת
    1. הקריבו את העכבר על ידי פריקת צוואר הרחם כדי למזער את הסבל, וכרו מיד את השרירים לבדיקה כדלקמן.
    2. הכנה, דיסקציה והגדרה סולאוס-סיאטית
      1. רססו 70% אתנול על רגל העכבר והסירו את העור המכסה את הרגל. בצעו חתך בחלק העליון של הרגל בעזרת מספריים ולאחר מכן משכו את העור בחוזקה. בודדו את גיד אכילס מהשוק ולאחר מכן חתכו את גיד אכילס בעזרת מספריים.
      2. מהדקים היטב את הגיד בעזרת זוג מלקחיים ומושכים בעדינות את שריר הגסטרוקנמיוס יחד עם הסוליה. לאחר שהגיד הפרוקסימלי של הסוליה נחשף, חתכו את כל השוק במספריים תוך כדי אחיזת גיד אכילס. הניחו מיד את דגימת הרקמה באמבט הרקמות המכין.
      3. הניחו את אמבט ההכנה מתחת לסטריאומיקרוסקופ וקבעו את העגל לצלחת הסיליקון באמצעות סיכות נירוסטה בקוטר 0.20 מ"מ. בעזרת זוג מלקחיים מהדקים את הגיד הפרוקסימלי של הסוליה ומושכים אותו בעדינות כדי לחשוף את העצבוב הסיאטי.
      4. ברגע שהעצבוב נחשף (איור 1), הסירו בזהירות את הרקמה שמסביב כדי לחשוף כ-5 מ"מ מהעצב. השתמש במספריים עדינים כדי לחתוך את העצב. תוך כדי הידוק חזק של הסוליה על הגיד הפרוקסימלי בעזרת זוג מלקחיים, משוך אותו שוב וכרת אותו על ידי חיתוך גיד אכילס במספריים.
      5. העבירו חוט ניילון דרך החור של זרוע המנוף של המפעיל/מתמר. צור חבל בקצה החוט ותפס את גיד אכילס לפני שתמשוך את החוט לאחור עד שהשריר יגיע לאמבטיה של מנגנון ההרכבה. מהדקים את הגיד הפרוקסימלי בתוך המהדק הקבוע וקושרים את חוט הניילון סביב זרוע המנוף. אפשר לשריר להתאזן בתמיסה.
      6. קבע את האורך האופטימלי הראשוני (L0).
        1. ראשית, מתחו את השריר כדי לטעון אותו מראש ב-10 mN (ערך זה מבטיח את כוח העווית המרבי (בהתבסס על ניסיון)). לאחר מכן, מתחו בעדינות את השריר כדי לשנות את העומס המקדים ולעורר אותו בסדרה של פולסים בודדים. האורך האופטימלי מושג כאשר נמדד כוח העווית המרבי.
    3. הכנה, דיסקציה והגדרה של דיאפרגמה-פרנית
      1. ריססו 70% אתנול על עור העכבר. הסר את העור המכסה את שריר הסרעפת על ידי ביצוע חתך מעל עצם החזה בעזרת מספריים ועל ידי משיכת העור בחוזקה.
      2. בעזרת מספריים חותכים את הבטן אופקית מתחת לעצם החזה ומסירים בעדינות את המעי והאיברים בעזרת זוג מלקחיים. השתמש במספריים עבים כדי לחתוך את עמוד השדרה.
      3. חותכים את הצלעות כ -1 ס"מ מעל עצם החזה וממשיכים אופקית. הסר בעדינות את האיברים החיצוניים בעזרת זוג מלקחיים וחתוך את עמוד השדרה לקבלת טבעת צלעות עגולה המכילה את הסרעפת.
      4. שטפו את התכשיר בכלי המכיל את מאגר קרבס רינגר ולאחר מכן הניחו אותו בכלי הסיליקון בתוך אמבט הרקמות המכין, כשהצד העליון פונה כלפי מעלה ועצם החזה פונה קדימה.
      5. באמצעות הסטריאומיקרוסקופ, הסירו בזהירות את הריאות ואת האיברים הנותרים; העצב הפרני יהיה גלוי בצד ימין (איור 2A).
      6. חתוך את הצלעות כדי להשאיר טבעת של כ -2 מ"מ לאורך כל הסרעפת.
      7. בעזרת מלקחיים, קבע סיכת נירוסטה אחת בקוטר 0.20 מ"מ על הגיד המרכזי של הסרעפת בנקודה המתאימה לעצבוב העצב הפרני, וסיכה נוספת על הצלעות באותו ציר כדי לזהות את רצועת הסרעפת המעניינת.
      8. תקן שני סיכות נוספות על הגיד המרכזי ועוד שני סיכות על הצלעות משני צידי הרצועה שנבחרה כדי לפרוש את הסרעפת. במידת הצורך, יש לנקות את העצב הפרני מרקמת החיבור שמסביב באמצעות מלקחיים.
      9. בעזרת להב מעוקל, חותכים את הסרעפת משני צידי העצבוב כדי לזהות רצועת גיד-שריר-צלעות כפי שמוצג ב<מחלקה חזקה = "xfig">איור 2B.
      10. העבירו חוט ניילון דרך החור של זרוע המנוף של המפעיל/מתמר. צור חבל בקצה החוט ותפס את הגיד לפני משיכת החוט לאחור עד שהשריר מגיע לאמבטיה של מנגנון ההרכבה.
      11. מהדק את הצלעות בתוך המהדק הקבוע וקשר את חוט הניילון סביב זרוע המנוף.
      12. אפשר לשריר להתייצב בתמיסה ולקבוע את האורך האופטימלי הראשוני (L0).
        1. מתחו את השריר כדי לטעון אותו מראש ב-5 מ"ן. מתחו בעדינות את השריר כדי לשנות את העומס המקדים ולעורר אותו בסדרה של פולסים בודדים. האורך האופטימלי מושג כאשר נמדד כוח העווית המרבי.

figure-protocol-1
איור 1 - הכנת עצב סולאוס-סיאטיק. עצב סולאוס-סיאטי במהלך פעולה כירורגית לבדיקות התפקודיות. הסיאטיק נחשף באמצעות זוג מלקחיים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-2
איור 2 - הכנת עצב סרעפת-פרני. התמונה מציגה שלב של כריתת הכנת העצב הסרעפת-פרני (A) והרצועה שיש להרכיב לבדיקות תפקודיות (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

  1. מדידת תכונות NMJ בנפרד מהתכווצות השרירים
    1. הגדר את עוצמת הזרם הטובה ביותר עבור הגירוי דרך העצב וודא שפולסי הזרם המועברים דרך אלקטרודת היניקה אינם מעוררים התכווצות שרירים על ידי התפשטות הזרם באמבטיה.
      1. הנח את אלקטרודת היניקה ליד השריר ומשוך את העצב פנימה. תוך כדי הגדלת עוצמת הזרם בעדינות (החל מ- 5 mA), עורר את השריר בסדרה של פולסים בודדים. ערך הזרם האופטימלי נקבע כאשר כוח העווית הוא מקסימלי.
      2. דחוף את העצב החוצה מהאלקטרודה והעביר כמה פולסים בודדים. ודא שהשריר אינו מתכווץ עקב חפיפה עם גירוי הממברנה באמצעות התמיסה. משוך את העצב פנימה שוב.
    2. הפעל את התוכנית ובחר את קובץ הקלט כדי להפעיל את פרוטוקול הבדיקה הרצוי.
      הערה: קובץ הקלט כולל את כל פרמטרי הגירוי הדרושים להפעלת הפרוטוקול כולו. למרות שאותו מבנה פרוטוקול משמש לשני השרירים, פרמטרי הגירוי שונים בהתאם לפרוטוקול המתייחס לשרירי הסוליה או הסרעפת.
      1. גירוי עצבי סולאוס-סיאטי (ראה טבלה 1)
        1. השתמש ברוחב הדופק הבא עבור כל הגירויים החשמליים: 1.4 אלפיות השנייה לגירוי עצב סיאטי ו-0.1 אלפיות השנייה לגירוי ישיר של הסוליה. הפרוטוקול המלא נמשך כ-65 דקות.
      2. גירוי עצבי סרעפת-פרני (ראה טבלה 2)
        1. השתמש ברוחב הדופק הבא עבור כל הגירויים החשמליים: 1.8 אלפיות השנייה לגירוי עצבי פרני ו-0.2 אלפיות השנייה לגירוי ישיר של הסרעפת. הפרוטוקול המלא נמשך כ-55 דקות.
      3. בסוף פרוטוקול הניסוי, מדדו את אורך ומשקל השריר הרטוב באמצעות קליפר אנלוגי עם דיוק של 0.05 מ"מ וסולם דיוק עם דיוק של 0.1 מ"ג, בהתאמה.
        1. חשב את שטח החתך (CSA) על ידי חלוקת מסת השריר במכפלה של אורך סיבים אופטימלי (Lf) וצפיפות שריר השלד של יונקים (1.06 מ"ג/מ"מ3)16.
          הערה: Lf מתקבל על ידי הכפלת L0 ביחס אורך הסיבים/אורך השריר (0.71 עבור שריר הסוליה16 ו<1 עבור שריר הסרעפתsup class="xref">17).
סוג הניסויתדירותמשךחזרותגירוי שרירים או עצביםתכלית
(הרץ)(ש)
עוויתדופק יחיד1שרירכוח עווית וקינטיקה
מנוחה30
עוויתדופק יחיד1חוצפה
מנוחה30
עוויתדופק יחיד1שריר
מנוחה30
עוויתדופק יחיד1חוצפה
מנוחה120
טטנוס לא מאוחה400.81חוצפהעקומות כוח/תדר לגירוי עצבים ושרירים
מנוחה180
טטנוס לא מאוחה600.81שריר
מנוחה180
טטנוס מאוחה800.81חוצפה
מנוחה180
טטנוס לא מאוחה200.81שריר
מנוחה180
טטנוס לא מאוחה600.81חוצפה
מנוחה180
טטנוס מאוחה800.81שריר
מנוחה180
טטנוס לא מאוחה200.81חוצפה
מנוחה180
טטנוס לא מאוחה400.81שריר
מנוחה300
פרדיגמת עייפות350.81 גירוי שרירים ואחריו 14 גירויים עצביים עם זמן מנוחה של 1.2 שניות כל אחד, שחזרו על עצמם 20 פעמיםכשל בהולכה עצבית (NF)
מנוחה900
פרדיגמת עייפות800.81 גירוי שרירים ואחריו 14 גירויים עצביים עם זמן מנוחה של 1.2 שניות כל אחד, שחזרו על עצמם 20 פעמיםכשל בהולכה עצבית (NF) ועייפות אינטראטנית (IF)

טבלה 1 - פרוטוקול גירוי עצבי סולאוס-סיאטי הטבלה מפרטת את רצף הבדיקות המהוות את הפרוטוקול המלא לבדיקת תכשירים עצביים סוליים-סיאטיים.

סוג הניסויתדירותמשךחזרותגירוי שרירים או עצביםתכלית
(הרץ)(ש)
עוויתדופק יחיד1שרירכוח עווית וקינטיקה
מנוחה30
עוויתדופק יחיד1חוצפה
מנוחה30
עוויתדופק יחיד1שריר
מנוחה30
עוויתדופק יחיד1חוצפה
מנוחה120
טטנוס לא מאוחה600.51חוצפהעקומות כוח/תדר לגירוי עצבים ושרירים
מנוחה120
טטנוס מאוחה1000.51שריר
מנוחה180
טטנוס לא מאוחה400.51חוצפה
מנוחה120
טטנוס לא מאוחה200.51שריר
מנוחה120
טטנוס לא מאוחה800.51חוצפה
מנוחה150
טטנוס לא מאוחה800.51שריר
מנוחה150
טטנוס לא מאוחה200.51חוצפה
מנוחה120
טטנוס מאוחה1000.51שריר
מנוחה150
טטנוס מאוחה1000.51חוצפה
מנוחה180
טטנוס לא מאוחה600.51שריר
מנוחה300
פרדיגמת עייפות350.331 גירוי שרירים ואחריו 14 גירויים עצביים עם זמן מנוחה של 0.67 שניות כל אחד, שחזרו על עצמם 20 פעמיםכשל בהולכה עצבית (NF)
מנוחה900
פרדיגמת עייפות800.331 גירוי שרירים ואחריו 14 גירויים עצביים עם זמן מנוחה של 0.67 שניות כל אחד, שחזרו על עצמם 20 פעמיםכשל בהולכה עצבית (NF) ועייפות אינטראטנית (IF)

טבלה 2 - פרוטוקול גירוי עצבי דיאפרגמה-פרני. הטבלה מפרטת את רצף הבדיקות המהוות את הפרוטוקול המלא לבדיקת תכשירים עצביים סרעפתיים-פרניים.

3. ניתוח נתונים

הערה: בסוף הפרוטוקול חשב את כל הפרמטרים הרצויים כדלקמן.

  1. מגירוי דופק בודד
    1. חשב כוח עווית (mN; כוח פעיל מקסימלי שנוצר במהלך עווית) וכוח עווית ספציפי (mN/mm2). חשב אותו על ידי הפחתת ערך העומס הראשוני לכוח המרבי שנוצר על ידי השריר. חשב את כוח העווית הספציפי ככוח עווית חלקי CSA של השריר.
    2. חשב את הזמן לשיא המתח (TTP) (ms) כזמן משחרור הדופק לכוח העווית.
    3. חשב חצי זמן הרפיה (1/2RT) (ms) כזמן מכוח העווית ל-50% מכוח העווית.
    4. חשב dF/dt (mN/ms) כערך המקסימלי של נגזרת הכוח במהלך שלב ההתכווצות.
    5. חשב -dF/dt (mN/ms) כערך המקסימלי של נגזרת הכוח במהלך שלב ההרפיה.
  2. מגירויים של רכבת דופק
    1. חשב כוח לא מותך (mN) וכוח לא מותך ספציפי (mN/mm2). חשב אותו על ידי הפחתת ערך העומס הראשוני לכוח המרבי שנוצר על ידי השריר. חשב את הכוח הלא מותך הספציפי ככוח הלא מותך חלקי השריר CSA.
      הערה: הכוח הבלתי מותך הוא הכוח הפעיל המרבי שנוצר במהלך רכבת דופק בתדר נמוך מתדר הטטניק.
    2. חשב כוח טטני (mN) וכוח טטני ספציפי (mN/mm2); הכוח המרבי הוא הכוח הפעיל המקסימלי שנוצר במהלך רכבת פולסים המועברת בתדר טטניק. חשב אותו על ידי הפחתת ערך העומס הראשוני לכוח המרבי שנוצר על ידי השריר. חשב את הכוח הטטני הספציפי ככוח הטטני חלקי CSA של השריר.
    3. חשב עקומת כוח-תדר. שרטט את ערך הכוח (או הכוח הספציפי) המתקבל עבור כל גירוי לעומת התדירות ההולכת וגדלה של הגירוי. בדרך כלל, זה מתחיל בגירוי הדופק הבודד ומסתיים בתדר הטטניק.
  3. מפרדיגמות עייפות
    1. חשב כשל בהולכה עצבית (NF) כ:
      figure-protocol-3
      כאשר MF היא ירידת הכוח בעקבות גירוי השרירים ו-F היא ירידת הכוח בעקבות גירוי עצבי, הנמדדת ברכבת הדופק הראשונה לאחר גירוי השרירים.
    2. חשב עייפות אינטררטנית (IF) כ:
      figure-protocol-4
      כאשר Flp הוא הכוח שנוצר על ידי השריר בדופק האחרון של הגירוי, ו- Fm הוא הכוח המרבי שנוצר על ידי השריר במהלך אותה רכבת דופק. לגבי הגירוי העצבי, חשב את העייפות האינטרטנית ברכבת הדופק הראשונה מיד לאחר הגירוי הישיר.

4. ניתוח סטטיסטי

הערה: יש לבחור את מודלי הניתוח הסטטיסטי בהתאם להשוואה בין תגובת השרירים לגירוי עצבי וממברנה באותו מודל של בעלי חיים או בין 2 מודלים שונים של בעלי חיים18,19.

  1. השתמש במבחן t של הסטודנט עבור TTP, 1/2RT, dF/dt, -dF/dt אם משווים רק תגובות שרירים לגירויים ישירים ועקיפים. אם משווים תכשירי שרירים המתקבלים מ-2 זני עכברים שונים, השתמש ב-ANOVA דו-כיווני עם סוג גירוי ומתח עכבר כגורמים קבועים. כאשר ה-ANOVA הדו-כיווני מחזיר תוצאה משמעותית, השתמש במבחני השוואה מרובים כדי לחפש הבדלים סטטיסטיים.
  2. עבור עקומת כוח-תדר (אם משווים רק תגובות שרירים לגירויים ישירים ועקיפים), השתמש ב-ANOVA דו-כיווני עם סוג הגירוי ותדירות הגירוי כגורמים קבועים. השתמש בבדיקות השוואה מרובות במידת הצורך.
    1. אם משווים תכשירי שרירים המתקבלים מ-2 זני עכברים שונים, השתמש ב-ANOVA תלת-כיווני עם סוג הגירוי, תדירות הגירוי ומתח העכבר כגורמים קבועים.
      1. כאשר ה-ANOVA התלת-כיווני מניב השפעה משמעותית של הגורמים מתח בעלי חיים וסוג גירוי, השתמש ב-ANOVA דו-כיווני כדי לזהות הבדלים משמעותיים בין 2 קבוצות בכל פעם. לדוגמה, ניתן להעריך הבדלים בין תגובת השרירים של 2 הקבוצות לגירוי ממברנה, או בין תגובת השרירים לגירויים ישירים ועקיפים בתוך קבוצה אחת.
  3. עייפות אינטרטנית
    הערה: מכיוון שהפרוטוקול תוכנן לגרום לעייפות בתגובה לגירוי עצבי אפילו בעכברי ביקורת, ניתן להשתמש בפרמטר זה רק כדי לחקור הבדלים בין 2 זני עכברים, וניתוח סטטיסטי בתוך קבוצה אחת תמיד יניב הבדלים משמעותיים.
    1. כדי להשוות בין שתי קבוצות, השתמש ב-ANOVA תלת-כיווני עם סוג גירוי, זמן ועומס עכבר כגורמים קבועים. כאשר ה-ANOVA התלת-כיווני מניב השפעה משמעותית של הגורמים מתח בעלי חיים וסוג גירוי, השתמש ב-ANOVA דו-כיווני כדי לזהות הבדלים משמעותיים בין 2 קבוצות בכל פעם, כמו עבור עקומת הכוח-תדר.
  4. עבור כשל בהולכה עצבית, השתמש ב-ANOVA דו-כיווני עם מתח וזמן של בעלי חיים כגורמים קבועים. אם הוא מחזיר תוצאות משמעותיות, השתמש בבדיקות השוואה מרובות כדי לחפש הבדלים סטטיסטיים.
    הערה: מכיוון שפרמטר זה מחזיר ערך אחד בלבד עבור כל זן עכבר, הוא מאפשר להשוות בין דגמי עכבר שונים.
  5. עבור משקל שריר, אורך ו-CSA, השתמש במבחן t של סטודנט כדי לחקור הבדלים בעת השוואת תכשירים של שריר-עצב ממודלים שונים של בעלי חיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול שהסברנו מספק מידע על denervation פונקציונלי במספר מחלות נוירומוסקולריות או הזדקנות-sarcopenia. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לקבוע אם (, אם כן, באיזה רמה) שרירים המהווים עקב סלקטיבי שינויים המתרחשים בשריר עצמו או התמסורת neuromuscular. הנתונים המוצגים להלן הם תוצאה של עבודה קודמת מאת שלנו קבוצה18, שנערך על הדגם העכבר הטרנסגניים SOD1G93A של נוירודגנרטיביות בשלב הסופי של המחלה20. העכבר הטרנסגניים SOD1G93A overexpress...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול הניסוי המתואר לעיל מספק דרך אידיאלית של מדידת וברמת להפלות שינויים פונקציונליים שהתרחשו ישירות בשריר או בעקיפין צומת עצב-שריר. מאז טכניקה זו מבוססת על מדידה עקיפות של פונקציונליות NMJ, זה לא יכול לשמש כדי לקבוע אם כל פגם קשורה שינויים מורפולוגיים או שינויים ביוכימיים. לעומת זאת, הוא מספק דרך יעילה לקבוע אם שינויים מורפולוגיים או ביוכימי הפחיתו עצבית איתות פונקציונליות. עם זאת, לאחר השלמת כוח מדידות, השריר יכול להיות להסיר את האמבטיה, מחק, מוצמדת-האורך האופטימלי, מוקף מתחם ההטבעה, במהירות קפוא התכה איזופנטאן. השר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה במעבדה של המחברים נתמכה על ידי רומא דל'אנג'לו ולהעניק הטלויזיונית (לא. GGP14066).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מערכת מנוף דו-מצבית אורורה סיינטיפיק בע"ממפעיל/מתמר300B
ממריץ דו-פאזי בעוצמה גבוהה אורורה סיינטיפיק בע"מ701B(עצב)
ממריץ דו-פאזי בעל עוצמה גבוהה אורורה סיינטיפיק בע"מ701C(שריר)
מנגנון שרירים במבחנה אורורה סיינטיפיק בע"מהכנה 800A
Radnoti158400
מערכות יניקה מונופולריותA-M573000עם הפניה תוצרת בית 
אוסצילוסקופ TektronixTDS2014
סטריאומיקרוסקופNikonSMZ 800
תאורת אור קר אופטיקה פוטוניתPL 3000
לוח רכישהNational Instruments NIPCIe-6353
בלוק מחברNational InstrumentsNI 2110
מחשב אישיAMD Phenom II x4 970מעבד 3.50 Ghz עם Windows 7
LabView 2012 תוכנהNational Instruments
Krebs-Ringer Bicarbonate מאגר סיגמא-אולדריץ'K4002 חיץ פיזיולוגי
נתרן ביקרבונטSigma-AldrichS5761 
סידן כלורי CaCl2Sigma-AldrichC4901נטול מים, אבקה, ≥ 97%
חוצץ HEPESSigma-AldrichH3375≥ 99.5% (טיטרציה)
כלים 60 מ"מ x 15 מ"מפלקון353004פוליסטירן
סיליקוןסילגארד 184 סיליקון ערכת אלסטומר  0.5 ק"ג.
תרמוסטטDennerleDigitalDuomat 1200
משאבתNewa MiniMN 606לאקווריום
עמידות בחום ThermocableLucky Reptile61403-150/60Hz 50W
דליכל 10 ליטרפוליפרופילן
O2 + 5%CO2 siadערבב גז
#5 מלקחיים Fine Science Tools11252-202 פריטים
מספריים קפיצים - 8 מ"מ להביםFine Science Tools15024-10כריתת עצבים
מספריים חדים כלים מדעיים 14059-11הסרת שרירים
מספריים עדיניםWagner02.06.32חיצוני של החיה
ידית אזמל סטודנט #3כלי מדע עדין 91003-12 
להבי אזמל #10כלים מדעיים עדינים  10010-00
להבי אזמל #11כלים מדעיים 10011-00
חוט ניילון ואוסלאש; 0.16 מ"מכל
ממריץ דופק ממריץ דופק אמבט רקמות

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
  2. Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
  3. Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
  4. Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
  5. Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
  6. Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
  7. Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
  8. Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
  9. Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
  10. Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871(2008).
  11. Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
  12. Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
  13. Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
  14. Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
  15. Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
  16. Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
  17. Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
  18. Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
  19. Soliani, L. Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
  20. Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Neuromuscular Junction FunctionalityElectrical StimulationEx Vivo PreparationSoleus Sciatic NerveDiaphragm Phrenic NerveForce Frequency RelationshipNeurotransmission FailureIntratetanic FatigueTwitch Kinetics PropertiesSOD1 G93A Mouse

מאמרים קשורים