מאמר שיטה

תכנות מחדש מותנה של תאי אפיתל ושט האדם Pediatric לשימוש בהנדסת רקמות וחקירת מחלות

DOI:

10.3791/55243

⸱

22 במרץ 2017

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, UConn Health, 2Department of Gastroenterology, Connecticut Children's Medical Center, 3Department of Surgery, Connecticut Children's Medical Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הרחבת תאי אפיתל ושט ילדים אנושיים ניצול תכנות מחדש מותנה מספקת חוקרים עם אוכלוסיית חולים ספציפיים של תאים שיכולים להיות מנוצלת עבור הנדסת בונת ושט להשתלה אוטולוגית לטיפול פגמים או פציעה ומגיש כמאגר מבחני מיון טיפוליים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהוי והרחבה של תאים ספציפיים לחולה בתרבית לשימוש בהנדסת רקמות וחקירת מחלות יכול להיות מאתגר מאוד. שימוש בסוגים שונים של תאי גזע כדי להפיק סוגי תאים מעניינים הוא לרוב יקר, גוזל זמן ומאוד לא יעיל. יתר על כן, יש להסיר סוגי תאים לא רצויים לפני השימוש במקור תאים זה, מה שדורש שלב נוסף בתהליך. על מנת להשיג מספיק תאי אפיתל בוושט כדי להנדס את לומן של מבנה הוושט או לסנן גישות טיפוליות לטיפול במחלות וושט, יש להרחיב את תאי האפיתל של הוושט המקומיים מבלי לשנות את ביטוי הגנים או הפנוטיפ שלהם. תכנות מחדש מותנה של רקמת האפיתל של הוושט מציע גישה מבטיחה להרחבת תאי אפיתל הוושט הספציפיים למטופל. יתר על כן, אין צורך למיין או לטהר תאים אלה ויחזרו למצב אפיתל בוגר לאחר הסרתם מתרבית תכנות מחדש מותנית. טכניקה זו תוארה במחקרי סקר סרטן רבים ומאפשרת התרחבות בלתי מוגבלת של תאים אלה על פני מספר מעברים. היכולת לבצע בדיקות סקר של הוושט תעזור לחולל מהפכה בטיפול במחלות וושט בילדים כמו דלקת הוושט האאוזינופילית על ידי זיהוי מנגנון הטריגר הגורם לתסמינים של המטופל. עבור אותם חולים הסובלים ממום מולד, מחלה או פגיעה בוושט, מקור תאים זה יכול לשמש כאמצעי לזרוע מבנה סינטטי להשתלה לתיקון או החלפת האזור הפגוע.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנדסת רקמות בושט דלקת ושט אאוזינופילית (EOE) הייתה במוקד המחקר במעבדות רבות בעשור האחרון. מומים מולדים, כגון atresia ושט, נראים כ 1 ב -4,000 לידה חייה, שתוצאתה הפיתוח השלם של הוושט המוביל את חוסר היכולת לאכול 1. שכיחות ושכיחות EOE היו במגמת עלייה מאז זיהוי של הישות המחלה בשנת 1993. תחולת EOE נע בין 0.7 כדי 10 / 100,000 לנפש שנים והשכיחות נע מ -0.2 כדי 43 / 100,000 2. גישה כירורגית אטרקטיבית חדשה בטיפול atresia ושט פער ארוך מורכבת ביצירת מבני רקמות להשתלת ניצול התא של החולה עצמו. תאים אלה בשיתוף עם פיגומים סינטטיים יפיקו מבנה עצמי שאינו דורש דיכוי מערכת חיסוני. חלק מהקבוצות כבר החלו לחקור את לנודואר של תאים דמויי גזע עבור הנדסת רקמות ושט 3 וכן שימוש בתאי אפיתל ושט יליד לאכלס מחדש את הרירית 4 - 7. מחלות שנמצאים הוושט של מטופלים ילדים הם לעתים קרובות קשה לאבחן או ללמוד ללא התערבות. יתר על כן, מודלים של בעלי חיים תוך ניצול או במבחנה הנציחו מודלי שורת תאים למחל ילדים כמו EOE לא להקיף את בהיווצרות המחלה המדויקת או הבדלים מסוימים חולה 8. לכן, היכולת ללמוד תהליך מחלתו של מטופל במבחנה כדי לזהות אנטיגנים מפעילים מחלה ספציפי, להעריך מנגנונים ולחקור טיפולים תרופתיים יהיה רומן ולספק לרופאים עם מידע שיכול לסייע בטיפול בחולה.

היו הרבה סוגי תאים עצמיים או חולה ספציפי כי הוצעו לשימוש tissuהנדסת דואר ולומד בהיווצרות מחלה אנושית. עם זאת, חלק של סוגי תאים אלו מוגבלים ביכולת שלהם לייצר מספיק תאים של פנוטיפ ספציפי זרע פיגום גדול או לבצע העברת נתונים גבוהות במבחנה. השימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים או מולטיפוטנטיים כבר נושא לדיון מחקר רב, עם זאת, מגבלות וליקויים עבור באמצעות תאים אלה כבר היטיב לתאר 9. השימוש בתאי גזע עובריים אנושיים הוא התווכח מאוד ומציג שאלות אתיות רבות. והחשוב מכל, תאים אלה יוצרים teratomas, דומי גידול, אם הם אינם מובחנים מן פלוריפוטנטיים מדינתם לפני מתן אותם שורת חיים 10. יתר על כן, השימוש בתאי גזע עובריים לא יהיה חולה ספציפי ויכול לעורר תגובה אלוגנאית וצורך דיכוי מערכת חיסוני 10. תאי גזע מושרים (iPSCs) הם תאים פלוריפוטנטיים שיכולהלהיות שמקורם בתאים עצמו חולה. תאים סומטיים, כגון תאי עור, יכולים להיגרם למדינה פלוריפוטנטיים תוך שימוש במגוון של טכניקות אינטגרטיבית בלתי משתלבות. תאים אלה לשמש מקורות תא ספציפי לחולה עבור הנדסת רקמות או חקירת מחלה. השילוב של חומר גנטי לא רצוי לתוך התאים אלה הוא דאגה רבה תארה וגם אם רצפים הם הוסרו לחלוטין iPSCs להופיע לשמר אפיגנטיים "זיכרון" לקראת סוג התא שממנו הם נגזרו 11. תאים אלה גם יהוו teratomas in vivo אם לא הבדיל לפני ההשתלה 11. פרוטוקולי בידול רבים נחקרו התמקדות שושלות אפיתל 12, 13, 14, לעומת זאת, חשוב מאוד לציין כי סוגי התא וכתוצאה מכך בסוף הבידול אינם עשויים מקשה אחת ו- Only להחזיק חלק מן סוג התא של עניין. התוצאה היא תשואה נמוכה והצורך לטהר את סוג התא הרצוי. למרות iPSCs הוא מקור תא חולה ספציפי פוטנציאל, התהליך כדי לקבל סוג תא של עניין עבור הנדסה או רקמות או חקירת מחלה הוא מאוד לא יעיל.

תאי אפיתל אדם בודדו בהצלחת ממגוון הוא לרקמות חולות ולא חולה בגוף האדם כולל: ריאות 15, שד 16, מעי דק 17, מעי גס 18, שלפוחית שתן 19 ו -20 ושט. חשוב לציין כי תאים ראשוניים אדם יש מספר סופי של הקטעים שבהם הפנוטיפ נשמר 21, 22. למרבה הצער, זה אומר כי מספר התאים הדרושים לחקירת מחלה או זריעת פיגום מהונדסלהשתלה לא יכול להיות מושגת. לכן, טכניקות חדשות נדרשות להרחיב תאי מטופל, תוך שמירה על פנוטיפ אפיתל. תכנות מחדש מותנה של תאי אפיתל תקינים ותאי סרטן ניצול מזין תאים ו מעכב ROCK תוארה בשנת 2012 על ידי Liu et al. 2 3. טכניקה זו נוצלה כדי להרחיב לתאי האפיתל סרטניים המתקבלים ביופסיות של סרטן הערמונית וסרטן השד באמצעות תאי מזין מוקרנים, מעכב ROCK ובינוני תכנות מחדש על תנאי. המטרה היתה לייצר תאים מספיק עבור מבחני חוץ גופית כגון הקרנת סמים. טכניקה זו מסוגלת הרחבת תאי אפיתל ללא הגבלת זמן על ידי "תכנות מחדש" של תאים אלה גבעול או המדינה- כמו אבי, שהוא שגשוג מאוד. הוכח כי התאים האלה הם בלתי tumorigenic ואינם בעלי יכולת לגבש teratomas 23, 24. יתר על כן, לאפגמים בכרומוזומים או מניפולציות גנטיות נכחו לאחר passaging תאים אלה בתרבות באמצעות טכניקה זו 23, 24. והחשוב מכל, תאים אלה הם רק מסוגלים להתמיין לסוג תא יליד העניין. לכן, טכניקה זו מציעה מאגר גדול של תאי אפיתל מטופל ספציפי לחקירת מחלה או הנדסת רקמות ללא צורך הנצחה.

קבלת רקמות אפיתל מאיבר מסוים על מנת ללמוד תהליכי מחלה עשויה להיות מצומצמת ולא תמיד אפשרית בשל סיכון מטופל. עבור אותם חולים הסובלים ממחלת ושט או פגמים, תחזור ביופסיה אנדוסקופית היא גישה פולשנית להשגת רקמת אפיתל שניתן ניתקת לתכנות מחדש על התנאי לספק מקור תא מוגדר ספציפי הרירי של אותו הוושט חולה. אז זה מאפשר ללימודי חוץ גופיתשל תאי אפיתל להעריך תהליכי מחלה ומסך עבור הרפוי פוטנציאלי. תהליך המחלה אחד שיכול להפיק תועלת רבה מן גישה זו היא דלקת ושט אאוזינופילית, אשר תוארה מחלות אלרגיות של הוושט 8. בדיקות אלרגיה כמו גם גישות טיפוליות ניתן היה להעריך במבחנה תוך שימוש בתאי האפיתל של החולה עצמו ונתונים אלה לאחר מכן ניתן עברו על הרופא המטפל לפתח תוכניות טיפול אישיות. הטכניקה של תכנות מחדש מותנה בשיתוף עם קבלת ביופסיות אנדוסקופיות מחולי ילדים מציעה את היכולת להרחיב את תאי אפיתל ושט נורמלים ללא הגבלה זמן מכל חולה. מקור תא זה יכול אפוא להיות חבריו בפיגום טבעי או סינטטי לספק אפשרות כירורגית מטופל ספציפי עבור פגמים, מחלה או טראומה. לאחר מספר תאים בלתי מוגדר יעזור להנדס בונת ושט המשתלטת על reseeded לחלוטיןלומן עם תאי אפיתל הוושט כדי לעזור להקל על התחדשות של תאים מסוגים הנותרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביופסיות ושט התקבלו לאחר הסכמה מהדעת התקבלה ההורים / אפוטרופוסים של מטופלי ילדים ובהתאם לוח הסקירה מוסדי (IRB # 13-094).

פתרון 1. מכשירי חיטוי לטין

  1. מלקחי חיטוי, סכיני גילוח ומספרי לפני טיפול רקמות על מנת למנוע זיהום.
  2. כדי להפוך 200 מ"ל של תמיסת הג'לטין 0.1%, לשלב 200 מ"ל מים מזוקקים עם 0.2 גרם של ג'לטין. חיטוי וקריר לפני שימוש.

2. תרבות צלחות רקמות ציפוי

  1. כ 2 שעות לפני בידוד תא, להוסיף מספיק 0.1% ג'לטין לכסות צלחת בתרבית רקמה (100 מ"מ) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס חממה תרבית תאים.
    הערה: אלה צלחות יכולות גם להתבצע מראש והמשיכו בחממה לפני השימוש.

3. ביצוע פתרון אנזימים עבור דיסוציאציה

  1. כ -30 דקות לפני בידוד תא, לשקול את10 יחידות של dispase על איזון על בסיס יחידות לכל ריכוז מיליגרם על הבקבוקון. מניחים את אבקת צינור חרוטי 15 מ"ל עם 10 מ"ל של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) ומניחים באמבט מים C ° 37.

4. Cell ביצוע בינוני תרבות

  1. כדי להפוך 50 מ"ל של מדיום תכנות מחדש מותנה, לערבב את החומרים הבאים לתוך צינור חרוטי סטרילי: 35 מ"ל של F12 (בינוני של Ham), 11.5 מ"ל של DMEM, 0.5 מ"ל של L- גלוטמין, 0.5 מ"ל של 100x פניצילין / סטרפטומיצין, 2.5 מ"ל של בסרום שור העובר (FBS), 250 מיקרוגרם של אינסולין אנושי, 500 ננוגרם של גורם הגדילה באפידרמיס האדם (EGF).
  2. כדי להפוך 500 מ"ל של 3T3 בינוני, לערבב 50 מ"ל של FBS, 5 מ"ל של 100x פניצילין / סטרפטומיצין ו 5 מ"ל של L- גלוטמין עם 500 מ"ל של DMEM.
  3. כדי להפוך 500 מ"ל של מדיום סרום ללא keratinocyte, להפשיר EGF ותמצית יותרת המוח שור (BPE) תוספי מזון (מסופק עם התקשורת). מוסיפים את ונספחי בקבוק מ"ל 500 של המדיום בסיס ולהוסיף 5 מ"ל של 10פניצילין 0x / סטרפטומיצין

5. Culturing ו irradiating 3T3 תאים כמקור מזין

  1. הכן בינוני 3T3, המהווים DMEM, 10% FBS, 1x פניצילין / סטרפטומיצין ו -2 מ"מ L- גלוטמין.
  2. תרבות 3T3 תאי צלוחיות רקמות שטופלו T-75 לפחות 3 ימים לפני ההגעה של דגימות חולות.
    1. זמן קצר לפני הגעתו של דגימות חולות, trypsinize 3T3 תאים באמצעות 5 מיליליטר של 0.25% טריפסין- EDTA לכל בקבוק לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות או עד שרוב התאים צפו
  3. הוסף 5 מ"ל של 3T3 בינוני כדי לעצור את התגובה. לשאוב את ההשעיה תא ולהעביר צינור חרוטי 15 מ"ל. ספין במשך 5 דקות ב g 300 x.
  4. לשאוב הבינוני resuspend תאים בנפח מוגדר של כחול Trypan עבור ספירת תאים. שלב 10 μL של תאים עם 10 μL של Trypan כחול להוציא תאים מתים. טען 10 μL של פתרון זה על hemocytometer עבור ספירת תאים.
    הערה: לקבלת פרוטו זהcol, צפיפות זריעה עבור 3T3 תאים מוקרן הוא 10,900 תאים לס"מ 2, אשר שווה 600,000 תאים לכל צלחת 100 מ"מ.
  5. Aliquot את מספר התאים הדרושים צלחת צלחת 100 מ"מ לדגימה המטופל resuspend ב 25 מ"ל של 3T3 בינוניים צינור חרוטי 50 מ"ל ו מקרינים עם 3000 rads.
  6. בעקבות הקרנה, ספין התאים למשך 5 דקות ב 300 XG ו resuspend במדיום תכנות מחדש מותנה ב 5 מ"ל לכל 100 צלחת מ"מ.
  7. הגדר את צינור הצידה עד הציפוי של תאי חולה מתרחש מאוחר יותר בפרוטוקול (ראה שלב 7.6).

6. קבלה, שימור הובלת ביופסיות Pediatric ושט

  1. הוסף 5 מ"ל של סרום ללא בינוני keratinocyte להשלים עם 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​primocin עד 15 צינורות חרוטי מ"ל ולהביא אותו למוקד רפואי על הקרח.
    הערה: אלה צינורות של המדיום יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד 2 חודשים.
  2. השג כ 8 ביופסיות הוושט בבית tiלי אנדוסקופיה ונפרד כדלקמן:
    1. מניחים שש ביופסיות של חרוטי 15 מ"ל המכיל בינוני חופשי בסרום keratinocyte להשלים עם 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​primocin ומניחים על קרח רטוב.
    2. מניח ביופסיה אחד ב 5 מיליליטר של פורמלין שנאגר ומניחים על קרח רטוב.
    3. מניח ביופסיה אחת ביופסיה קטנה cryomold עם מתחם טמפרטורת חיתוך אופטימלי.
      1. מיד טיפה עובש זה לתוך מבחנה של איזופנטאן להציב בחנקן נוזלי. לאחר קפוא, למקם את cryomold בשקית הדגימה ולאחסן על קרח יבש במיכל קצף פוליסטירן.
  3. מניחים את צינורות המכילים ביופסיות במדיום או פורמלין בתוך שקית סגר ולאחר מכן לתוך קופסת משלוח המכיל קרח רטוב. חותם תווית בתיבה עם תווית Biohazard ולהעביר אותה למעבדה.
    הערה: המכל המכיל את הקרח היבש הביופסיה קפוא הוא חתום גם ומסומן עם תווית Biohazard.

עיבוד 7.רקמות חולות לתרבות ניתוח Downstream

  1. בהגיעם במעבדה, להעביר הביופסיה קפוא על קרח יבש כדי מקפיא -80 מעלות צלזיוס למשך חתך במורד הזרם או מיצוי RNA. מניחים את המדגם בפורמלין. אחסן במקרר 4 ° C ולאפשר לתקן לילה.
  2. ספין הביופסיות הנותרים למטה ב 300 XG, לשאוב את המדיום. הוסף 10 מיליליטר של dispase פתרון הצינור, חותם חרוטים ולאפשר לו לדגור על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 15 דקות.
  3. לאחר הדגירה, לסובב את הביופסיות ב g 300 x. לשאוב ביופסיות בינוני ו resuspend ב 5 מ"ל של 0.05% טריפסין- EDTA.
  4. מעבירים את 5 מ"ל של-EDTA טריפסין המכיל הביופסיות לצלחת 100 מ"מ סטרילית לרכך את ביופסיות באמצעות 2 סכיני גילוח מעוקרים כמו קנס ככל האפשר.
  5. מעבירים את 5 מ"ל של-EDTA טריפסין המכיל ביופסיות טחון חרוטי 15 מ"ל חדש. יש לשטוף את הצלחת פעמים עם 5 מיליליטר נוסף של 0.05% טריפסין- EDTA ומוסיף החרוטיםצינור. דגירה הצינור במשך 10 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
  6. לאחר הדגירה, לסובב את הביופסיות למטה XG ב 300 (1.4 סל"ד) במשך 5 דקות ו לשאוב את המדיום. הוסף 5 מ"ל של מדיום תכנות מחדש מותנה צינור חרוטי וכן 5 מ"ל של מדיום תכנות מחדש מותנה המכיל את התאים מזין מוקרן (ראה שלב 5.7).
  7. הוסף מעכב ROCK (1 μL / מ"ל) אל 10 מ"ל של השעיה תא צלחת לאחר aspirating את הג'לטין מצלחת בתרבית רקמה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס.

Culturing 8. תאי הרחבה

  1. לאחר כ 5 ימים של תרבות, לשאוב את המדיום הראשוני המכיל את חתיכות טחון-ביופסיה ולשטוף את צלחת 2-3 פעמים עם 5 מ"ל PBS סטרילית. הוסף בינוני חדש לצלחת כולל מעכבי ROCK ב 10 מיקרומטר.
  2. בהגיעם 70% confluency, להרחיב את התאים. הוסף 5 מ"ל של 0.05% טריפסין- EDTA לצלחת דגירה של 37 מעלות צלזיוס חממה לא יותר מ -2.5 דקות כדי להסיר התאי מזין דואר. לאחר דגירה כי, לשאוב טריפסין-EDTA ולשטוף את צלחת עם 5 מ"ל של PBS.
  3. לשאוב PBS ולהוסיף 5 מ"ל של 0.25% טריפסין- EDTA לצלחת דגירה במשך 5-10 דקות או עד שהתאים רופפים מהצלחת. להוסיף כמויות שווות של מדיום לצלחת כדי לעצור את התגובה ולהעביר את כל הנוזל לצינור 50 מיליליטר חרוטים והמסובב ב XG 300 במשך 5 דקות.
  4. תאים Resuspend בנפח מוגדר בינוני תכנות מחדש מותנה ומערבבים 10 μL של ההשעיה עם 10 μL של trypan כחול. סמוך על hemocytometer לקבוע מספר תא הכולל.
  5. כדי להרחיב את התאים, להוסיף 1 מיליון תאים אנושיים הוושט לצלחת 150 מ"מ יחד עם 1.2 מיליון מוקרן 3T3 תאים בנפח כולל של 15 מ"ל. הוסף מעכב ROCK הטרי 10μM ולהוסיף את השעית התא בצלחת ג'לטין צופה 150 מ"מ.

9. להקפיא חנות אדם תאי הוושט אפיתל

  1. כדי להפוך הקפאה בינונית, מוסיף 10%DMSO עד בינוני תכנות מחדש על תנאי. לאחר trypsinizing ועוד היד נטויה, aliquot התאים להקפיא לתוך צינור 50 מ"ל חרוטי חדש ומסובב ב XG 300 במשך 5 דקות.
  2. לשאוב הבינוני ומוסיף הקפאה בינונית בהיקף של 2 מיליליטר לכל cryovial. לאחר ההשעיה התא הוא הומוגני, aliquot 10 6 תאים cyrovials מראש שכותרתו. מקום במיכל הקפאה ב -80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 24 שעות לפני הזזת צלוחיות אחסון חנקן נוזלי לטווח ארוך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סיכום של צעדי מפתח לבודד תאי אפיתל ושט ביופסיות חולה מסוכם באיור 1. מושבות של תאי אפיתל תהווינה כ 4-5 ימים ויהיו מוקפות תאי מזין פיברובלסטים (איור 2 א). כמו מושבות אלה להרחיב הם יתמזגו עם מושבות אחרות כדי ליצור מושבות גדולות יותר (איור 2 ב). לאחר התרבויות הפכו 70% ומחוברות, הם צריכים להיות מורחבים (איור 2 ג). כדי להבטיח כי פיברובלסטים יוסרו מהצלחת לפני הסרת תאי אפיתל, 0.05% טריפסין...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצעדים החשובים ביותר על מנת לבודד להרחיב בתאי אפיתל הוושט ביופסיות המטופל הם: 1) כראוי מתנער הדגימה יחד מוות של תאים מינימלי; 2) להבטיח מעכב ROCK מתווסף בינוני תרבית תאים בכל החלפה בינונית; 3) אין להשתמש תאים מזינים יותר ממומלץ; 4) לשמור על תרבות מזוהמת נקיה; ו -5) תאים מעבר רק לפני שהגיע מפגש.

בשל ההבדלים הקשורים למטופל בדגימות ביופסיה השיגו לתכנות מחדש מותנה, סביר לצפות הבדלי קינטיקה צמיחה, פנוטיפ ויכל להתרחב ק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות למימון המחקר האסטרטגי של המרכז הרפואי לילדים של קונטיקט על תמיכתו בעבודה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
PrimocinInVivogenant-PM2
IsopentaneSigma Aldrich277258-1L
ג'לטין מעור חזירSigma AldrichG1890-100G
DMEMThermofisher Scientific11965092
CryomoldTissueTek4565
Cryomatrix OCTThermofisher Scientific
15 מ"ל צינורות חרוטייםדנוויל סיינטיפיקC1017-p
סרום קרטינוציטים שלם ללא סרום בינוניThermofisher Scientific10724011
פניצילין סטרפטומיציןThermofisher Scientific15140122
GlutamaxThermofisher Scientific35050061
תמיסת אינסוליןסיגמא אולדריץ'I9278-5ml
גורם גדילה אפידרמיס אנושי (EGF)PeprotechAF-100-15
מעכב רוק (Y-27632)Fisher Scientific125410
F-12 בינוני Thermofisher Scientific11765054
סרום בקר עובריDenville ScientificFB5001
DispaseThermofisher Scientific17105041
0.05% Trypsin-EDTAThermofisher Scientific25300062
0.25% Trypsin-EDTAThermofisher Scientific25200072
100 מ"מ כליםדנוויל ScientificT1110-20
150 מ"מ כליםדנוויל סיינטיפיקT1115
50 מ"ל חרוטיםדנוויל סיינטיפיק  C1062-9 
טבליות מלח חוצצות פוספטפישר סיינטיפיקBP2944-100
5 מ"ל פיפטותפישר סיינטיפיק1367811D
10 מ"ל פיפטותפישר סיינטיפיק1367811E
25 מ"לפיפטות פישר סיינטיפיק1367811
9 אינץ' פסטר פיפטספישר סיינטיפיק13-678-20D
תאי NIH 3T3ATCCCRL1658
6769006

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clark, D. C. Esophageal atresia and tracheoesophageal fistula. Am Fam Physician. 59 (4), 910-920 (1999).
  2. Soon, I. S., Butzner, J. D., Kaplan, G. G., deBruyn, J. C. Incidence and prevalence of eosinophilic esophagitis in children. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 57 (1), 72-80 (2013).
  3. Sjöqvist, S., et al. Experimental orthotopic transplantation of a tissue-engineered oesophagus in rats. Nat Commun. 5, 3562(2014).
  4. Saxena, A. K. Esophagus tissue engineering: designing and crafting the components for the 'hybrid construct' approach. Eur J Pediatr Surg. 24 (3), 246-262 (2014).
  5. Saxena, A. K., Ainoedhofer, H., Höllwarth, M. E. Culture of ovine esophageal epithelial cells and in vitro esophagus tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 16 (1), 109-114 (2010).
  6. Saxena, A. K., Kofler, K., Ainodhofer, H., Hollwarth, M. E. Esophagus tissue engineering: hybrid approach with esophageal epithelium and unidirectional smooth muscle tissue component generation in vitro. J Gastrointest Surg. 13 (6), 1037-1043 (2009).
  7. Macheiner, T., Kuess, A., Dye, J., Saxena, A. K. A novel method for isolation of epithelial cells from ovine esophagus for tissue engineering. Biomed Mater Eng. 24 (2), 1457-1468 (2014).
  8. Mishra, A. Significance of Mouse Models in Dissecting the Mechanism of Human Eosinophilic Gastrointestinal Diseases (EGID). J Gastroenterol Hepatol Res. 2 (11), 845-853 (2013).
  9. Medvedev, S. P., Shevchenko, A. I., Zakian, S. M. Induced Pluripotent Stem Cells: Problems and Advantages when Applying them in Regenerative Medicine. Acta Naturae. 2 (2), 18-28 (2010).
  10. Metallo, C. M., Azarin, S. M., Ji, L., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Engineering tissue from human embryonic stem cells. J Cell Mol Med. 12 (3), 709-729 (2008).
  11. Lee, H., Park, J., Forget, B. G., Gaines, P. Induced pluripotent stem cells in regenerative medicine: an argument for continued research on human embryonic stem cells. Regen Med. 4 (5), 759-769 (2009).
  12. Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J Clin Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
  13. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2013).
  14. Ogaki, S., Morooka, M., Otera, K., Kume, S. A cost-effective system for differentiation of intestinal epithelium from human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 5, 17297(2015).
  15. Ehrhardt, C., Kim, K. J., Lehr, C. M. Isolation and culture of human alveolar epithelial cells. Methods Mol Med. 107, 207-216 (2005).
  16. Zubeldia-Plazaola, A., et al. Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells. Front Cell Dev Biol. 3, 32(2015).
  17. Spurrier, R. G., Speer, A. L., Hou, X., El-Nachef, W. N., Grikscheit, T. C. Murine and human tissue-engineered esophagus form from sufficient stem/progenitor cells and do not require microdesigned biomaterials. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 906-915 (2015).
  18. Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol Med. 50, 15-20 (2001).
  19. Southgate, J., Hutton, K. A., Thomas, D. F., Trejdosiewicz, L. K. Normal human urothelial cells in vitro: proliferation and induction of stratification. Lab Invest. 71 (4), 583-594 (1994).
  20. Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nat Protoc. 7 (2), 235-246 (2012).
  21. Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).
  22. Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., et al. Molecular Cell Biology. , W.H. Freeman. New York. (2000).
  23. Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
  24. Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20035-20040 (2012).
  25. Davis, A. A., et al. A human retinal pigment epithelial cell line that retains epithelial characteristics after prolonged culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (5), 955-964 (1995).
  26. Carro, O. M., Evans, S. A., Leone, C. W. Effect of inflammation on the proliferation of human gingival epithelial cells in vitro. J Periodontol. 68 (11), 1070-1075 (1997).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Conditional ReprogrammingEsophageal Epithelial CellsTissue EngineeringPediatric EsophagusEndoscopic BiopsyFeeder Cell RemovalROCK InhibitorEpithelial Cell ExpansionEosinophilic Esophagitis3D Esophageal Scaffold

מאמרים קשורים