הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידול יעיל של pluripotent בתאי גזע כדי NKX6-1

7.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55265

⸱

7 במרץ 2017

 , 
1Toronto General Research Institute, University Health Network, 2McEwen Centre for Regenerative Medicine, University Health Network, 3Department of Physiology, University of Toronto

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מתארים פרוטוקול 4 שלבים להבדיל מתאי גזע עובריים אנושיים כדי NKX6-1 + אבות לבלב במבחנה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של שורות תאי גזע אנושיים pluripotent.

תקציר

יש תאי גזע פלוריפוטנטיים היכולת עצמית לחדש ולבדל שושלות מרובות, מה שהופך אותם מקור אטרקטיבי עבור הדור של ובתאים לבלב שיכול לשמש לחקר וטיפול עתיד של סוכרת. מאמר זה מתאר פרוטוקול בידול ארבעה שלבים שנועד ליצור ובתאי לבלב מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs). פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מספר תאי הגזע האנושי פלוריפוטנטיים קווי (hPSC). הגישה שננקטה כדי ליצור ובתאי לבלב היא להבדיל hESCs לבנות מודל מדויק בשלבים קריטיים התפתחות לבלב. זה מתחיל עם האינדוקציה של האנדודרם הסופי, אשר מושג על ידי culturing תא בנוכחות Activin A, גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF) ו CHIR990210. בידול דפוסים בהמשך עם פיברובלסטים Growth Factor 10 (FGF10) ו Dorsomorphin מייצרים תאים דומים במעי הקדמי האחורי. התוספת של ברטיןOIC חומצה, שהגולגולת, SANT-1 ו FGF10 מבדיל תאים במעי הקדמי האחורי לתאים אופייני endoderm הלבלב. לבסוף, השילוב של גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), Nicotinamide ו noggin מוביל הדור יעיל של PDX1 + / NKX6-1 + תאים. Cytometry זרימה מבוצע כדי לאשר את הביטוי של סמנים ספציפיים בשלבים המפתח של התפתחות הלבלב. PDX1 + / NKX6-1 + אבות הלבלב בסוף השלב 4 מסוגלים לייצר תאי β בוגרים על השתלה לעכברי immunodeficient ויכולים להיות מובחן נוסף לייצר תאים מייצרי אינסולין במבחנה. לפיכך, הדור היעיל של PDX1 + / NKX6-1 + אבות לבלב, כפי שמודגם בפרוטוקול זה, הוא בעלת חשיבות רבה כיוון שהיא מספקת פלטפורמה ללמוד פיתוח לבלב אנושי במבחנה מספקת מקור של תאים עם הפוטנציאל של הבחנה כדי תאי β שיכול EVentually לשמש לטיפול בסוכרת.

מבוא

השכיחות של סוכרת היא הגדילה על פי איגוד הסוכרת הקנדי, ההערכה היא כי למעלה מ -11 מיליון בני אדם בקנדה הוא סוכרת או prediabetic, עם 5-10% של אנשים אלה שיש סוכרת סוג 1 (T1D) 1. T1D היא מחלה אוטואימונית אשר נגרמת על ידי הרס של תאי β לייצר אינסולין אשר ממוקמים בתוך איי לנגרהנס. נכון לעכשיו, אנשים החיים עם T1D דורשים מקורות חיצוניים של אינסולין 2. למרות ההתקדמות בטיפול אינסולין, חולי T1D ממשיכים מתקשים לווסת את רמות הסוכר בדם שלהם ממשיכים לסבול הן חָסֵר ו היפרגליקמיה. טופס מבטיח טיפול לשחזר normoglycemia ב T1D הוא השימוש בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs), אשר יכול לשמש כדי ליצור אספקה בלתי מוגבלת של תאים המייצרים אינסולין β הוא in vivo ו במבחנה 3, 4, 5, 6, 7. ההתמיינות hESCs כדי בטא דמויי תאים יכול לעשות את זה ניתן ללמוד סוכרת במבחנה, המאפשר זיהוי של מטרות טיפוליות חדשות לטיפול בסוכרת מסוג 2 ולספק תאים להשתלה לחולים T1D.

הניסיון המוצלח ביותר ביצירת תאים מייצרי אינסולין hESCs במבחנה היא לשחזר את האירועים עובריים המתרחשות במהלך התפתחות הלבלב 4, 5. זה כרוך המניפולציה של מסלולי איתות מובהקים מודל שלבי מפתח מדויק של הלבלב מתפתח. פיתוח לבלב מתחיל עם האינדוקציה של האנדודרם הסופי, אשר מאופיין על ידי הביטוי של CXCR4 ו CD117 (c-KIT) 8, 9. תקנה מדויקת של definitארגון endoderm ive נדרש להקמת צינור הבטן, אשר לאחר מכן עובר קדמי אל אחוריים ואת גחון-הגבה דפוסים. הגבה וניצני לבלב גחון לצאת מהאזור במעי הקדמי האחורי המבטא את גן homeobox לבלב תריסריון (Pdx1), אשר הוא הכרחי עבור התפתחות לבלב 10. הגבה וניצני גחון פתיל כדי ליצור את הלבלב, אשר לאחר מכן עובר שיפוץ נרחב אפיתל והרחבה 11. מחויבות השושלת האנדוקרינית אקסוקרינית מלווה דור ובתאים מולטיפוטנטיים (MPCs) המבטאים, בין היתר, את שעתוק גורמי Pdx1, Nkx6.1 ו Ptf1a 12, 13. MPCs שיהפכו תאי האנדוקרינית ductal ממשיך להביע Nkx6-1 תוך הפחתת ביטוי Ptf1a. בניגוד לכך, תאי שושלת אקסוקרינית יאבדו expression של Nkx6-1 ולתחזק Ptf1a הביטוי 12.

גורם השכפול Nkx6-1 יש תפקיד מרכזי בפיתוח לבלב, בפרט במהלך ההתמיינות של תאי אב האנדוקרינית כדי בטאו תאים. כפי שתואר קודם לכן, המחיקה של תוצאות Nkx6-1 במבנה לקוי של תאי β במהלך התפתחות הלבלב 14. לכן, יצירת תאי β מייצר אינסולין הוא במבחנת in vivo דורשת האינדוקציה היעילה של Nkx6-1.

אנחנו לאחרונה פתחנו פרוטוקול ביעילות ליצור PDX1 + / NKX6-1 + אבות לבלב מ hPSCs. HPSC נגזרים אלה אבות לבלב לייצר תאי β בוגרים על השתלה לעכברי immunodeficient 3. פרוטוקול הבידול ניתן לחלק 4 שלבים אופייניים: 1) אינדוקציה האנדודרם סופית, 2) דפוסים במעי הקדמי האחורי, 3) מפרט הלבלב ו -4) אינדוקציה NKX6-1. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של כל שלב של התמיינות מכוונת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת פתרונות ומדיה

הערה: הכן את כל התקשורת עבור תרבית תאים בסביבה סטרילית. יש מדיה להתבצע ומשומשים מיד. פרטים מגיבים ניתנים לוח החומרים.

  1. מדיה בידול
    1. הכן יום 0 בידול מדיה: RPMI בינוני עם 1% גלוטמין, 2 מיקרומטר CHIR 99,021, 100 ng / ml Activin א ', 10 4 M MTG.
    2. הכן מדיה בידול יום 1-2: RPMI בינוני עם 1% גלוטמין, 100 ng / ml Activin א ', 10 4 M MTG, 5 ng / ml bFGF, 50 מיקרוגרם / מ"ל חומצה אסקורבית.
    3. הכן מדיה בידול יום 3-5: RPMI בינוני עם 1% גלוטמין, 1% B27, 10 4 M MTG, 0.75 מיקרומטר Dorsomorphin, 50 ng / ml FGF10.
    4. הכן מדיה בידול יום 6-7: DMEM עם 1% גלוטמין, 1% B27, 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​אסקורבית חומצה, 50 ng / ml FGF10, 0.25 SANT-1 מיקרומטר, 2 מיקרומטר החומצה הרטינואית, 50 ng / ml noggin.
      הערה: רטינואיתחומצה יש להוסיף התקשורת אחרונה ומדיה צריכה להיות מוגנת מפני אור כדי למנוע חמצוני שפלה 15.
    5. הכן יום 8-12 בידול מדיה: DMEM עם 1% גלוטמין, 1% B27, 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​אסקורבית חומצה, 50 ng / ml noggin, 100 ng / ml hEGF, 10 מ"מ Nicotinamide.
  2. הכן חיץ FACS: 10% FBS ב PBS, מינוס סידן ומגנזיום.

2. בידול hESC

הערה: hESC הם הפשירו, passaged והרחיב על פיברובלסטים עובריים בעכבר מוקרן בנוכחות מדיה מבוססת KOSR בתוספת bFGF 16. HESCs מוכן בידול כאשר התאים מגיעים 80-95% confluency. בשלב זה המושבות צריכות להיות גדולות עם גבולות מוגדרים וכן (איור 1 א) 'domelike' מבנה. כל תרבית התאים מתבצעת שטוח תחתון, צלחות שטופלו בתרבית רקמה מצופית 0.1% ג'לטין. בדרך כלל, התאים גדלים ב 6 או12-גם צלחות, במחזורי התקשורת של 2 מ"ל או 1 מ"ל, בהתאמה.

  1. ביום 0, להתחיל בידול על ידי החלפת מדיה המבוססת KOSR עם מדיה בידול 0 יום.
  2. בימים 1 ו -2, לנער את הצלחת בעדינות כדי להסיר את כל התאים המתים מן monolayer לפני aspirating. חלף עם יום 1-2 בידול מדיה.
  3. ביום 3, תאי קציר עבור cytometry זרימה. אם התאים לבטא יותר מ -90% CXCR4 + / CD117 +, המשך לשלב 2.4.
  4. בימים 3 ו -5, לנער את הצלחת בעדינות כדי להסיר את כל התאים המתים מן monolayer לפני aspirating. חלף עם יום 3-5 בידול מדיה.
  5. בימים 6 ו -7, להחליף עם מדיה בידול יום 6-7.
  6. בימים 8, 10 ו -12, להחליף עם יום 8-12 מדיה בידול.
  7. ביום 13, תאי קציר עבור cytometry זרימה כדי לקבוע PDX1 וביטוי NKX6-1.

3. תאי קציר עבור ניתוח cytometry הזרימה

  1. לנתק תאים עםפתרון טריפסין מסחרי 1x על פי הפרוטוקול של היצרן ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות.
  2. הסר פתרון טריפסין מסחרי ו resuspend תאים בודדים 1,000 μl FACS חוצץ עם 30 μl DNase I.
  3. תאים מסננים באמצעות מסננת תא רשת ניילון 35 מיקרומטר ולהעביר צינור microcentrifuge.
  4. תאי צנטריפוגה ב 455 XG במשך 5 דקות. כן תאים עבור מכתים או לחיות או קבוע.

4. מכתים עבור cytometry זרימה

  1. זרימה לקראת מכתים חי ביום 3
    1. תאים Resuspend ב 1,000 μl FACS חוצץ. העברת 200 μl (כ 1-3 x 10 5 תאים) לשתי בארות של צלחת 96-היטב (הן דוגמאות בלא כתם ומוכתמת).
    2. צנטריפוגה את הצלחת ב 931 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant על ידי היפוך לצלחת.
    3. הכתם עם נוגדנים ראשוניים מצומדות, CXCR4: APC ו CD117: PE (ראה M aterials טבלה) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור.
    4. צנטריפוגה את הצלחת ב 931 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant על ידי היפוך לצלחת.
    5. דגימות גלולות ב 100 μl חיץ FACS.
    6. צנטריפוגה את הצלחת ב 931 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant על ידי היפוך לצלחת.
    7. Resuspend כל דגימה והעברת בהיקף כולל של 300-500 μl FACS הצפת 1 מ"ל מבחנות מיקרו או 5 צינורות מ"ל מסביב לתחתית.
    8. דגימות לרוץ על זרימת cytometer 17. אם דגימות לא ניתן להפעיל באופן מיידי, חנות ב 4 ° C מוגן מפני אור.
  2. זרימה לקראת מכתים קבוע ביום 13
    1. Resuspend התא גלולה בפתרון קיבעון / permeabilization מסחרי למשך 24 שעות ב 4 ° C..
    2. צנטריפוגה מדגם ב 455 XG במשך 5 דקות. Resuspend ב 400 μl פתרון פרם / Wash.
    3. העבר 200 μl של המדגם (כ 0.5-1 x 10 6 תאים) כדי two בארות צלחת 96-היטב (לשליטה IgG ו PDX1 / NKX6-1 מכתים). צנטריפוגה ב 931 XG למשך 2 דקות.
    4. Resuspend את כדורי תא 100 μl פתרון פרם / לשטוף המכיל נוגדני שליטה אנטי PDX1 ואנטי NKX6-1 ראשוני או אלוטיפ (ראה לוח חומרים). דגירת הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    5. צנטריפוגה את הצלחת ב 931 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant על ידי היפוך לצלחת. דגימות גלולות ב 100 μl פתרון פרם / Wash.
    6. צנטריפוגה את הצלחת ב 931 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant על ידי היפוך לצלחת.
    7. Resuspend דגימות 100 μl פרם / Wash המכילה נוגדנים משני בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 מוגן מפני אור.
    8. צנטריפוגה את הצלחת ב 931 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant על ידי היפוך לצלחת.
    9. דגימות גלולות ב 100 μl פרמו / לשטוף פתרון.
    10. צנטריפוגה את הצלחת ב 931 XG למשך 2 דקות. הסר את supernatant על ידי היפוך לצלחת.
    11. נציגלאכול צעד 4.2.9 ו 4.2.10.
    12. Resuspend כל דגימה והעברת בהיקף כולל של 300-500 μl FACS הצפת 1 מ"ל מבחנות מיקרו או 5 צינורות מ"ל מסביב לתחתית.
    13. דגימות לרוץ על זרימת cytometer 17. אם דגימות לא ניתן להפעיל באופן מיידי, חנות ב 4 ° C מוגן מפני אור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

דור יעיל של אבות לבלב מסתמך על הגידול הנכון ותחזוקה של תאים שלא עברו התמיינות ואחריו התוספת המדויקת של מולקולות ספציפיות איתות במהלך פרוטוקול הבידול, כפי שמודגם סכמטי באיור 1 א. ביום 0, תאים שלא עברו התמיינות צריכים להיות ומחוברות 80-95% ומושבות צריכות להיות קצוות מוגדרים (איור 1 א). במהלך שלב 1, התקשורת תופיע מעונן סביר מאז מות תאים די נפוץ בשלב זה. עד סוף שלב 1, התאים צריכים לשתף להביע סמנים האנדודרם סופי, CXCR4 ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

יצירה בהצלחה NKX6-1 + אבות לבלב מ hPSCs במבחנה מסתמכת על השימוש של תרבויות באיכות גבוהות של hPSCs והבחנה מכוון מעורבות בוויסות המדויקת של מסלולי איתות ספציפיים ששולטים שלבי התפתחות מפתח במהלך התפתחות לבלב. למרות פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לגרום ביטוי חזק של NKX6-1 פני מגוון רחב של קווי hPSC כמו בעבר הראו 3, על מנת להבטיח דור NKX6-1 יעיל השיקולים הבאים צריכים להתבצע. חשוב שכל הכנות תרבות ומדיה תא מבוצעות בסביבה סטרילית על מנת למנוע זיהום. ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים אין לי מה לחשוף.

תודות

כתב היד זו נתמכה על ידי מימון כללי בטורונטו קרן המערבי בנטינג & Best סוכרת מרכז-אוניברסיטת בריאות רשת בוגר פרס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>מדיה וציטוקינים
1-תיוגליצרול (MTG)SigmaM6145
Activin AR& D338-AC/CF 
חומצה אסקורביתSigmaA4544
B-27 תוסףתזונה טכנולוגיות חיים12587-010 
BD Cytofix/Cytoperm BufferBD Bioscience554722
BD Perm/Wash buffer, 1xBD Bioscience554723
bFGFR& D233-FB
CHIR990210Tocris4423a
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)Life Technologies11995
DNase IVWR80510-412 
דורסומורפיןסיגמאP5499
EGFמו"פ D236-EG
סרום בקר עוברי (FBS)Wisent88150
FGF10R& D345-FG
ג'לטין מעור חזירSigmaG1890
GlutamineLife Technologies25030
ניקוטינאמידSigmaNO636
NOGGINR& D3344-NG
פניצילין/סטרפטומיציןLife Technologies15070-063
חומצה רטינואיתSigmaR2625
RPMI בינוני 1640Life Technologies11875
SANT-1Tocris1974
TrypLE Express Enzyme (1x), פנול אדוםLife Technologies12605-010
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
<חזק>נוגדנים לזרימה ציטומטרית (דילול עבודה)
CD117 PE (1:100)Life TechnologiesCD11705
CXCR4 APC (1:50)BD  Bioscience551966
חמור נגד עכבר IgG (H+L), מצומד Alexa Fluor 647 (1:400)Life TechnologiesA-31571
Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) מעבדות ג'קסון אימונו-מחקר בע"מ705-546-147
עכבר בקרת איזוטיפ IgG מעבדות ג'קסון אימונוסקר בע"מ 015-000-003
בקרת איזוטיפ עיזים IgGמו"פ D   AB-108-C
NKX6-1 (1:2,000)DSHBF55A10
PDX1 (1:100)R& DAF2419

מקורות

  1. Canadian Diabetes Association. , Available from: http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes (2016).
  2. Cogger, K., Nostro, M. C. Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes. Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).
  3. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  4. Pagliuca, F. W., et al. Generation of Functional Human Pancreatic beta Cells In Vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  5. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2014).
  6. Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).
  7. Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
  8. D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).
  9. Gouon-Evans, V., et al. BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm. Nat Biotechnol. 24 (11), 1402-1411 (2006).
  10. Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
  11. Pan, F. C., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).
  12. Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors. Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).
  13. Zhou, Q., et al. A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis. Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).
  14. Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
  15. Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. Retinoic acid stability in stem cell cultures. Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).
  16. Korytnikov, R., Nostro, M. C. Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells. Methods. , 56-64 (2016).
  17. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  18. Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
  19. Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7 (5), e37004(2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ביטוי NKX6-1ציטומטריית זרימהאנדודרמה דפיניטיביתפרוטוקול גזירהסממני PDX1תאי גזע עובריים אנושייםתרבית תאיםעכברים עם חסר חיסוני
בידול יעיל של pluripotent בתאי גזע כדי NKX6-1
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.