כאן אנו מתארים פרוטוקול 4 שלבים להבדיל מתאי גזע עובריים אנושיים כדי NKX6-1 + אבות לבלב במבחנה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של שורות תאי גזע אנושיים pluripotent.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
יש תאי גזע פלוריפוטנטיים היכולת עצמית לחדש ולבדל שושלות מרובות, מה שהופך אותם מקור אטרקטיבי עבור הדור של ובתאים לבלב שיכול לשמש לחקר וטיפול עתיד של סוכרת. מאמר זה מתאר פרוטוקול בידול ארבעה שלבים שנועד ליצור ובתאי לבלב מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs). פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מספר תאי הגזע האנושי פלוריפוטנטיים קווי (hPSC). הגישה שננקטה כדי ליצור ובתאי לבלב היא להבדיל hESCs לבנות מודל מדויק בשלבים קריטיים התפתחות לבלב. זה מתחיל עם האינדוקציה של האנדודרם הסופי, אשר מושג על ידי culturing תא בנוכחות Activin A, גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF) ו CHIR990210. בידול דפוסים בהמשך עם פיברובלסטים Growth Factor 10 (FGF10) ו Dorsomorphin מייצרים תאים דומים במעי הקדמי האחורי. התוספת של ברטיןOIC חומצה, שהגולגולת, SANT-1 ו FGF10 מבדיל תאים במעי הקדמי האחורי לתאים אופייני endoderm הלבלב. לבסוף, השילוב של גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), Nicotinamide ו noggin מוביל הדור יעיל של PDX1 + / NKX6-1 + תאים. Cytometry זרימה מבוצע כדי לאשר את הביטוי של סמנים ספציפיים בשלבים המפתח של התפתחות הלבלב. PDX1 + / NKX6-1 + אבות הלבלב בסוף השלב 4 מסוגלים לייצר תאי β בוגרים על השתלה לעכברי immunodeficient ויכולים להיות מובחן נוסף לייצר תאים מייצרי אינסולין במבחנה. לפיכך, הדור היעיל של PDX1 + / NKX6-1 + אבות לבלב, כפי שמודגם בפרוטוקול זה, הוא בעלת חשיבות רבה כיוון שהיא מספקת פלטפורמה ללמוד פיתוח לבלב אנושי במבחנה מספקת מקור של תאים עם הפוטנציאל של הבחנה כדי תאי β שיכול EVentually לשמש לטיפול בסוכרת.
מבוא
השכיחות של סוכרת היא הגדילה על פי איגוד הסוכרת הקנדי, ההערכה היא כי למעלה מ -11 מיליון בני אדם בקנדה הוא סוכרת או prediabetic, עם 5-10% של אנשים אלה שיש סוכרת סוג 1 (T1D) 1. T1D היא מחלה אוטואימונית אשר נגרמת על ידי הרס של תאי β לייצר אינסולין אשר ממוקמים בתוך איי לנגרהנס. נכון לעכשיו, אנשים החיים עם T1D דורשים מקורות חיצוניים של אינסולין 2. למרות ההתקדמות בטיפול אינסולין, חולי T1D ממשיכים מתקשים לווסת את רמות הסוכר בדם שלהם ממשיכים לסבול הן חָסֵר ו היפרגליקמיה. טופס מבטיח טיפול לשחזר normoglycemia ב T1D הוא השימוש בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs), אשר יכול לשמש כדי ליצור אספקה בל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת פתרונות ומדיה
הערה: הכן את כל התקשורת עבור תרבית תאים בסביבה סטרילית. יש מדיה להתבצע ומשומשים מיד. פרטים מגיבים ניתנים לוח החומרים.
- מדיה בידול
- הכן יום 0 בידול מדיה: RPMI בינוני עם 1% גלוטמין, 2 מיקרומטר CHIR 99,021, 100 ng / ml Activin א ', 10 4 M MTG.
- הכן מדיה בידול יום 1-2: RP....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
דור יעיל של אבות לבלב מסתמך על הגידול הנכון ותחזוקה של תאים שלא עברו התמיינות ואחריו התוספת המדויקת של מולקולות ספציפיות איתות במהלך פרוטוקול הבידול, כפי שמודגם סכמטי באיור 1 א. ביום 0, תאים שלא עברו התמיינות צריכים להיות ומחוברות 80-95% ומושבות צריכות להיות קצוות מוגדרים (איור 1 א). במהלך שלב 1, התקשורת תופיע מעונן סביר מאז מות תאים די נפוץ בשלב זה. עד סוף שלב 1, התאים צריכים לשתף להביע סמנים האנדודרם סופי, CXCR4 .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
יצירה בהצלחה NKX6-1 + אבות לבלב מ hPSCs במבחנה מסתמכת על השימוש של תרבויות באיכות גבוהות של hPSCs והבחנה מכוון מעורבות בוויסות המדויקת של מסלולי איתות ספציפיים ששולטים שלבי התפתחות מפתח במהלך התפתחות לבלב. למרות פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לגרום ביטוי חזק של NKX6-1 פני מגוון רחב של קווי hPSC כמו בעבר הראו 3, על מנת להבטיח דור NKX6-1 יעיל השיקולים הבאים צריכים להתבצע. חשוב שכל הכנות תרבות ומדיה תא מבוצעות בסביבה סטרילית על מנת למנוע זיהום. .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים אין לי מה לחשוף.
תודות
כתב היד זו נתמכה על ידי מימון כללי בטורונטו קרן המערבי בנטינג & Best סוכרת מרכז-אוניברסיטת בריאות רשת בוגר פרס.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>מדיה וציטוקינים | |||
| 1-תיוגליצרול (MTG) | Sigma | M6145 | |
| Activin A | R& D | 338-AC/CF | |
| חומצה אסקורבית | Sigma | A4544 | |
| B-27 תוסף | תזונה טכנולוגיות חיים | 12587-010 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Buffer | BD Bioscience | 554722 | |
| BD Perm/Wash buffer, 1x | BD Bioscience | 554723 | |
| bFGF | R& D | 233-FB | |
| CHIR990210 | Tocris | 4423a | |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995 | |
| DNase I | VWR | 80510-412 | |
| דורסומורפין | סיגמא | P5499 | |
| EGF | מו"פ D | 236-EG | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Wisent | 88150 | |
| FGF10 | R& D | 345-FG | |
| ג'לטין מעור חזיר | Sigma | G1890 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| ניקוטינאמיד | Sigma | NO636 | |
| NOGGIN | R& D | 3344-NG | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | Life Technologies | 15070-063 | |
| חומצה רטינואית | Sigma | R2625 | |
| RPMI בינוני 1640 | Life Technologies | 11875 | |
| SANT-1 | Tocris | 1974 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), פנול אדום | Life Technologies | 12605-010 | |
| <חזק>שם | <חזק>חברה | <חזק>מספר קטלוגי | <חזק>הערות |
| <חזק>נוגדנים לזרימה ציטומטרית (דילול עבודה) | |||
| CD117 PE (1:100) | Life Technologies | CD11705 | |
| CXCR4 APC (1:50) | BD Bioscience | 551966 | |
| חמור נגד עכבר IgG (H+L), מצומד Alexa Fluor 647 (1:400) | Life Technologies | A-31571 | |
| Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) | מעבדות ג'קסון אימונו-מחקר בע"מ | 705-546-147 | |
| עכבר בקרת איזוטיפ IgG | מעבדות ג'קסון אימונוסקר בע"מ | 015-000-003 | |
| בקרת איזוטיפ עיזים IgG | מו"פ D | AB-108-C | |
| NKX6-1 (1:2,000) | DSHB | F55A10 | |
| PDX1 (1:100) | R& D | AF2419 |
מקורות
- Canadian Diabetes Association. , Available from: http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes (2016).
- Cogger, K., Nostro, M. C. Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes. Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).
- Nostro, M. C., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
