מאמר שיטה

תאיים מכתים cytometry זרימה לזהות לימפוציטים קבוצות משנה בתוך Murine אבי העורקים, כליות בלוטות לימפה מודל של יתר לחץ דם

DOI:

10.3791/55266

⸱

28 בינואר 2017

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, 3Department of Pharmacology and Toxicology, Faculty of Pharmacy, Mansoura University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מספק מתודולוגיה מפורט לזהות ולכמת תת T לימפוציטים תפקודית נוכח בתוך הכליה בעכברים, אבי העורקים ובלוטות לימפה על ידי מכתים תאיים cytometry הזרימה. המודל של יתר לחץ דם הנגרמת אנגיוטנסין II נבחר להסביר, צעד אחר צעד, את הנהלים ואת עקרונות יסוד של cytometry זרימה מכתים תאי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כיום ידוע היטב כי לימפוציטים מסוג T ממלאים תפקיד קריטי בהתפתחות של מספר מחלות לב וכלי דם1,2,3,4,5. לדוגמה, מחקרים מקבוצתנו הראו כי יתר לחץ דם קשור להצטברות מוגזמת של תאי T בכלי הדם ובכליות במהלך התפתחות יתר לחץ דם ניסיוני6. ברגע שהם נמצאים ברקמות אלה, תאי T מייצרים מספר ציטוקינים המשפיעים על תפקוד כלי הדם והכליות ומובילים להתכווצות כלי הדם ואגירת נתרן ומים1,2. כדי להבין באופן מלא כיצד תאי T גורמים למחלות לב וכלי דם וכליות, חשוב להיות מסוגל לזהות ולכמת את תת-הקבוצות הספציפיות של תאי T הקיימות ברקמות אלה. תת-קבוצות של תאי T מוגדרות על ידי שילוב של סמני פני השטח, הציטוקינים שהם מפרישים וגורמי השעתוק שהם מבטאים. המורכבות של אוכלוסיית תאי T הופכת את ציטומטריית הזרימה והצביעה התוך-תאית לטכניקה שלא תסולא בפז לניתוח הפנוטיפים של הלימפוציטים הקיימים ברקמות. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לזיהוי סמני פני השטח והתוך-תאיים (ציטוקינים וגורמי שעתוק) בתאי T שבודדו מכליות עכברים, אבי העורקים ובלוטות לימפה מנקזות אבי העורקים במודל של יתר לחץ דם המושרה על ידי אנגיוטנסין II. השלבים הבאים מתוארים בפירוט: בידוד הרקמות, יצירת תרחיפי התא הבודד, גירוי ex vivo, קיבוע, חדירות וצביעה. בנוסף, נדונים מספר עקרונות בסיסיים של ניתוחים ציטומטריים של זרימה, כולל בחירת הבקרות המתאימות ואסטרטגיות שער מתאימות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עדויות עדכניות מוכיחות כי המערכת החיסונית אדפטיבית, במיוחד לימפוציטים מסוג T, לשחק תפקיד קריטי בהתפתחות של מחלות לב וכלי דם כמה 1,2,3,4,5. לדוגמא, במודל של יתר לחץ דם נגרמת השני אנגיוטנסין, הצטברות של תאי T על כלי דם הכליות של עכברים תוארה 6. ההצטברות של כלי הדם היא בעיקר בארצות adventitia ואת שומן perivascular. בכליה, תאי T להצטבר הן לשד ואת קליפת הכליה. תלוי באיזה משנה מעורב, תאי T אלו מעוררים ציטוקינים שונים שיכולים להשפיע על תפקוד כלי הדם ואת הכליות ואת להוביל להתפתחות של הפתולוגיה (נבדקה על ידי מקמאסטר et al. 6).

לימפוציטים עוזר CD4 + T ניתן לחלק תת כמה: 1 T מסייעים (Th1), Th2, Th9, TH17, Th22, הרגולציה T (Treg) תאים, עוזר הזקיקים T (TFH) תאים בהתבסס על תפקידיהם ציטומגלווירוס חתימהkines 7. באופן דומה, CD8 + T ציטוטוקסיים תאים ניתן לסווג Tc1, Tc2, Tc17 או Tc9 8. יש גם תאי T כפולים והפוכים (תאים כלומר אינו מבטאים את CD4 או CD8 סמני תא T). תת-קבוצה קטנה של תאים אלה יש קולטן תא T דלתא גמא חלופי (במקום קולטני אלפא ובטא קלאסית) ולכן מכונים תאי T דלתא גמא. הניתוח הרב-פרמטר ידי cytometry זרימת סמן משטח, ציטוקינים ו גורם שעתוק מהווה את הגישה הטובה ביותר כדי לזהות תאים אלה. אמנם שיטה זו נעשתה שימוש נרחב בתחום האימונולוגיה, היא מתוארת פחות טובה באיברים מוצקים על הרקע של מחלות לב וכלי דם.

מבחינה היסטורית, זיהוי של לימפוציטים ברקמות הוגבל אימונוהיסטוכימיה או גישות RT-PCR. למרות אימונוהיסטוכימיה ו immunofluorescence שיטות רבות עצמה כדי לקבוע את חלוקת הרקמות של אנטיגן של interest, הם אינם מספיקים phenotypically לזהות תת מעורב. בנוסף, בעוד ניתוח RT-PCR שימושי כדי לזהות ביטוי mRNA של אנטיגנים, ציטוקינים או גורמי שעתוק, היא אינה מאפשרת זיהוי של חלבונים מרובים בו זמנית ברמה של תאים בודדים.

הופעתו של זרימת cytometry, במיוחד בשילוב עם מכתים תאי לזהות ציטוקינים גורמי שעתוק, מספקת חוקרים עם טכניקה רבה עצמה המאפשרת זיהוי וכימות ברמת התא הבודדה של תת תאים חיסוניים איברים מוצקים. יש לנו אופטימיזציה ב assay מכתים תאיים לזהות על ידי זרימת cytometry תת תא T הגדולות נמצאות בכליות בעכברים, אבי העורקים ובלוטות לימפה ניקוז אבי העורקים במודל של יתר לחץ דם הנגרמת אנגיוטנסין II. אופטימיזציה של כל שלב: עיכול רקמות, לשעבר vivo הפעלה, permeabilization, ומשטח ותוצאות מכתימות תאיות בתוך ביותר מחדשassay הפקה כי ניתן ליישם מודלים למחלות לב וכלי דם כליות אחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטיפול בבעלי החיים המוסדיים של האוניברסיטה ונדרבילט ועדת השימוש אשרה את ההליכים המתוארים במסמך זה. עכברים הם שוכנו וטפלו בהתאם המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה (הוצאת האקדמיה הלאומית. מתוקנים 2010).

1. ניתוק של ניקוז בלוטות הלימפה אבי העורקים, כליות ואבי העורקים מעכברים

  1. להרדים את העכברים משאיפת CO 2. תרסיס החזה עם 70% אתנול ו לפתוח בזהירות את העור ואת בית החזה עם מספריים כדי לחשוף את הלב.
  2. כדי perfuse כלי הדם, לבצע חתך קטן העלייה הימנית ולהזריק בהתמדה לפחות 10 מ"ל של קר PBS (כ 1 מ"ל / sec) לתוך איפקס של החדר השמאלי באמצעות מחט G 21 או 23. Perfuse עד שכל האיברים יש החוויר. הלב מחוויר ראשון. הלבנה של הכבד עולה כי זלוף שבוצע היטב.
  3. בעזרת מלקחיים קטנים מספריים בסדר, בעדינות לחתוך ולשלוף את המעיים,קיבה, טחול, לבלב וכבד לדמיין את אב העורקים טוב יותר.
    הערה: שלב זה חייב להיעשות בדיוק רב כמו נזק מערכת העיכול יכול לגרום לזיהום.
  4. לגזור ולהסיר כל ריאות במספריים. יש לשטוף את חלל החזה עם בופר פוספט (PBS) באמצעות מזרק ללא מחטים. הסרת עודפי דם ונוזלים באמצעות גזה סטרילי.
  5. הסר את בלוטות הלימפה בטן אאורטלי ניקוז באמצעות מלקחיים לנתח בסדר. ודא שלא לקרוע את הקפסולה. להסיר את השומן הנותר על פני השטח של כל צומת הלימפה עם מלקחיים לנתח. לגזור שתי הכליות עם מספריים בסדר.
  6. לנתח את אבי העורקים כולו (אבי העורקים החזי בטן) עם מספריים בסדר, מעוקל. התחל ברמה של הלב ובזהירות לנתח מן הוושט החוליות עד לרמה של הסתעפות הכסל והקפד לשמור את שומן perivascular שמסביב מצורף האאורטה.
    הערה: לנתיחה נוספת של אב העורקים אל רמיve מבנים שמסביב ניתן לעשות זאת תחת מיקרוסקופ. באופן ספציפי, להסיר ענפים עורקים (עורקי ראש, עורקי subclavian, צליאק, mesenteric, ועורקי כליות) ובלוטות לימפה. האם לשמור על שכבה אחידה של שומן perivascular סביב כל האאורטה מאז זה הוא אתר שבו הרבה תאים דלקתיים מתגוררים ההגדרה של יתר לחץ דם. מניחים כל רקמת צינורות נפרדים המכיל PBS קר.

דור 2. השעיות תא בודדות מתוך כל רקמות

  1. הכליות
    הערה: כליות ניתן ניתק לתוך ההשעיה תא בודד על ידי שילוב ניתוק מכני בתוספת עיכול אנזימטי.
    1. הכן את הפתרון העיכול כליות ידי הוספת D collagenase (2 מ"ג / מ"ל) ו DNase אני (100 מיקרוגרם / מ"ל) כדי RPMI בינוני 1640 (בתוספת 5% בסרום שור העובר (FBS)). כן 10 מיליליטר לדגימת כליות.
    2. שימוש במלקחיים להעביר את שתי הכליות לתוך צינור דיסוציאציה המכיל 10 מ"ל של כליות לעכלפתרון יון.
    3. בצע את הניתוק המכאני באמצעות מכשיר Dissociator אוטומטי למחצה על פי הוראות היצרן.
    4. לאחר ניתוק מכני, לנתק את הצינור מהמכשיר ולבצע את עיכול אנזימטי. דגירת הדגימות במשך 20 דקות ב 37 ºC תחת סיבוב רציף. מיד לעצור את עיכול אנזימטי על ידי הוספת בינוני קר RPMI 1640 בתוספת 5% FBS.
    5. מעבירים את הפתרון על ידי pipetting לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל לאחר סינון דרך מסננת 40 מיקרומטר. להקניט את הרקמה הנותרת לגזרים על ידי לחיצה עם הבוכנה של מזרק 1 מ"ל. גלולת התאים (500 XG, 8 דקות, 4 ºC).
    6. Resuspend גלולה לתוך 3 מ"ל של התקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות 36%. מעבירים את ההשעיה לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. בעדינות להוסיף 3 מ"ל של התקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות 72% מתחת ההשעיה תא 3 מ"ל 36% ללא כל הפרעה. צנטריפוגה (1,000 XG ללא בלם, 20 דק ', 4 ° C).
    7. התא החיסוני ימוקם על הממשק. הסר את השכבה העליונה צהבהב המכיל פסולת הסלולר ולאחר מכן להביא את נפח עד 15 מ"ל באמצעות PBS קר. לנער היטב להתמוטטות השיפוע. ספין התאים (300 XG, 8 דקות, 4 ° C) ו resuspend גלולה ב 3 מ"ל של RPMI עם FBS 5%. ספירת תאי חיים על hemocytometer באמצעות הרחקה כחולה Trypan.
  2. אבי העורקים
    1. הכן את הפתרון העיכול אבי העורקים על ידי הוספת collagenase (1 מ"ג / מ"ל), B collagenase (1 מ"ג / מ"ל), ו DNase אני (100 מיקרוגרם / מ"ל) כדי RPMI 1640 בינוני (בתוספת 5% FBS).
    2. בעזרת מלקחיים בסדר, להעביר את אבי העורקים לתוך צינור 2 מ"ל המכילה 1 מ"ל של פתרון העיכול אבי העורקים. לרכך את אבי העורקים כולו לחתיכות קטנות מאוד עם מספריים בסדר בפתרון עיכול 1 מ"ל. שמור על הקרח. דגירת הדגימות במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס מתחת סיבוב רציף.
    3. מעבירים את הפתרון לצלחת בתרבית רקמה ולעצור את enzymaעיכול טיק ידי הוספת 5 פעמים את נפח קר RPMI עם 5% FBS.
    4. מעבירים את הפתרון על ידי pipetting לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל לאחר סינון דרך מסננת 40 מיקרומטר. להקניט את הרקמה הנותרת בנפרד לתוך ההשעיה תא בודד על ידי לחיצה עם הבוכנה של מזרק 1 מ"ל. שטוף את מסננת גלולת התאים (300 XG, 8 דקות, 4 ºC).
    5. שטפו את הכדור על ידי הוספת 10 מ"ל של RPMI עם 5% FBS. ספין התאים (300 XG, 8 דקות, 4 ° C) ו resuspend גלולה ב 3 מ"ל של RPMI עם FBS 5%. ספירת תאי חיים על hemocytometer באמצעות הרחקה כחולה Trypan.
  3. בלוטות הלימפה לנקז אבי העורקים
    1. מניחים מסננת 40 מיקרומטר בצלחת בתרבית רקמה (60 מ"מ x 15 מ"מ). מניחים את בלוטות הלימפה על מסננת ומקניטים אותם בנפרד לתוך ההשעיה תא בודד על ידי לחיצה עם הבוכנה של מזרק 1 מ"ל. שטוף את מסננת עם 2 מ"ל של RPMI עם 5% FBS. אוספים את התאים בצלחת.
    2. לְהַעֲבִיראת התאים לתוך צינור בז 15 מ"ל ו גלולה התאים (300 XG, 8 דקות, 4 ºC). Resuspend גלולה ב 500 μl של RPMI עם 5% FBS. ספירת תאי חיים על hemocytometer באמצעות הרחקה כחולה Trypan.

3. Ex Vivo גירוי עבור איתור ציטוקינים על ידי cytometry זרימה

  1. כן תקשורת תרבית תאים: RPMI עם 5 FBS%, 0.1 מ"מ של חומצות אמינו לא חיוניים, 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין.
  2. צנטריפוגה כל ההשעיה תא המתקבל כליות, אבי העורקים ובלוטות לימפה (300 XG, 8 דקות, 4 ºC). Resuspend כל גלולה עם תקשורת תרבית תאים בריכוז של 1 x 10 6 תאים לכל מיליליטר.
  3. לעורר תאים על ידי הוספת 2 μl של קוקטייל הפעלת התא (המכיל phorbol 12-Myristate 13-אצטט (PMA), את ionomycin ionophore סידן, מעכבי Golgi Brefeldin א) עבור כל 1 מ"ל של תרבית תאים.
    הערה: הריכוז הסופיים של כל רכיב הם: 81 ננומטר של PMA, 1.33 מיקרומטר של ionomycin ו 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של Brefeldin א טיפול עם PMA ו ionomycin מפעיל תאים לייצר ציטוקינים. ציטוקינים מופרשים חלבונים חייבים להיות לכוד בתוך התאים כדי להתגלות. Brefeldin גורמת להצטברות חלבון המופרש בדרך כלל במנגנון הרטיקולום ו Golgi endoplasmic. לכן, השיטה המתוארת כאן משפר את detectability של לימפוציטים המייצרים ציטוקינים על ידי cytometry הזרימה.
  4. לוח 1 כדי 2 מיליון תאים בתוך 12 גם (אבי העורקים או בכליות) או 24 גם (קשרי לימפה) צלחות-דבקות נמוכה. מניחים את הצלחת CO 2 באינקובטור humidified 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
    הערה: מספר תאים מצופים עשוי להיות נמוך בבלוטות הלימפה מעכברים שליטים. כמו כן, הזמן של גירוי צריך להיקבע באופן אמפירי עבור כל אוכלוסיית תא ציטוקינים למד. במקרה של תאי T מבודדים אב עורקים, בלוטות כליות או הלימפה, אנו ממליצים מגרים במשך 3 עד 4 שעות. גירוי יותר wחולה לא להגביר את הפרשת ציטוקינים ו יניעו downregulation נוספת של סמנים פני התא כמה T כמו CD3, CD4 ו CD8. (יש לציין כי אפילו גירוי 3-4 שעות יניע כמה downregulation של סמנים אלה.)

מכתים Surface 4.

  1. העברת התאים לתוך צינור קלקר FACS ו צנטריפוגות (300 XG, 8 דקות, 4 ° C). שוטפים את התאים פעמיים עם חיץ FACS (Ca 2 + ו Mg + FBS 4% חינם PBS המכיל ו 2 מ"מ EDTA) ולחלק את ההשעיה תא באופן שווה לתוך צינורות FACS שונים המבוססים על מספר לוחות נוגדן הרצוי ומספר צינורות מלאה הצורך ( ראה למטה).
  2. כדי לבצע פיצוי עבור כל פנל, להכין צינורות שליטה בלא כתם וצינורות צבעוניים אחת עבור כל סוג רקמת פנל נוגדן. בנוסף, להכין אחד מינוס קרינת צינורות מלאים (FMO) עבור כל פנל נוגדנים על ידי הוספה כל פרט לאחד את הנוגדנים.
  3. כוון את עוצמת הקול של כל צינור עד 2 מ"ל עם FACSבַּלָם. צנטריפוגה ההשעיה תא (300 XG, 8 דקות, 4 ° C), להסיר את קולטני supernatant ולחסום Fc ידי דוגרים את התאים עם 0.5 מיקרוגרם של נוגדנים נגד CD16 / CD32 למיליון תאים עבור 10 דקות על הקרח.
    הערה: CD16 הוא נמוכה זיקה IgG Fc קולטן III (FCR III) ו CD32 הוא FCR השני. CD32 CD16 / באים לידי ביטוי על גרנולוציטים, תאים תורנים, מונוציטים / מאקרופאגים, תאי הרג טבעיים, תאי B, תאים דנדריטים וכמה תאי הבוגרים T מופעלים.
  4. בצע מכתים הכדאיות: שוטפים את התאים עם 1X PBS, צנטריפוגות (300 XG, 8 דקות, 4 ° C) ו resuspend ב 1,000 μl של 1x PBS. הוסף 1 μl של (כתם כדאי) צבען התגובה אמין תא-impermeant. דגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C המוגנים מפני אור.
  5. במהלך הדגירה, להכין את הקוקטייל של נוגדנים (עבור מכתים משטח) ב נפח מתאים של חיץ FACS. שוטפים את התאים פעמיים עם 1-2 מ"ל של חיץ FACS, צנטריפוגות (300 XG, 8 דקות, 4 ° C) ו resuspend כל גלולה עם 100 μlשל תערובת נוגדנים. דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C המוגנים מפני אור.
    הערה: עבור כל זרימת cytometry נוגדנים, כדאי לקבוע את הכמות האופטימלית של נוגדן צורך ידי ביצוע עקומת טיטרציה מנה.
  6. שוטפים את התאים פעמיים עם 2 מ"ל של חיץ FACS ו גלולה התאים (300 XG, 8 דקות, 4 ° C).

5. קיבוע, Permeabilization ו תאיים מכתים

  1. בצע את המכתים התאי עם ערכת קיבעון permeabilization המכילה מאגרים המתאים על פי ההוראות של היצרן. תיקון ו permeabilize התאים על ידי resuspending אותם למאגר המתאים. דגירה דגימות עבור 40 דקות ב 4 ° C מוגן מפני אור.
  2. הוסף 1 מ"ל של 1x permeabilization ולשטוף חיץ ישירות אל התאים קבועים permeabilized. צנטריפוגה (500 XG, 8 דקות, 4 ° C) ולהסיר את supernatant. Resuspend גלולה עם 2 מ"ל של חיץ 1x הכביסה.
  3. מכינים את תערובת של antibodies (עבור מכתים תאי בלבד) ב נפח מתאים של חיץ לשטוף 1x (בדרך כלל 100 μl לכל צינור).
    הערה: כפי שתואר לעיל, ריכוז הנוגדן האופטימלי צריכה להיקבע עבור כל נוגדן בחלונית. לדוגמא, עבור נוגדני IL-17A או IL-17 ו, אנו משתמשים גורמים לדילול של 1:30, אבל נוגדני IFNγ ו- T-הימור, אנו משתמשים גורמים לדילול של 1: 100.
  4. צנטריפוגה התאים (500 XG, 8 דקות, 4 ° C) ו resuspend כל גלולה עם 100 μl של תערובת נוגדנים. דגירה במשך 40 דקות ב 4 ° C המוגנים מפני אור.
  5. שוטפים את התאים פעמיים עם 2 מ"ל של חיץ לשטוף 1x ו גלולה התאים (500 XG, 8 דקות, 4 ° C). Resuspend גלולה עם 300 μl של חיץ לשטוף 1x ולנתח על cytometer זרימה עם מסננים מתאימים.
  6. עבור כימות של המספר הכולל של תאים לכל דגימת רקמה, השתמש חרוזים והיד עוד נטויה. לפני הרכישה, להוסיף חרוזים נפח / מספר לספור מומלץ צינור אחד.

6. פיצויים, Gating, נורמליזציה, וטיפים

  1. פיצויים gating
    1. הפעילו צינורות שליטה מוכתמים בלא כתם היחידים לפיצוי להתאים עבור חפיפה ספקטרלית.
      הערה: שימוש פיצוי חרוזים ולא שולט פיצוי מבוסס תאים יש צורך במקרים בם את האנטיגן של עניין או אוכלוסיית תאים במדגם נמצא ברמות נמוכות כך פיצוי באמצעות תא יהיה קשה. כן, יש לציין, כאשר באמצעות צבעים טנדם, רצוי להכין פיצויים עבור כל ניסוי מאז צבעי בד בבד להשתנות הרבה-אל-הרבה ועם כל יום.
    2. הפעל קרינה מינוס אחד שולט (FMOs) עבור כל fluorophores בלוח בעת הפעלת ניסוי ססגוניות חדש.
      הערה: פקדי FMO הם דגימות המכילות את כל הנוגדנים בלוח למעט אחד. בקרות אלה להתיר אפליה מדויקת של חיובים לעומת אותות שליליים על הנוגדן נמנע adjus כראויt השערים. בקרות אלה חשובות במיוחד כאשר רמות הביטוי נמוכות או כאשר ההפרדה של אוכלוסיית היעד היא עניה (למשל, כאשר היעד הוא ציטוקין או גורם שעתוק). אמנם לא תמיד הכרחי, במקרים מסוימים, שולטת אלוטיפ עשוי להיות מועדף במקום FMO שולטת כפי שהם מספקים פיצוי הולם עבור אלוטיפ נוגדן המצומד fluorophore ללא הספציפיות של אנטיגן.
    3. הגדר את השער העיקרי: התאמת אזור פיזור קדימה (FSC-A) ושטח פיזור צד (SSC-A) מתח כדי לזהות את האוכלוסייה לויקוציטים.
    4. אל תכלול את התאים המתים.
      הערה: כתם הכדאיות מגיב עם אמינים חינם נוכח משני פני השטח ואת הפנים של התאים. בניגוד לחיות תאים, תאים מתים (עם ממברנות שנפרצו) לאפשר לצבוע להיכנס לתוך הציטופלסמה, הגדלת כמות תיוג חלבון. לכן, תאים מתים יהיו בהירים יותר תאי חיים המאפשרים אפליה קלה. שער על החיתאים.
      הערה: את הכדאיות של מתלי תא מאבי עורק ואת הכליות עשויה להיות נמוכה יותר את הכדאיות של מתלי התא מן הבלוטות הלימפה עקב צעד עיכול הנוסף.
    5. פינת העלילה קדימה פיזור (FSC-A) [ציר y] ו גובה פיזור קדימה (FSC-H) [ציר x]. Singlets להופיע בתור באלכסון על עלילת נקודה זו. שער על אלכסוני זה להוציא כפילויות. ואז העלילה SSC-A [ציר y] ו CD45 [ציר x].
    6. אוכלוסיית CD45 + לויקוציטים ניתן לזהות בקלות. שער על אוכלוסייה זו. ניתן לזהות אוכלוסיות לאחר מקרב אוכלוסייה זו.
  2. נורמליזציה של ספירת תאים
    1. יש חרוזי ספירת מאפיינים לגרום SSC FSC הגבוה הנמוך. לדוגמה, אם 50,000 חרוזים מתווספים לתוך 300 μl של ההשעיה תא בודד, המשוואה לחישוב המספר המוחלט של כל סוג תא לתת לכל צינור הוא כדלקמן:
      מספר התאים pאה צינור = (50,000 / מספר החרוזים נספרו על ידי cytometer את הזרימה) x מספר התאים הספרתיים.
      באמצעות חישוב זה, המספר המוחלט של כל סוג תא נתון לכל צינור ניתן לקבוע. בהתבסס על כמה צינורות נבעו כל איבר, מספר תאים לכל איבר ניתן לחשב.
      הערה: שמור את כל התאים ריאגנטים על 4 מעלות צלזיוס במהלך הפרוטוקול. הימנע vortexing נמרץ כי זה יכול לגרום נזק לתאים. השתמש כוחות מינימאליים עד גלולת התאים. הימנע עושה בועות בצינור FACS שכן הוא יכול לזרז מוות של תאים. אל תתנו הכדורים להתייבש בכל עת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מתואר היתרים לזיהוי סמני משטח ו תאי בתאי T שבודדו כליות בעכברים, אב עורקים ובלוטות לימפה ניקוז אב עורקים במודל של יתר לחץ דם אנגיוטנסין II מושרה. תוצאות נציג מוצגים להלן.

איור 1 מדגים את אסטרטגית gating המשמשת לזיהוי אוכלוסיית תא T ב השעית תא בודדת המוכנה מן האאורטה של עכבר WT חדורי אנגיוטנסין II לגרום ליתר לחץ דם. אסטרטג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר כאן עבר אופטימיזציה לזיהוי נכון של תת-קבוצות של תאי T הקיימות בכליות העכברים, אבי העורקים ובלוטות הלימפה. ניתן להתאים פרוטוקול זה בקלות לבחינת תת-קבוצות אחרות של תאים חיסוניים כגון לימפוציטים B ותאי חיסון מולדים וניתן לשנות אותו כך שיכלול סוגי רקמות אחרים. שלב העיכול הוא קריטי ויש לשנות אותו ולבצע אופטימיזציה עבור כל רקמה9. שלב עיכול ממושך או שימוש באנזים לא מתאים יכולים להשפיע על יציבות ביטוי האנטיגן. באופן דומה, עיכול לא שלם יכול להשפיע על התוצאות ולהוביל למספר נמוך יותר של תאים חיוביים. יתר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MSM הוא נתמך על ידי מענק מטעם לב וכלי דם מדעי גלעד.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי פרס אחוות איגוד הלב האמריקני (16POST29950007) כדי FL, מענק מערך ההדרכה של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב (NIH T32 HL069765) כדי BLD, פרס אחוות איגוד הלב האמריקני (14POST20420025) כדי MA סאלח, וכן NIH פרס K08 (HL121671) כדי MSM. MSM נתמכת גם על ידי מענק מחקר מן Gilead Sciences, Inc.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קולגנאז DROCHE11088882001
קולגנאז AROCHE10103586001
קולגנאז BROCHE11088815001
DnaseROCHE10104159001
1x מאגר ליזה של תאי דם אדומיםeBioscience00-4333-57
RPMI בינוני 1614 1xGibco11835-030
DPBS ללא סידן ומגנזיוםGibco14190-144
PercollGE Healthcare17-5445-02לצנטריפוגה שיפוע צפיפות
GentleMACS™ שפופרת CMiltenyi Biotec130-096-334
מכשיר דיסוציאטור GentleMACSMiltenyi Biotec130-093-235השתמש בתוכנית
SPLEEN_04 קוקטייל הפעלת תאים (עם Brefeldin A)Biolegend423303
anti-CD16/32 eBioscience14-0161-81לדלל 1:100
LIVE/DEAD ערכת כתמי תאים מתים סגולים ניתנים לתיקון LifeTechnologiesL34955
סט מאגר גורם שעתוקBD Pharmingen562725
OneComp ePackage eBioscience01-1111-42
123 ספירה eBeadseBioscience01-1234-42
CD45 AmCyan (שיבוט 30-F11)BioLegend103138
CD3 PerCP-Cy5.5 (שיבוט 17A2)BioLegend100218
IL-17A FITC (שיבוט TC11-18H10.1)BioLegend506910
IL-17F APC (שיבוט 9D3.1C8)BioLegend
CD4 APC-Cy7 (שיבוט GK1.5)BD Biosciences560181
CD8 APC (שיבוט 53-67)eBioscience17-0081-82
T-bet PE-Cy7 (שיבוט 4B10)BioLegend644823
IFNγ FITC (שיבוט XMG1.2)BD Biosciences557724
517004

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Saleh, M. A., McMaster, W. G., Wu, J., et al. Lymphocyte adaptor protein LNK deficiency exacerbates hypertension and end-organ inflammation. J Clin Invest. 125 (3), 1189-1202 (2015).
  2. Madhur, M. S., Lob, H. E., McCann, L. A., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55 (2), 500-507 (2010).
  3. Laroumanie, F., Douin-Echinard, V., Pozzo, J., et al. CD4+ T Cells Promote the Transition From Hypertrophy to Heart Failure During Chronic Pressure Overload. Circulation. 129 (21), 2111-2124 (2014).
  4. Guzik, T. J., Hoch, N. E., Brown, K. A., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204 (10), 2449-2460 (2007).
  5. Ketelhuth, D. F. J., Hansson, G. K. Adaptive Response of T and B Cells in Atherosclerosis. Circ Res. 118 (4), 668-678 (2016).
  6. McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, Immunity, and Hypertensive End-Organ Damage. Circ Res. (6), 1022-1033 (2015).
  7. Luckheeram, R. V., Zhou, R., Verma, A. D., et al. CD4+T Cells: Differentiation and Functions. Clin Dev Immunol. 2012, 1-12 (2012).
  8. Mittrücker, H. -W., Visekruna, A., Huber, M. Heterogeneity in the differentiation and function of CD8+ T cells. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 62 (6), 449-458 (2014).
  9. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).
  10. Finak, G., Langweiler, M., Jaimes, M., et al. Standardizing Flow Cytometry Immunophenotyping Analysis from the Human ImmunoPhenotyping Consortium. Sci Rep. 6, 20686(2016).
  11. Herzenberg, L. A., Parks, D., Sahaf, B., Perez, O., Roederer, M., Herzenberg, L. A. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
  12. Hrvatin, S., Deng, F., O'Donnell, C. W., Gifford, D. K., Melton, D. A. MARIS: method for analyzing RNA following intracellular sorting. PLoS One. 9 (3), 89459(2014).
  13. Kalisky, T., Quake, S. R. Single-cell genomics. Nat Methods. 8 (4), 311-314 (2011).
  14. Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: Today's technology and tomorrow's horizons. Methods. 57 (3), 251-258 (2012).
  15. Jiang, L., Tixeira, R., Caruso, S., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nat Protoc. 11 (4), 655-663 (2016).
  16. Lemoine, S., Jaron, B., Tabka, S., et al. Dectin-1 activation unlocks IL12A expression and reveals the TH1 potency of neonatal dendritic cells. J Allergy Clin Immunol. 136 (5), 1355-1368 (2015).
  17. Gaublomme, J. T., Yosef, N., Lee, Y., et al. Single-Cell Genomics Unveils Critical Regulators of Th17 Cell Pathogenicity. Cell. 163 (6), 1400-1412 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים