הגנום עריכה בימוי בידול של hPSCs עבור חקירת גורמים המשפיעים Lineage בהתפתחות האנושית הלבלב

סיכום

פרוטוקולים כדי ליצור קווים מוטנטים hPSC באמצעות פלטפורמת iCRISPR וכדי לבדל hPSCs לתאי β-כמו גלוקוז-תגובה מתוארת. שילוב של טכנולוגית עריכת הגנום עם בידול מכוון hPSC מספק פלטפורמה חזקה עבור הניתוח השיטתי של תפקיד גורמי שושלת בהתפתחות אנושית והתקדמות מחלה.

תקציר

תפקוד גן חקירה בחידוש עצמי או הבחנת תאי גזע פלוריפוטנטיים אדם (hPSCs) מציע פלטפורמת ערך להבנת התפתחות אנושית לנתח מנגנוני מחלה בצלחת. כדי לנצל פוטנציאל היישום הזה דורש כלי הגנום עריכה יעילה לייצר מוטציות hPSC בגנים הקשורים במחלה, כמו גם פרוטוקולים בידול במבחנה hPSC לייצר תאים מסוגים רלוונטי-מחלה מקרוב לשחזר עמיתיהם in vivo שלהם. פלטפורמת הגנום עריכה יעילה עבור hPSCs בשם iCRISPR פותחה באמצעות מיקוד בתיווך Talen של קלטת ביטוי Cas9 שעבר על מקורות AAVS1. הנה, הפרוטוקולים עבור הדור של מושרת קווי Cas9 hPSC באמצעות תאים בתרבית בינוני הגדרה כימית ותנאי מזין ללא מתוארים. נהלים מפורטים עבור השימוש במערכת iCRISPR עבור נוקאאוט גנטי או שינויים גנטיים מדויקים hPSCs, בין אם באמצעות nהצטרפותו סוף על-הומולוגי (NHEJ) או באמצעות שינויי נוקלאוטיד מדויקים באמצעות תיקון מכוון הומולוגיה (HDR) בתבנית, בהתאמה, כלולים. נהלים טכניים אלה כוללים תיאורים של עיצוב, ייצור, transfection של RNAs מדריך CRISPR (gRNAs); מדידת שיעור המוטציות CRISPR ידי מבחני T7E1 או RFLP; וההקמה ותיקוף קווים מוטנטים משובטים. לבסוף, אנו נהלים כרוניקה לבידול hPSC לתאי β-כמו לבלב גלוקוז-תגובה על ידי חיקוי ב התפתחות עוברית לבלב vivo. שילוב של טכנולוגית iCRISPR עם בידול hPSC מכוונת מאפשרת בחינה שיטתית של תפקוד הגן כדי לקדם את ההבנה שלנו של מנגנוני המחלה סוכרת התפתחות הלבלב.

מבוא

תאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) יש את היכולת הוא עצמי לחדש להצמיח כל נגזרות השלוש השושלות הניבטות העובריות. הם מספקים משאב יקר ערך עבור טיפול בתחליפי תא דוגמנות מחלה ידי משמש פלטפורמה ייחודית לשחזר תהליכים תאיים בהקשר התפתחותי אדם. הם גם מקור של תאים הניסיונות עבור ניתוחי מדרגים, תפוקה גבוהה. עם זאת, התקדמות הוגבלה בגלל שני אתגרים מרכזיים: היעדר כלי הנדסה גנטית יעילים הקושי משחזר את הצעדים ההתפתחותיים העובריים המורכבים בצלחת תרבות.

הנדסה גנטית היא כלי הכרחי כדי ללמוד לתפקד גנים בפיתוח ומחלות נורמלים. עם זאת, בעוד הגן הקלאסי מיקוד גישות באמצעות רקומבינציה הומולוגיים הוכיחו להיות כלי רב עוצמה כדי לנתח תפקוד הגן בתאי גזע עובריים בעכבר (mESCs) ^1, גישה זולא יעיל כבר מאוד כאשר חלים על ^{2 hPSCs, 3.} הצטרפותן הנמרצת האחרונה של nucleases לתכנות, אתר ספציפי מטבע לשימוש במעבדה, כולל nucleases אצבע אבץ (ZFNs), nucleases מפעיל דמוי מפעיל שעתוק (TALENs), ואת חזרות palindromic קצרות interspaced התקבצו באופן קבוע (CRISPR) / CRISPR הקשורים (CAS) מערכות ^4, כלומר הנדסה הגנום הפכה משימה הרבה יותר קלה במגוון רחב של אורגניזמים שורות תאים, כולל hPSCs. כלי עריכת גנים אלה לנצל את העובדה nucleases כימרי כגון endonuclease Cas9 יכול להרשות מגוון שלם של שינויים גנטיים על ידי גרימת הפסקות פעמים התקועות (DSBs) במקומות מדויקים, מפעיל את מנגנון תיקון DNA אנדוגני כדי להפעיל או שאינו הומולוגי סוף להצטרף (NHEJ) או תיקון מכוון הומולוגיה (HDR). שני המנגנונים עשויים להיות מנוצלים עבור מניפולציה גנטית על ידי גרימת eithאה כניסה אקראית מוטציות מחיקות (indels; דרך NHEJ), ליצור מוטציות frameshift כי לבטל אללים גנים, או החלפות נוקלאוטיד מדויקות (באמצעות HDR), לשחזר מוטציות המטופל עבור מודלי מחלות אנושיים או לתקן מוטציה הגורמים למחלות עבור ריפוי גנטי .

CRISPR / הנדסת הגנום בתיווך קאש דורש שני מרכיבים: endonuclease Cas9 קבוע מודרך-רנ"א הדרושים מחשוף DNA ו RNA CRISPR משתנה (crRNA) והפעלת-טרנס (tracrRNA) דופלקס המציין זיהוי מטרות DNA. הדופלקס crRNA / tracrRNA יכול להיות מוחלף עם RNA מדריך כימרי יחיד (gRNA), אשר נמצאו לעבוד בצורה יעילה יותר ^{5, 6, 7.} בעוד מערכת CRISPR / Cas9 הותאמה אורגניזמים שורות תאים הניסיונות ביותר, המשלוח והביטוי של Cas9 ו gRNA משתנה משמעותי ועליו להיות מותאם יותר כדי אח"יערב עריכת הגנום יעיל במערכות רבות, כולל hPSCs ^8. פלטפורמה יעילה עריכת הגנום, iCRISPR, הוקמה בשנת hPSCs ^5. במערכת זו, גישה בתיווך Talen נעשה שימוש כדי למקד הן אללים של "מוקד נמל מבטחים transgene" AAVS1 טרנס, אלל אחד עם transactivator טטרציקלין שבשליטת הפוכה (M2rtTA) והשני עם אלמנט בתגובה טטרציקלין (TRE נהיגה) הביטוי של Cas9 (iCas9) ב hPSCs. בשורות משובטות הוקמו (iCas9 hPSCs), Cas9 מבוטא בכמות גבוהה עם טיפול דוקסיציקלין. בינתיים, בשל גודלו הקטן (100 NT), gRNAs בודדת או מרובה ניתן לשלוח בקלות לתוך iCas9 hPSCs עם יעילות גבוהה והוא יכול לכוון Cas9 עבור מחשוף אתר ספציפי, מה שמאפשר שיבוש גנטי NHEJ בתיווך יעיל, כמו גם HDR בתיווך שינויי נוקלאוטיד מדויקים בנוכחות דנ"א חד-גדילים קצרים תבניות תורמות (ssDNA). מערכת iCRISPR יכולה להיותהשתמשו כדי ליצור פאנל של מחלת-מחקה hPSC קווי עם biallelic (הומוזיגוטים או תרכובת הטרוזיגוטיים) או הטרוזיגוטיים הפסד של פונקציה מוטציות בגנים התפתחותי חשוב בהצלחה ^{5, 9.} בעוד מספר קבוצות דיווחו עריכה יעילה של גנים באמצעות CRISPR / קאש ב hPSCs, ההצלחה נותרת מוגבלת למספר קטן של מעבדות מיומנות מבחינה טכנולוגית. פלטפורמת iCRISPR מציעה פתרון יעיל אך פשוט לעריכת גן שיגרתית על ידי חוקרים של רמות מיומנות שונות, וזה כבר נעשה שימוש בכמה מחקרים שפורסמו על ידי הקבוצה שלנו ועוד ^{9, 10, 11, 12.} גישה זו גם הורחבה בהמשך השתקה מושרה מבוסס על הביטוי של dCas9-קראב ^13.

יחד עם התקדמות הטכנו עריכה-הגנוםמשעממים, שיפורים משמעותיים גם הושגו תחזוקת hPSC והבחנה מכוונת. תנאי תרבות עבור hPSCs התפתחו מעכבר מוקרן פיברובלסטים עובריים (iMEF) מזין תלוי לתנאים מזינים חינם על רכיבים תאים מטריקס מוגדר, ומתוך ניסוחי מדיה מורכבים לתנאים בינוניים הגדרה כימית ^14. שיפורים כאלה צמצמו את השתנות hPSCs בשל תצווה ל-תצווה הבדלי רכיבי החלפה בסרום הכנה בנוקאאוט iMEF, ובכך לספק סביבה לשחזור יותר לבידול hPSC. בינתיים, ידע משופר של מסלולי איתות לפיקוח על בנייה עוברית אנושית, כמו גם תגליות מן קרנות תרופת תפוקה גבוהה, הוביל פרוטוקולי בידול משופרים ^{15, 16, 17, 18.} פרוטוקולים אלה לחקות באופן הדוק יותר ב vivo צעדים התפתחותיים וליצור תאים מסוגים כי מקרוב לשחזר עמיתיהם in vivo שלהם. לבידול hPSC לתוך שושלת הלבלב, פרוטוקולים ראשוניים חיקו התפתחות לבלב מוקדם יחסית טוב אבל בסופו של דבר שנוצרה תאי β polyhormonal שהיו של פנוטיפים עובר בשלה ומגיבים בצורה גרועה לגירוי גלוקוז. ¹⁶ הפיתוחים ^{האחרונים, 17, 19, 20} אפשרו לדור של תאי β-כמו הלבלב מגיב גלוקוז, אשר יאפשר לנו לחקור אירועים מאוחר יותר, כגון היווצרות ואת התבגרות נוספת של תאי β monohormonal.

כאן, אנו בפירוט את היישום של קווים-modified הגנום לחקר התפתחות לבלב על ידי שילוב של מערכת iCRISPR עם פלטפורמת בידול hPSC המבוססת במבחנה לקראת pancr גלוקוז-התגובהתאי β-כמו eatic. צימוד זה של כלי עריכת הגנום חזקים עם פרוטוקול בידול hPSC משופר לא רק מציע את המהירות בהיקף הצורך לענות על הדרישה הגוברת על תיקוף סיבתיות מחלה, אלא גם מאפשר מניפולציות גנטיות מתוחכמות עבור חקירות מכניסטית נוספות לתוך מלא תעתיק שבבסיס התפתחות נורמלית למחלה ⁹ .

פרוטוקול

פרוטוקול זה מבוסס על העבודה שלנו עם קווי hPSC H1, HUES8, ומל-1 במזין ללא מוגדרים כימי מצב (עיין חומר ולוח ציוד). עבור קווים או hPSCs hPSC אחרים שהושג בתנאי תרבות אחרים, אופטימיזציה נוספת מומלצת.

1. תרבות hPSC במצב הכימי מוגדר מזין ללא

1. להתאים את התרבות hPSC על ניזונים iMEF למצב מזין חינם. במקרים בהם תאים קפואים אינם שורדים היטב כאשר התאושש ישירות במצב מזין ללא, לשחזר תאים במצב iMEF הראשון ולאחר מכן להתאים את מצב מזין חינם.
   הערה: באופן כללי, זה לוקח 2 קטעים עבור hPSCs המתורבת על ניזונים iMEF להיות מותאמת למצב המזין חינם.
2. שנה את בינונית כל יום המסדרון, hPSCs כשהתאים הגיעו ~ 80% confluency. באופן כללי, hPSCs מעבר ב ~ 1: 6 - 01:15 יחסים כל 4 - 6 ימים. הוסף 10 מיקרומטר ROCK מעכב Y-27632 ש"שen הפשרה או passaging התאים.
3. לפני זריעת hPSCs, תרבות מנות טרום מעיל עם 5 מיקרוגרם / מ"ל (1 מ"ל / 10 ס"מ ²⁾ טופס אנושי רקומביננטי קטועה של vitronectin (VTN) לפחות 1 שעות בטמפרטורת החדר (RT). כמו כן, להכין בינוני מלא הגדרה כימית על ידי הוספת תוספת לתוך מדיום הבסיס.
4. הסר את המדיום תרבות, לשטוף את התאים פעם עם PBS ללא Ca ^{2 +} ו Mg ^2+, ולטפל את התאים עם 0.5 mM EDTA עבור ~ 2 - 5 דקות ב RT.
5. לשאוב EDTA לפני המושבות יש מנותקות. עם pipetting עדין, לפזר את מושבות hPSC לחתיכות קטנות resuspend התאים בינוני מלא.
6. אסוף את hPSCs ניתק לסובב את התאים ב XG 200 במשך 5 דקות. Resuspend את hPSCs pelleted במדיום המלא וזרעי התאים על צלחות מצופות VTN.

2. דור של קווי iCas9 hPSC

1. להזמין ולהגביר פלסמידים הבאים: AAVS1-Talen-L, AAVS1-Tאלן-R, AAVS1-ניאו-M2rtTA, ו AAVS1-Puro-iCas9.
   הערה: כדי למנוע אירועי רקומבינציה לא צפויים, להשתמש בתאי מוסמכות Stbl3 מחסר רקומבינציה עבור טרנספורמציה וההגברה של פלסמידים על 30 מעלות צלזיוס.
2. בדרך כלל, להכין את hPSCs בצלחת אחת של 10 ס"מ (~ 1 x 10 ⁷ תאים אם ~ 80% ומחוברות) עבור הניסוי מיקוד אחת.
   הערה: מאז electroporation בדרך כלל גורם מוות של תאים משמעותיים בתיווך Talen גן מיקוד שעבר על מקורות AAVS1 דורשים בחירה אנטיביוטיה, מספר רב יחסי של תאים צריך להיות זורע לזהות תאים ממוקדים כראוי. אופטימיזציה עבור ריכוזי התרופה מומלצת עבור כל קו משבץ וכל מצב תרבות.
3. ביום -1, (יום לפני electroporation), להוסיף מעכב רוק 10 מיקרומטר במהלך התקשורת לשנות.
4. ביום 0, (היום של electroporation), להכין צלחות VTN מצופה מראש.
5. לנתק את hPSCs לתוך תאים בודדים usiדיסוציאציה מגיב ng 1x (עיין חומר ולוח ציוד). בקצרה, להסיר את המדיום תרבות, לשטוף את התאים פעם עם PBS ללא Ca ^{2 +} ו Mg ^2+, ולטפל תאים עם מגיב דיסוציאציה 1x ב 37 מעלות צלזיוס במשך ~ 3 דקות. לשאוב מגיב דיסוציאציה לפני התאים יש מנותקים. עם pipetting העדין, לפזר את hPSCs לתוך השעית תא בודד ב 10.5 מיליליטר של מדיום מלא.
6. קח השעית תא 0.5 מיליליטר לספור את המספר הסלולרי באמצעות דלפק תא אוטומטי. גלולה hPSCs ב XG 200 במשך 5 דקות ו resuspend התאים קר (4 ° C) PBS ב 12.5 x 10 ⁶ תאים / מ"ל.
7. מוסיפים את פלסמידים (ראו טבלה 1) לתוך 800-μL ההשעיה hPSC (12.5 x 10 ⁶ תאים / מ"ל) ומערבבים היטב. מעבירים את התערובת קובט electroporation 0.4 ס"מ ולשמור על הקרח עבור ~ 5 דקות.
8. Electroporate את התאים באמצעות מערכת electroporation ב 250 V ו 500 μF; בפעם obs מתמידerved לאחר electroporation הוא בדרך כלל 9 - 13 ms.
9. לאחר electroporation, ולהעביר את התאים צינור חרוטי 15 מ"ל עם 5 מ"ל של מדיום מלאה מחומם מראש. קריטי עבור מיקוד מוצלח: hPSCs מתרבה בריאים לשימוש ולטיפול התאים בעדינות רבה בעת העברה, resuspending, ו ציפוי התא לאחר electroporation.
10. גלולת התאים ב XG 200 במשך 5 דקות. Resuspend התאים 10 מ"ל של מדיום להשלים עם 10 מיקרומטר ROCK מעכב צלחת 1, 2.5, ו -5 x 10 ⁶ תאים על כל אחד משלושת הכלים VTN-מצופה, 10 ס"מ; זה מבטיח כי לפחות אחד המלוחות תצטרך מושבות מספיק בצפיפות משובטת תא בודד לקטיף מושבה.
11. ביום 1 (מחרתיים electroporation), לשנות את המדיום.
12. בימים 2 - 5, להתחיל מבחר neomycin כשהתאים הם ~ 60% ומחוברות. שינוי המדיום יומי עם 500 מיקרוגרם / מ"ל ​​סולפט G418; מוות של תאים משמעותי בשל selection בדרך כלל הוא ציין 2 ימים לאחר בחירת G418.
13. ביום 6, לשנות את המדיום בלי מבחר אנטיביוטי.
14. בימים 7-9, להתחיל מבחר puromycin. שינוי המדיום יומי עם 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​puromycin dihydrochloride; יש לשים לב מוות של תאים משמעותי למחרת.
15. ביום 10, להתחיל לשנות את המדיום יומי ללא מבחר אנטיביוטי עד המושבות תא בודד hPSC להגיע 1 - 2 מ"מ קוטר.
    הערה: בדרך כלל, 50 מושבות בצלחת 10 ס"מ הם נצפו עם 2.5 x 10 ⁶ hPSCs מצופה ביום 0.
16. פיק 12 - 24 מושבות תחת סטראו. מבחינה מכנית disaggregate המושבות hPSC לחתיכות קטנות (~ 10 חתיכות לכל מושבה) באמצעות מחט 23-G (טיפ pipet 200 μL הוא גם בסדר) ולהעביר את התאים ישירות לתוך VTN מצופה 24 גם הצלחות.
17. שינוי המדיום יומי עד שהתאים להיות ומחוברות. מעבר התאים בכל טוב של 24 גם צלחות לתוךלשכפל בארות של 6 צלחות היטב.
18. כאשר התאים הופכים ומחוברים של 6 צלחות היטב, השתמש גם אחד עבור מניה קפוא והשנייה גם להפקת DNA הגנומי אפיון נוסף.
19. לאפיין ולאמת את קווי iCas9 שהקים גנוטיפ PCR, סופג הדרום, ניתוח RT-qPCR, karyotyping, ו assay pluripotency. עיין ואח ג'ו. ²¹ פרוצדורות מפורטות.

דור 3. hPSC Mutant קווי שימוש במערכת iCRISPR

1. הדור של קווי בנוקאאוט hPSC
   1. עיצוב וייצור gRNA
      1. בחר אזורי יעד הגן של עניין על מנת למקסם את האפשרות של שיבוש תפקוד חלבון wild-type. עבור גנים היטב מבוארים, לבחור אזור יעד במעלה זרם של תחום פונקציונלי חיוני. לחלופין, gRNAs עיצוב למקד לאזור במורד הזרם של קודון ההתחלה. בחר לפחות 2 שוניםאזורים עבור גן של עניין.
      2. gRNAs עיצוב באמצעות כלי עיצוב CRISPR מקוון (http://crispr.mit.edu). לכל איזור היעד, עיצוב 3 gRNAs עם פוטנציאל נמוך מחוץ מטרות ולהשתמש אחד עם יעילות מיקוד הגבוהה ביותר ליצירת קו מוטציה המשובטים ^22.
         הערה: על מנת להשיג יעילות עריכת הגנום גבוהה, מומלצת לספק gRNA כמו oligos RNA במקום כמו DNA פלסמיד בגלל יעילות transfection הגבוהה של RNA הקטן לעומת פלסמידים ניסיון העבר.
      3. להזמין 120 נוקלאוטידים (NT) oligos DNA המכיל את רצף האמרגן T7, רצף ההכרה משתנה 20-NT crRNA (N) ₂₀ (לא כולל את רצף PAM), ואת רצף מדריך כימרי מתמיד. לדלל את oligos כדי פתרון המניות 100 מיקרומטר DDH ₂ O ולהכין 250 ננומטר כמו הפתרון עובד.
         הערה: TAATACGACTCACTATAGGG (N) ₂₀ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT
      4. PCR-להגביר את oligos באמצעות פריימרים T7F ו TracrR (ראה טבלה 2) כדי לייצר את התבנית פעמיים תקועים DNA (dsDNA) עבור gRNA בתעתיק במבחנה (IVT). השתמש 50 μL של תערובת תגובת PCR (ראה טבלה 3) ותנאי מחזור PCR (ראה טבלה 4).
      5. השתמש ערכת שעתוק T7 תשואה גבוהה עבור בתעתיק במבחנה gRNA עם תבנית מוגבר PCR ב 20 μL, בתמהיל שעתוק במבחנה gRNA (ראו טבלה 5) על פי הוראות היצרן. לטהר את מוצרי gRNA באמצעות ערכת ניקוי השעתוק על פי הוראות היצרן.
      6. Elute gRNAs בעקבות פרוטוקול טיהור תפוקה גבוהה פי הוראות היצרן (בדרך כלל ~ 50 - 100 מיקרוגרם) ב 100 μL של חיץ elution. התאם את הריכוז עד 320 ng / μL (10 מיקרומטר) במידת האפשר ולאחסן ב -80 &# 176; C עד השימוש.
   2. עיצוב פריימר רצף PCR ו סנגר
      1. עיצוב ולאמת פריימרים PCR הגברה באזור היעד, עם גדלי מוצר בדרך כלל נעים בין ~ 500 - 1,000 נ"ב.
      2. פריימרים רצף עיצוב סנגר מחייב פנימי למוצרים PCR לאפשר רצף ישיר של מוצרי ה- PCR ללא טיהור.
   3. transfection gRNA ב iCas9 hPSCs
      1. ביום -1, לטיפול בתאים iCas9 עם 2 מיקרוגרם / מ"ל דוקסיציקלין 24 שעות לפני transfection gRNA.
      2. ביום 0 של transfection gRNA, להכין צלחות מצופות VTN מראש.
      3. לנתק תאים iCas9 לתוך תאים בודדים באמצעות ריאגנט דיסוציאציה 1x, כמתואר בשלב 2.5.
      4. גלולה hPSCs ב XG 200 במשך 5 דקות ו resuspend התאים ב ~ 0.5 x 10 ⁶ תאים / מ"ל במדיום מלאה בתוספת 2 מיקרוגרם / מ"ל דוקסיציקלין מעכבי ROCK 10 מיקרומטר.
      5. פלייט 0.5 מיליליטר של תאי resuspended לתוך בארות בודדות של 24 גם צלחות. הכן בארות נוספות לשרת בקרות שאינן טרנספקציה כמו.
      6. עבור כל gRNA, להפיק את תערובות transfection הבאים: לערבב, 50 μL של המדיום סרום מופחת + 1 μL של gRNA (10 מיקרומטר); מיקס B, 50 μL של מדיום סרום מופחת + 3 μL של מגיב transfection.
      7. שלב Mix A ו- B כדי להפוך 100 תערובת μL. דגירה במשך 5 דקות ב RT. הוסף 50 μL של התערובת אל תאי הבארות הכפולות של 24 גם צלחות ומערבבות היטב.
      8. ביום 1, לבצע transfection שני במידת הצורך להגביר עוד יותר את יעילות המיקוד. אחרת, לשנות את המדיום בלי דוקסיציקלין.
      9. בימים 2 - 3, לשנות את המדיום יומי.
      10. ביום 4, לחלץ הדנ"א הגנומי של אחד טוב של כל תא שליטה transfected ולא transfected באמצעות ערכת חילוץ DNA. התאם את הריכוז ל -50 ng / μל
      11. PCR-להגביר אזורי יעד איגוף רצפי gRNA המיקוד ולהעריך את יעילות העריכה באמצעות שאני endonuclease T7 (T7EI) עיכול או פולימורפיזם אורך קטע הגבלה (RFLP) assay, כפי שתואר לעיל ^5.
   4. assay T7EI
      1. PCR-להגביר את אזור היעד באמצעות פריימרים המיועדים ומאומתים בשלב 3.1.
      2. הכן את התערובות (ראה טבלה 6) ולבצע denaturation דנ"א כלאה של מוצרי ה- PCR באמצעות תנאים המפורטים בטבלה 7.
         הערה: בהתבסס על הניסיון שלנו, זה בדרך כלל אין צורך לטהר מוצרים PCR עבור assay T7EI בעת שימוש במצב PCR שלנו. עם זאת, טיהור יכולה להועיל בתנאים אחרים.
      3. בצע עיכול T7EI על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות באמצעות 10 μL של מפוגל כלת מוצר PCR ו -0.2 μL (2 U) של T7E1 (10 U / μL).
      4. resolvדואר דגימות PCR-מתעכל T7E1 ידי ג'ל אלקטרופורזה. השתמש ImageJ לקבוע את עוצמות להקה היחסיות של לחתוך DNA נימול. חשב את תדירות indel באמצעות הנוסחה: (1 - (√ (1- (B + C)) / (a + b + c))) x 100, שם הוא העוצמה של המוצר PCR מעוכל ו- b ו- c הם העוצמות של המוצרים בקעו-T7E1.
   5. assay RFLP
      הערה: במקרים בהם אתר הגבלה נמצא בסמיכות (<5 נ"ב) לאתר מחשוף Cas9 (3 נ"ב 5 'של רצף PAM), ב assay RFLP ניתן לבצע כדי לכמת את תדירות indel.
      1. השתמש באותה המוצרים PCR כמתואר בשלב 3.1.4.1.
      2. לעכל את מוצר ה- PCR עם אנזים הגבלה המכיל אתר הגבלה בסמיכות לאתר מחשוף Cas9.
      3. לפתור את דגימות ה- PCR מעוכל על ידי ג'ל אלקטרופורזה. השתמש ImageJ לקבוע את עוצמות להקה היחסיות של לחתוך DNA נימול. חשב את indelתדירות באמצעות הנוסחא: a / (a + b + c) x 100, שם הוא העצמה של מוצר PCR המעוכל ו- b ו- c הן בעוצמות של המוצרים מתעכלים.
   6. הקמת קווים מוטנטים המשובטים
      הערה: הגנום ועריכת hPSCs באמצעות מערכת iCRISPR עם transfection gRNA היא יעיל ביותר, ואין מבחר אנטיביוטי הוא זקוק. כדי להקים קווי משובטים, יש צורך זרע תאים בצפיפות נמוכה יחסית על מנת להבטיח את ההיווצרות של מושבות תא בודד נגזרות.
      1. זהה gRNAs עם יעילות העריכה הגבוהה ביותר (באמצעות T7EI או assay RFLP) ועם הישרדות תא טובה. השתמש הכפולים המקבילים היטב להקמת קו מוטציה משובטת.
      2. לנתק את hPSCs לתוך ההשעיה תא בודד באמצעות ריאגנט דיסוציאציה 1x, כמתואר בשלב 2.5. Replate 500, 1,000, ו -2,000 תאים על כל אחד משלושת הכלים VTN-מצופה, 10 ס"מ.
      3. שנה את u היומי הבינוניntil מושבות-התא הבודד להגיע ~ 2 מ"מ קוטר.
      4. פיק 24 - 48 מושבות לכל gRNA, בהתאם להערכת ישיגו יעילות ידי T7EI ו / או assay RFLP. מבחינה מכנית disaggregate כל המושבה לחתיכות קטנות (~ 10 חתיכות לכל מושבה) באמצעות מחט 23-G (טיפ pipet 200 μL הוא גם בסדר) ו replate התאים כפולים VTN מצופה, 96-גם הצלחות. השתמש צלחת אחת להפקת DNA הגנומי רצף סנגר ואת הצלחת האחרת להתרחבות נוספת.
      5. כאשר התאים 96-גם הצלחות הפכו ומחוברות, לחלץ את ה- DNA הגנומי (ללא מיצוי פנול / כלורופורם) באמצעות פרוטוקול פשוט, כמפורט להלן.
      6. הסר בינוני לשטוף את התאים פעם עם PBS ללא Ca ^{2 +} ו Mg ^2+. הוסף 50 μL של חיץ תמוגה (5 μL של proteinase K (10 מ"ג / מיליליטר), 5 μL של PCR החיץ 10x, ו- 40 μL של DDH ₂ O) היטב בכל צלחת 96-היטב. חותם את הצלחת באמצעות סרט דביק אינקובטוריםte הלילה ב 55 מעלות צלזיוס.
      7. למחרת, להעביר את lysates התא לתוך צלחת PCR 96-היטב דגירה במשך 10 דקות ב 99 מעלות צלזיוס thermocycler כדי להשבית את proteinase ק
      8. PCR-להגביר את האזור היעד תוך שימוש באותו פריימרים ובאשר assay T7EI או RFLP, באמצעות 1 μL של lysate תא כתבנית.
      9. השתמש 1 μL של מוצר ה- PCR עבור רצף סנגר עם פריימר מחייב פנימי למוצר PCR.
      10. הגבר את השיבוטים עם מוטציות indel frameshift עבור מניות קפוא. כמו כן, להגביר שני שיבוטים wild-type מאותו ניסוי מיקוד לשרת קווי בקרה isogenic כמו עבור ניסויים נוספים.
2. דור של קווים מוטנטים עם שינויים נוקלאוטיד מדויקים
   הערה: בהשוואה מוטציות נוקאאוט שנוצר על ידי שאינם הומולוגיים סוף להצטרף (NHEJ), שינוי של נוקלאוטיד מדויק יכולה להיות מושגת באמצעות תיקון הומולוגיה מכוונת (HDR) בנוכחות DNA repaiתבניות r. כזה שינויי נוקלאוטיד מדויקים לאפשר לדור של מוטציות ספציפי מטופל hPSCs wild-type ולתיקון של מוטציות iPSCs נגזרות החולות.
   1. עיצוב של ssDNA כתבנית HDR
      1. לעצב ולייצר 2 - 3 gRNAs בסמיכות מוטצית חולה ספציפי, כמתואר בשלב 3.1.1.
      2. עיצוב דנ"א חד-גדילי (ssDNA) המכיל את המוטציה המטופל הספציפי מוקף ~ 40 - 80 NT של הומולוגיה בכל צד כתבנית HDR.
      3. כדי להפחית חיתוך נוסף לאחר התיקון הנכון ולהנהגת מוטציה שקטה לתבנית ssDNA באזור בתוך רצף ההכרה gRNA ו בסמיכות רצף PAM או ברצף PAM עצמה, אם אפשר.
      4. במידת האפשר, לעצב את מוטציה שקטה להציג אתר עיכול הגבלה רומן גם כך שניתן יהיה להשתמש בו כדי להעריך את יעילות תיקון באמצעות assay RFLP.
   2. GRNA / ssDNA שיתוף transfection והקמת קווי המשובטים
      1. בצעו את-transfection שיתוף של gRNA / ssDNA לתאים iCas9, כמתואר בשלב 3.1.3, עם תערובות transfection ו- B. עבור כל gRNA ובקרה שאינם transfected, transfect התאים בארות כפולים של 24 גם הצלחות. לערבב: 50 μL של המדיום סרום מופחת + 1 μL של gRNA (10 מיקרומטר) + 2 μL של ssDNA (10 מיקרומטר). מערבבים B: 50 μL של המדיום סרום מופחת + 3 μL של מגיב transfection.
      2. לאחר transfection, לחלץ הדנ"א הגנומי של אחד טוב של כל תא שליטה transfected ולא transfected ולהעריך את יעילות תיקון באמצעות T7EI ו / או assay RFLP.
      3. זהה את תערובת gRNA / ssDNA עם יעילות תיקון הגבוהה ביותר הישרדות התא טוב. השתמש הכפולים המקבילים היטב להקמת קו מוטציה משובטת.
      4. פיק 48 - 96 מושבות, בהתאם להערכת יעילות המיקוד ידי T7EI ו / או תחת RFLPאיי. באופן כללי, את היעילות של מוטציה בתיווך HDR נמוכה יותר בנוקאאוט מוטציה ולכן יותר מושבות צריכות להיות ניטלות.
      5. רצף, להרחיב, ולאמת קווי משובטים, כמתואר בשלב 3.1.6.

4. במבחנה hPSC בידול לתאי β הלבלב גלוקוז-תגובה

הערה: בידול במבחנה של מוטציות hPSC לתוך תאים מסוגים רלוונטי מחלות מספק פלטפורמה עבור מודלי מחלה בצלחת. הפרוטוקול הבא מתמקד בידול במבחנה של hPSCs לתאי β בלבלב גלוקוז-תגובה ללימודי התפתחותיים סוכרת הלבלב ^{9, 16, 17.}

1. בידול hPSC לתוך האנדודרם סופי
   1. לשמור על מוטציות hPSC וקווי בקרה wild-type ב כימית מוגדרת ומצבו מזין ללא, כמו לתארד בשלב 1.
   2. כדי להכין את hPSCs לבידול, לנתק את hPSCs באמצעות ריאגנט דיסוציאציה 1x ולפזר אותם ההשעיה תא בודד בינוני מלא.
   3. גלולה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות מחדש להשעות את התאים בינוני מלא עם מעכב ROCK 10 מיקרומטר. ספירת התאים וזרעי התאים ב ~ 1.4 x 10 ⁵ תאים / ² סנטימטר על צלחות מצופות VTN.
   4. שנה את 24 שעות לאחר הזריעה הבינוניות.
   5. ביום 0, להתחיל את הבידול לאחר 48 שעות, כאשר התאים הגיעו ~ 80% confluency.
      הערה: על מנת להשיג יעילות בידול הלבלב גבוהה, אופטימיזציה של צפיפות זריעה ורמת confluency 48 שעות מומלץ לכל קו הפרט.
   6. לשאוב את המדיום hPSC ולשטוף את התאים פעם עם PBS ללא Ca ^{2 +} ו Mg ^2+.
   7. שינוי בינוני עד בינוני בידול ביום 0 (D0).
   8. בימים 1 - 2, לשנות את differentiation בינוני יומי, על פי מתכונים בטבלה 8.
   9. ביום 3, לבחון את סמנים האנדודרם סופי SOX17, FOXA2, ו CXCR4 על ידי מכתים immunofluorescent ו cytometry ניתוח תזרים.
2. בידול האנדודרם סופי לתוך ובתאי לבלב
   1. בימים 3 - 9, להמשיך בידול האנדודרם סופי כלפי שושלת הלבלב על ידי שינוי הבינוני יומי, על פי המתכונים בטבלה 9.
   2. ביום 7, לבחון את אבי הלבלב מוקדם (PP1) סמן PDX1 ידי מכתים immunofluorescent ו cytometry ניתוח תזרים.
   3. ביום 10, לבחון את אבי הלבלב מאוחר יותר (PP2) סמנים PDX1 ו NKX6.1. בינתיים מכין להעביר תאי PP2 לממשק נוזל אוויר עבור בידול נוסף לתאים האנדוקרינית לבלב.
3. האנדוקרינית לבלב שונהentiation בממשק אוויר נוזלי
   1. פנקו את התאים PP2 עם 10 מיקרומטר ROCK מעכב 4 שעות לפני ניתוק.
   2. הסר את המדיום ולשטוף את התאים פעם עם PBS ללא Ca ^{2 +} ו Mg ^2+.
   3. הוסף 2 מ"ל של ריאגנט דיסוציאציה 1x לתאים PP2 בצלחת אחת של 10 ס"מ לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 - 3 דקות.
   4. לשאוב מגיב דיסוציאציה לפני התאים יש מנותקים. הוסף 10 מ"ל של מדיום BLAR ולפזר את התאים PP2 לתוך תאים בודדים ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה.
   5. אסוף את השעית התא הבודד. ספירת תאים גלולה ב XG 200 במשך 5 דקות.
   6. Resuspend התא גלולה ב ~ 0.5 x 10 ⁵ תאים / μL במדיום בידול S5 ספוט 5 - 10 μL של תאים לכל נקודה על מסנן הכנס transwell. מניחים 10 - 15 נקודות ו בעלון אחד 6-היטב ~ 100 כתמים להכניס 10 ס"מ.
   7. הוסף בינוני S5 לתחתית של כל הכנס transwell, ~ 1.5 מ"ל עבור מוסיף 6-היטב ~ 8 מ"ל fאו מוסיף 10 ס"מ.
   8. שינוי המדיום יומי עם המתכונים בלוח 10.
   9. לבחון סמנים האנדוקרינית הלבלב PDX1, NKX6.1 NEUROD1, NKX2.2, אינסולין, גלוקגון ביום 34 על ידי מכתים immunofluorescent ו cytometry ניתוח תזרים ^17.
   10. בדוק תפקוד התא hPSC הנגזרות β-כמו עם הפרשת אינסולין מגורה גלוקוז (GSIS) assay ^{16, 17.}

תוצאות

hPSC כימי מוגדרת מזין ללא תרבות הסתגלות ותחזוקה

hPSCs בתרבית על מתקני האכלת iMEF ניתן להתאים במהירות צלחות מצופות VTN במצב התרבות ללא מזין. אותו יחס פיצול כתרבות מזין iMEF רגיל יכול לשמש במהלך הסתגלות. איור 1 א מציג מורפולוגיות אופייני hPSCs על ניזונים iMEF במדיום מבוססי KSR ועל משטח VTN מצופה במדיום מזין חינם. 1B האיור מראה שינוי מורפולוגי אופייני ואת הצמיחה של מושבות hPSC במהלך הקטע הראשון של הסתגלות (4 ימים). התאים יכולים להיות עוד יותר passaged או קפוא ניסויים עתידיים. לבצע 2 - 3 קטעים של תרבות הסתגלות לפני תחילת ניסויי בידול. Karyotyping מומלץ גם לאחר הסתגלות, אם כי לא נצפתה אנו מומים קריוטיפ בשלב ההסתגלות.

"FO: keep-together.within-page =" 1 "> דור של קווי iCas9 hPSC דרך Talen בתיווך AAVS1 מיקוד

כפי שהוצג קודם, hPSCs היו electroporated עם זוג פלסמידים AAVS1 Talen ו Cas9 ו M2rtTA פלסמידים ^5. איור 2 א 'וב' מציגים וקטור תורם מפורט מיקוד עיצוב ואת ההליך כולו כדי ליצור iCas9 hPSC קווי משובטים. לאחר בחירת אנטיביוטיקה, שיבוטי תא בודד נגזרות מוצגים בגודל מתאים ומורפולוגיה hPSC הטיפוסית היו מוכנים להיות ניטל (10 - 12 ימים לאחר electroporation, איור 2C). בדרך כלל ~ 50% של השיבוטים ממוקדים באופן תקין ללא ואינטגרציות אקראיות, כפי שאומתו על ידי הדרום סופג (איור 2 ד) ^5. שילוב אקראי יכול לגרום ביטוי דולף Cas9 בהעדר טיפול דוקסיציקלין.

הגנטי M היעילodification ב hPSCs באמצעות פלטפורמת iCRISPR

בשנת הוקמה iCas9 hPSCs, Cas9 מתבטא עם טיפול דוקסיציקלין ו מודרך מוקד היעד שלה על ידי gRNAs טרנספקציה, שבו הוא יוצר DSBs. בהעדר תבנית תיקון, תיקון DNA דרך NHEJ מייצר indels, אשר לעיתים לגרום שיבוש גנטי או בנוקאאוט. בנוכחות תבנית תיקון (למשל, תורם ssDNA), HDR יכול להיות מועסק על שינויים גנטיים מדויקים, כגון יצירת מוטציה החולה ספציפי רקע hPSC wild-type או תיקון וריאנט גנטי הקשורים למחלה בפציינט iPSCs נגזר (איור 3 א). זה לוקח ~ 1 חודש כדי ליצור קווים מוטנטים משובטים באמצעות מערכת iCRISPR. לאחר אינדוקציה iCas9 ו transfection gRNA, T7EI ו / או RFLP מבחני שימשו להעריך יעילות חיתוך Cas9, והתאים transfected היו זורעים מאוחר יותר תאים בודדים לתוך צלחות 10 ס"מ בצפיפות נמוכה (~ 500 - 2, 000תאים / 10 ס"מ צלחת). 10 - 12 ימים מאוחר יותר, שיבוטי תא בודד נגזרות הונחו הבארות של צלחת 96-היטב להרחבת אפיון נוסף (כלומר, גנוטיפ ו מערבי סופג) (איור 3 ב). מאז נוקאאוט גנטי בתיווך iCRISPR הוא יעיל ביותר, לא תהליך הבחירה מעורב, ובדרך כלל 20 - 50% מוטציות biallelic יכולה להיות מושגת בקלות (איור 3 ג) ^5. לקבלת שינויים גנטיים יעילים ומדויקים, gRNAs הוא שיתוף transfected עם תורם ssDNA נושא את שינוי רצף המסוים (לשם שינוי קטן אך הם ייחודיים של רצף הגנום). לעתים קרובות, כדי למנוע מחדש חיתוך אללים שונה, מומלץ לכלול מוטציה שקטה בסמיכות או ברצף PAM (איור 3D). עם מערכת זו, ~ 10% של שיבוטים נושאים את שינוי הגנום HDR בתיווך הרצוי ללא שינויים נוספים בשני אללים מושגות (3E איורים). הדרך המהירה ו- pשינוי recise של הגנום hPSC באמצעות פלטפורמת iCRISPR מאפשרת לנו במהירות וביעילות להפוך שורות hPSC המשמשים כמודל לחקר התפתחות האדם ועל מחלותיו.

בידול יעיל של hPSCs כלפי תאי β-כמו גלוקוז-התגובה

ההתקדמות אחרונה בידול לבלב hPSC אפשרה פיתוח הפרוטוקולים מקרוב לשחזר התפתחות עוברית לבלב. HPSCs המובחן בדיל הראשון לתוך האנדודרם הסופי, אז אל PDX1 + אבות לבלב מוקדם (PP1) ו PDX1 + NKX6.1 + ובתאי לבלב מאוחר יותר (PP2), ולבסוף לגלוקוז-התגובה β דמוי תאים ^{16, 17, 19, 20 , 23, 24.} protoc אלהOLS היו אופטימיזציה נוספת ליצור PDX1 + NKX6.1 מהימן + אבות הלבלב ו ^-9 גלוקוז-תגובה β דמויי תאים. איור 4 א מראה את התוסף הכימי המפורט השתמש בכל שלב של בידול. בדרך כלל, ~ 80% confluency 2 ימים לאחר ציפוי התא הראשוני הוא אידיאלי עבור החל את הבידול של HUES8 hPSCs (איור 4B). בדיקת מספר צפיפויות זריעה שונות מומלץ מאוד לגלות את המצב המותאם עבור כל קו תאים ספציפי. בדרך כלל לפחות 75% FOXA2 + SOX17 + תאים בשלב DE ו -40% PDX1 + NKX6.1 + תאים בשלב PP2 יכולה להיות מושגת (איור 4C). בשלב S5, הנוכחות של צורת הילה דמוית ברחבי המצרפי התא הוא אינדיקטור להישרדותו הטובה של התאים, וזה חשוב עבור בידול נוסף כדי NKX6.1 + CPEP + גלוקוז-תגובת תאי β דמוי (4D איור ). פרוטוקול זה הוא שימושי לחקר ד לבלב אנושי evelopment ומחלות בצלחת.

איור 1. hPSC כימי מוגדר ותחזוקה ללא מזין ותרבות הסתגלות מ מזין iMEF. (א) נציג תמונות של hPSCs בתרבית על מזין iMEF או על VTN ביום 4, מוכן להיות מפוצל. (ב) מורפולוגיה אופיינית של hPSCs במהלך הקטע הראשון של הסתגלות לתרבות מזינה ללא מזין iMEF. יום 4 hPSCs בתרבית על מתקני האכלת iMEF פוצל, מצופה על צלחות מצופות VTN במדיום הגדרה כימית עם מעכב ROCK. יחס פיצול היה זהה ליחס פיצול כרגיל עבור culturing בתנאים מזין iMEF. המדיום שונה כל יום בלי מעכב ROCK. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ve_content "FO: keep-together.within-page =" 1 ">
דור איור 2. קווי iCas9 hPSC. (א) את אסטרטגיית המיקוד עבור הדור של קווי iCas9 hPSC. התורם Puro-Cas9 התורם ניאו-M2rtTA הותקפו לתוך מוקד AAVS1 האדם על ידי זוג AAVS1 TALENs. שרטוטים (B) של תהליך המיקוד כולו, כולל electroporation, מבחר אנטיביוטי, קטיף מושבה ורחב, ואפיון שורת תאים. (C) שיבוט תא בודד נציג מוכן להיות נטל בסביבות 10 - 12 ימים לאחר electroporation. (ד) דוגמאות כתם דרום לזיהוי שיבוטים ממוקדים כראוי ללא אינטגרציה הנוספת של שני פלסמידים תורמים. שיבוטים נכונים מסומנים באדום. (א) ו- (ד) הותאמו מ הפניה 5, באישורו.ig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. שינוי גנטי יעיל hPSCs שימוש במערכת iCRISPR. (א) שרטוטים עבור הדור של מוטציות נוקאאוט גנטי או שינוי גנטי מדויק באמצעות מערכת iCRISPR. (ב) הליך מיקוד והקמת קו משובט. (C) ג'ין יעילה בנוקאאוט דרך NHEJ ב hPSCs ^9. (ד) תכנון של ssDNA נושאה שינוי נוקלאוטיד ספציפי. P, באדום: מוטצית מטופל ספציפית; X, בירוק: מוטציה שקטה. (E) יעיל של שינוי נוקלאוטיד המדויק בתיווך HDR. מוטצית R456C מדויקת (הנגרמת על ידי C נוקלאוטיד ספציפי> מוטצית T) את לוקוס GATA6 הוצגה באמצעות מערכת iCRISPR.(עיין הפניה 5 לקבלת מידע מפורט יותר). (ג) ו- (ה) הותאמו מ הפניה 9 והפניה 5, בהתאמה, עם הרשאות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4. בימוי hPSC בידול לתאי β-כמו הלבלב גלוקוז-תגובה. שרטוטים (א) לפרוטוקול הבידול המפורט, עם כימיקלים השלימו בכל שלב של בידול. מסלולי איתות אשר מופעלים או עכבות במהלך ההתמיינות מודגשים בצבע ירוק או אדום, בהתאמה. CHIR: מעכב GSK3; GDF8: גורם בידול הצמיחה 8 או מיוסטטין, בן משפחה חלבון TGF-beta; HH: קיפוד; DE: האנדודרם מכריע; PP1:PDX1 + אבי הלבלב מוקדם; PP2: PDX1 + NKX6.1 + מאוחר ובתאים הלבלב. (ב) confluency האופיינית (70 - 80%) של hPSCs 48 שעות לאחר זריעה כאשר מוכן חניכת בידול. (ג) תמונות מכתימות נציג immunofluorescent מראות את הבידול המוצלח בבית האנדודרם הסופי (DE) שלב (FOXA2 ו SOX17 שיתוף מכתים), בשלב אב לבלב (PP2: PDX1 ו NKX6.1 שיתוף מכתים), וגלוקוז-תגובת β- כמו רשתות סלולריות הבמה (NKX6.1 ו-מכתים שיתוף c-peptide). באופן כללי, כדי להשיג יותר מ -10% NKX6.1 + CPEP + תאים בשלב תא β-כמו, לפחות 75% FOXA2 + תאי SOX17 + DE ו -40% PDX1 + תאי PP2 NKX6.1 + נדרשים בשלבים המקבילים. (ד) מורפולוגיה אופיינית של המצרפי תא בשלב S5 על קרום מסנן הכנס בתרבות ממשק נוזל אוויר. התאים ששרדו הגרו למרכז במצטבר (בחושך) והשאירו מבנה הילה דמוית על הקצה. (א (ד) הותאם מ ההפניה 9 עם הרשאות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

פלסמיד	כמות
AAVS1-Talen-L	5 מיקרוגרם
AAVS1-Talen-R	5 מיקרוגרם
AAVS1-Puro-iCas9	40 מיקרוגרם
AAVS1-ניאו-M2rtTA	40 מיקרוגרם

שולחן 1

תֶחֶל	סדר פעולות
T7F	TAATACGACTCACTATAGGG
TracrR	AAAAGCACCGACTCGGTGCC

שולחן 2

טבלה 3

רְכִיב	כמות
DDH 2 O	35.5 μL
מאגר התגובה 5x PCR	10 μL
תמהיל dNTP (25 מ"מ)	0.5 μL
T7F (10 מיקרומטר)	1.25 μL
TracrR (10 מיקרומטר)	1.25 μL
T7-gRNA תבנית IVT (250 ננומטר)	1 μL
DNA פולימראז	0.5 μL
תערובת התגובה סה"כ PCR	50 μL

תנאי אופני PCR
מספר מחזור	לְפַגֵל	לְחַשֵׁל	לְהַאֲרִיך
1	94 ºC, 2 דקות
2-31	94 ºC, 20 שניות	60 ºC, 20 שניות	72 ºC, 1 דקות
32			72 ºC, 2 דקות

טבלה 4

רְכִיב
T7 ATP	2 μL
CTP T7	2 μL
T7 GTP	2 μL
UTP T7	2 μL
חיץ T7 10x	2 μL
תמהיל אנזים T7	2 μL
תבנית PCR מוגברת	8 μL
תמהיל שעתוק סה"כ במבחנה gRNA	20 μL
לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות עד הלילה

לוח 5

רְכִיב	סכום (μL)
Unpurified מוצרי PCR	8
הצפה 2 10x	2
מים מזוקקים (DH 2 O)	10

לוח 6

תנאי אופני denaturation דנ"א הכלאה
טֶמפֶּרָטוּרָה	מֶשֶׁך	תנאי thermocycler
95 ° C	10 דק
85 ° C	דקה 1	כבש 85 מעלות צלזיוס ב 2 ° / C s
75 ° C	דקה 1	כבש 75 מעלות צלזיוס ב 0.3 ° / C s
65 ° C	דקה 1	כבש עד 65 מעלות צלזיוס ב 0.3 ° / C s
55 ° C	דקה 1	כבש 55 מעלות צלזיוס ב 0.3 ° / C s
45 ° C	דקה 1	כבש 45 מעלות צלזיוס ב 0.3 ° / C s
35 ° C	דקה 1	כבש עד 35 ° C ב 0.3 ° / C s
25 ° C	דקה 1	כבש 25 מעלות צלזיוס ב 0.3 ° / C s
4 ° C	לְהַחזִיק

לוח 7

שלב	יְוֹם	כְּלֵי תִקְשׁוֹרֶת	לְהַשְׁלִים
S1	D0	S1	GDF8 100 ng / mL	CHIR-99,021 3 מיקרומטר
	D1	S1	GDF8 100 ng / mL	CHIR-99,021 0.3 מיקרומטר
	D2	S1	GDF8 100 ng / mL
התקשורת S1: MCDB 131 + 1x L- גלוטמין תוספת + 0.5% BSA + 1.5 גר '/ ל NaHCO 3 + 10 גלוקוז מ"מ

לוח 8

ד> S3

שלב	יְוֹם	כְּלֵי תִקְשׁוֹרֶת	לְהַשְׁלִים
S2	d3-D4	S1	LAA 0.25 מ"מ	FGF7 50 ng / mL	IWP-2 2.5 מיקרומטר
D5-D6	S3	LAA 0.25 מ"מ	FGF7 50 ng / mL	SANT-1 0.25 מיקרומטר	RA 1 מיקרומטר	LDN 100 ננומטר	TPB 200 ננומטר	ITS-X 1: 200
S4	D7-D9	S3	LAA 0.25 מ"מ	FGF7 2 ng / mL	SANT-1 0.25 מיקרומטר	RA 0.1 מיקרומטר	LDN 200 ננומטר	TPB 100 ננומטר	ITS-X 1: 200	IWP-2 2.5 מיקרומטר
התקשורת S3: MCDB 131 + 1x L- גלוטמין תוספת + 2% BSA + 2.5 גר '/ ל NaHCO 3 + 10 גלוקוז מ"מ

לוח 9

שלב	יְוֹם	כְּלֵי תִקְשׁוֹרֶת	לְהַשְׁלִים
S5	D10-D12	S5	T3 1 מיקרומטר	ALK5i השנייה 10 מיקרומטר	SANT-1 0.25 מיקרומטר	RA 0.05 מיקרומטר	LDN 100 ננומטר	ITS-X 1: 200	ZnSO4 10 מיקרומטר	הפרין 10 מיקרוגרם / מ"ל
S6	D19 d13-	S5	T3 1 מיקרומטר	ALK5i השנייה 10 מיקרומטר	GSiXX 100 ננומטר		LDN 100 ננומטר	ITS-X 1: 200	ZnSO4 10 מיקרומטר	הפרין 10 מיקרוגרם / מ"ל
S7	D33 d20-	S5	T3 1 מיקרומטר	ALK5i השנייה 10 מיקרומטר	N-Cys 1 מ"מ	Trolox 10 מיקרומטר	R428 2 מיקרומטר	ZnSO4 10 מיקרומטר	הפרין 10 מיקרוגרם / מ"ל
התקשורת S5: BLAR + 1x L- גלוטמין תוספת + 2% BSA + 1.5 גר '/ ל NaHCO 3 + 20 גלוקוז מ"מ

n-page = "תמיד"> ITS-X 1: 200

טבלה 10

דיון

שיקולי זמן עבור קווי יצירת Mutant

למרות הגישות אחרונות מבוססות על מערכות CRISPR / קאש לעריכה הגנום הובילו מיקוד מוצלח, פלטפורמה יעילה ואוניברסלית יותר תהיה עדיפה בקנה מידה גדולה יותר מנתח של תפקוד גן. פלטפורמת iCRISPR מציעה שיטה מהירה ויעילה להציג מוטציות לכל גן של עניין ^{5, 9.} ראשית, שיטת סינתזת gRNA המבוססת PCR מאפשרת הייצור של מאה gRNAs בפורמט ערוך ביום אחד ללא מדרגות השיבוט גוזל הזמן. שנית, עם ביטוי דוקסיציקלין-מושרה Cas9 ב iCas9 hPSCs, הצעד מעורבים transfection gRNA דורש כמות מינימלית בלבד של עבודה, ולכן מספר gRNA ניסויים מיקוד יכול להתנהל במקביל. שלישית, בשל המיקוד הגבוה יעילות השגה עם המערכת שלנו, הניתוח של ~ 24 - 48 מושבות בכל gRNA transfected צריכות להיות sufficient להקים monoallelic מרובים קווים מוטנטים biallelic עבור גן יחיד, אם כי יעילות משתנות בהתאם מוקד היעד. מאז הוא ריאלי עבור אדם מאומן לקטוף מכאני 384 מושבות (4 x 96-גם צלחות) בבת אחת, אשר אמור לקחת ~ 4 שעות תחת מיקרוסקופ לנתח, אדם מאומן יכול להיות צפוי ליצור קווים מוטנטים המשפיעים 12 גנים בתוך 12 חודשים. הדור היעיל של מוטציות hPSC תוך זמן קצר מאפשר ניתוח השיטתי של מערך של גורמי שעתוק ו / או מרכיבים שונים של מסלול איתות כי אינטראקציה זה עם זה, המסדיר את התהליך התפתחותי ^9. כמו כן, כוונת גן מרובב יעילה גם פותחת את הדלת כדי לחקור אינטראקציות גנטיות תכונות אנושיות מורכבות בסיסיות.

דור של מדויק גנטי שינויים

על גזרה של iPSCs המטופל הספציפי מסוג תאים סומטיים ונגיש ים ואת הבידול לתוך תאים מסוגים רלוונטי מחלות לספק הזדמנות מצוינת עבור האימות הפונקציונלית של מוטציות הקשורות למחלה. עם זאת, בשל ההשתנות הניכרת רקע גנטי בין פרטים, השוואה ישירה בין iPSCs מחול מתורמים בריאים לא יכולה לאפשר אחד כדי להבחין פנוטיפים מחלה מתופעות ברקע. לכן, יש צורך ליצור iPSCs מלא isogenic ידי תיקון מוטצית המחלה חזרתי את רצף wild-type או להציג מוטציות המטופל ספציפי לרקע hPSC wild-type, כפי שהוצע על ידי אחרים ^{25, 26.} בנוסף לאובדן של פונקציה (null) מוטציות, אפשר עכשיו ליתר דיוק לנתח מנגנוני המחלה באמצעות הקדמה של שינויים ברצף המטופל הספציפי לתוך מוקד אנדוגני hPSCs, כולל hypermorphic, hypomorphic, neomorphic, או דומיננטי שלילי החולה מוטציות.

ntent "> הנדסה גנטית מדויקת מעסיק HDR לתיקון DSB בנוכחות תבנית תיקון. מאז הוא הרבה פחות יעיל מאשר תיקון DNA בתיווך NHEJ, פלסמיד תורם המכיל את המוטציה החולה ספציפית, קלטת מבחר סמים, נשק הומולוגיה נעשה בה שימוש בעבר כמו תיקון התבנית ^2. לאחר בחירת תרופה ואימות של המוטציה החולה ספציפית, בשלב שני יש צורך בדרך כלל להסיר את קלטת מבחר תרופה. בעוד המערכות הנפוצות ביותר Cre-loxP ו FLP-FRT להשאיר מאחור רצף שייר לוקוס אנדוגני, שימוש transposon piggyBac אפשר להסרת החלקה של הקלטת סמי בחירת ^27. לאחרונה, תבניות ssDNA קצרות יש גם הוכחו לתמוך HDR היעילה עם endonucleases DNA המהונדס ^28. לעומת פלסמיד התורם יכול להיות מסונתז, ssDNA ישירות ובכך עוקף את הצעד שיבוט זמן רב. הנה, יש לו להיותen הראה כי, על ידי שיתוף transfecting gRNA ואת תבנית ssDNA להשרות תיקון מכוון הומולוגיה, ניתן להשתמש iCRISPR להציג שינויים נוקלאוטיד ספציפיים עם יעילות גבוהה. זה קריטי לא רק לנתח את התפקיד של נוקלאוטידים חיוניים בתוך תחומי חלבון פונקציונליים, אלא גם ביצירת דגמי מוטציות מחל אנושיות ואפשרות לתקן מוטציות מחלה הקשורים אלה להתערבות טיפולית. בשל המספר הגדול של לוקוסים רגישים, שבכל אחד מהם קשורים גרסות רצף נפוצות, דוגמנות היא מחלה מורכבת, multigenic כגון סוכרת כבר אתגר עבור גנטיקאים. כפלטפורמת iCRISPR היא מתירני עבור הדור המהיר של סדרת אללים או מיקוד גן multiplexable, זה יכול להקל על החקירה של הלוקוסים מרובים הקשורים למחלות, בנפרד או בשילוב עם רקע isogenic.

מיקוד ויעילות השפעות חוץ-יעד

יש לנו מצאו קורלציה טובה בין T7E1 ותוצאות assay RFLP ומספר קווי מוטציה מזוהה על ידי רצף. זה מדגיש את החשיבות של ביצוע מבחנים אלה במקביל להקמת קווי משובטים. בעוד יעילות מיקוד השיגו עשוי להשתנות תלוי לוקוסים הגנומי, ברוב הניסויים חד-גנים מיקוד, 20 - 60% של שיבוטים נמצאו בשתי אללים מוטציה (כולל בתוך מסגרת ומוטציות frameshift) ^9. במקרים בם מיקוד גן מרובב בוצע, שיבוטי מוטצית biallelic משולשים עם 5-10 יעילות% התקבלו ^5. ssDNA בתיווך HDR של מספר גנים בוצעו גם להשיג שינויים גנטיים מדויקים, עם יעילות של קבלת הומוזיגוטים עקום שיבוטים הנעים בין 1 - 10% ^5. עבודה עם CRISPR / קאש ב hPSCs, מוטציות כל באתרים מחוץ היעד פוטנציאליים שאינו חולק רצף היעד אותו gRNA הם עדיין לא זוהתהילדה = "Xref"> ^{5, 9, 12.} רצף Whole-הגנום שבוצע במחקר שנערך לאחרונה גם נכשל לזהות מוטציות מחוץ יעד משמעותיות בקווי hPSC משובטים שנוצר באמצעות CRISPR / קאש ^29. אף על פי כן, כדי למזער את השפעה פוטנציאלית של פנוטיפים בלבול הציגו ידי מוטציות באתרי השפעה מחוץ יעד, הוא הציע ליצור קווים מוטנטים עצמאיים באמצעות לפחות שני gRNAs העצמאי מיקוד רצפים שונים בתוך אותו הגן. פנוטיפים דומה נצפה מספר שורות שנוצר באמצעות gRNAs השונה יכול לשלול בעיקר את האפשרות כי הפנוטיפ מגיע השפעה מחוץ היעד.

מזין תלוי לעומת תרבות עצמאית ומיקוד

שיטות מסורתיות תרבות hPSC דורשות התחזוקה וההרחבה שלהם על תאים מזינים במדיה המכילים סרום או תחליף בסרום הכולל לדרבן בעלי החייםucts, כגון אלבומין בסרום שור. תאים מזינים, סרום, החלפה בסרום, ואלבומין כולם מכילים רכיבים מורכבים, לא מוגדרים ולהראות השתנות יצוו ניכרות. התאמת למצב המזין נטולות הגדרה כימית מפחית באופן משמעותי את המאמצים לצורך תחזוקת hPSC, וחשוב יותר, מעלה את העקביות של ניסויי בידול. נכון לעכשיו, יש מעט מאוד מחקרים המתארים נהלי עריכת הגנום על hPSCs בתרבית בתנאי תרבות המוגדר באופן מלא ^30. מצאנו CRISPR גבוה מיקוד יעיל כאשר gRNA transfection בתצהיר משובט בוצעו בתנאים מזינים ללא לעומת תנאי תרבות תלויה מזינות. אנו מאמינים כי הדבר נובע להישרדות התא גדל לאחר transfection וזריעה-תא בודד עבור היווצרות המושבה. יתר על כן, תאי מזין הוכחו בעבר כדי לעקל ריאגנטים transfection, ובכך מפחיתים את יעילות transfection.

שילובעריכת הגנום עם בידול בימוי

פרוטוקולי בידול קודמים הניבו רק חלק קטן של תאים חיוביים-אינסולין, שרובם היו polyhormonal ודמה ²³ תאי האנדוקרינית עובריים. ההתקדמות האחרונה התירה את הבידול של hPSCs לתאי בטא כמו גלוקוז-תגובה בוגר יותר ^{16, 17, 19, 20.} אנחנו יכולים להשיג לפחות 75% מוחלטים endoderm תאים, 40% PDX1 + NKX6.1 + אבות לבלב, וכ -20% NKX6.1 + CPEP + גלוקוז-תגובת בטא דמוית תאים באמצעות HUES8 hPSCs ⁹ שיגרתי. בשילוב עם מערכת עריכת הגנום iCRISPR, זה פרוטוקול בידול חזק יותר יש להקל את ניתוח גורמי שעתוק כי הם קריטיים בשלבים ובתאים ומערכת האנדוקרינית הלבלב של בידול לבלב. זה יגרוםזה אפשרי, במחקרים עתידיים, כדי לבחון מספר רב של גנים של מחל מועמד האימות והחקירה הפונקציונליות לתוך המנגנונים העומדים בבסיס סוכרת ^9.

יישומים או כיוונים עתידיים

מערכת iCRISPR שלנו עשוי להקל על הדור של שינויים גנומיים מורכבים יותר, כגון יצירת אללים כתב באמצעות HDR בתיווך גן המיקוד באמצעות תגי חלבון קידוד תבניות DNA תורם ארוך או כתבי ניאון ^12. הראינו כי, בשל CRISPR גבוהה מיקוד היעילות מושגת במערכת, תהליך זה יכול להתבצע hPSCs, ללא צורך בבחירת חומר נוסף ^12. יתר על כן, גן מרובב ניתן להשתמש מיקוד לחקור אינטראקציות גנטיות למחלות אנושיות מורכבות בסיסיות, כפי שמוצג המחקר שנערך לאחרונה שלנו, אשר אנו מאמינים הוא הדוגמא הראשונה של עבודה כזו ^31. ICRISPR יכול לשמש גם כדי להבין גן שליטת רגולציה על ידי יצירת מחיקות בין אם RNAs noncoding או בגן אזורים רגולטוריים, כגון יזמים משפרי. כדי ביעילות ליצור מוטציות רגולטוריות באמצעות iCRISPR, gRNAs יכול להיות מתוכנן לשבש את אתר הקישור של חלבון קושר DNA, כולל אך לא מוגבל מכונות תעתיק הבזליים או גורם שעתוק רקמות ספציפיות. תבנית בתיווך HDR ssDNA יכול לשמש גם כדי לעבור מוטציה אתרי חלבון מחייב ספציפית. לבסוף, אנו חוזים כי אופטימיזציה נוספת תאפשר את השימוש של פלטפורמת iCRISPR ב hPSCs עבור אנליזה גנטית תפוקה גבוהה יותר של פנוטיפים pluripotency או פנוטיפים מחלה בשילוב עם פרוטוקול בידול במבחנה. מחקרי iCRISPR בתיווך אלה עשויים לאפשר זיהוי מהיר יותר של גנים של מחלות הקשורות מועמד ומחקרים של הרלוונטיות הפעילות שלהן.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מדיום מוגדר כימית (E8)	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Essential 8 בסיסי בינוני ותוסף Essential 8 כולל
צורה אנושית רקומביננטית קטומה של ויטרונקטין	Thermo Fisher Scientific	A14700
מעכב ROCK Y-27632	Selleck Chemicals	S1049
מגיב דיסוציאציה (TrypLE Select אנזים)	Thermo Fisher Scientific	12563029	1x, ללא מקור מן החי, אנזים רקומביננטי
G418 סולפט	תרמו פישר מדעי	10131035	גנטיקה אנטיביוטיקה סלקטיבית
פורומיצין דיהידרוכלוריד	סיגמא-אולדריץ'	P8833	פורומיצין אנטיביוטיקה סלקטיבית
DNA פולימראז (היתוך הרקולאז II)	Agilent Technologies	600679	ערכת PCR
MEGAshortscript T7 שעתוק ערכה	תרמו פישר מדעי	AM1354
MEGAclear תמלול ניקוי ערכת	תרמו פישר מדעי	AM1908
דוקסיציקלין היקלאט	סיגמא-אולדריץ'	D9891
אופטי-MEM בינוני	תרמו פישר סיינטיפיק	31985062	מופחת סרום בינוני
ליפופקטמין RNAiMAX טרנספקציה מגיב	תרמו פישר מדעי
DNeasy דם & ערכת רקמות	QIAGEN	69504	ערכת מיצוי DNA גנומי
Proteinase K	Roche	3115879001
MCDB 131 בינוני	Thermo Fisher Scientific	10372-019
BLAR בינוני	Thermo Fisher Scientific		מיוצר בהתאמה אישית עם נוסחה שפורסמה (Rezania et al., 2014)
תוסף L-גלוטמין (GlutaMAX)	Thermo פישר סיינטיפיק	35050061
NaHCO3	Thermo Thermo Fisher Scientific	144-55-8
גלוקוז	סיגמא-אולדריץ'	G8769
BSA	LAMPIRE מעבדות ביולוגיות	7500855	ללא חומצות שומן
GDF8	PeproTech	120-00
CHIR-99021	Stemgent	04-0004	מעכב GSK-3
חומצה L-אסקורבית	Sigma-Aldrich	A4544	ויטמין C
FGF7	R& D Systems	251-KG
SANT1	Tocris Bioscience	1974	מעכב קיפוד
RA	Sigma-Aldrich	R2625	חומצה רטינואית
LDN	Stemgent	04-0019	מעכב BMP
IWP-2	Tocris Bioscience	3533	אנטגוניסט Wnt
ITS-X	Thermo Fisher Scientific	51500-056
TPB	EMD Millipore	565740-1MG	מפעיל PKC
3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3)	Sigma-Aldrich	T6397
ALK5i II	Enzo Life Sciences	ALX-270-445	מעכב ALK5 II
ZnSO4	Sigma-Aldrich	Z0251
הפרין	סיגמא-אולדריץ'	H3149
GSiXX	EMD מעכב גמא		סקרטאז 565789 מעכב גמא סקרטאז XX, מעכב איתות NOTCH
N-Cys (N-אצטיל ציסטאין)	Sigma-Aldrich	A9165
Trolox	EMD Millipore	648471	ויטמין E אנלוגי
R428	Selleck Chemicals	S2841	קולטן AXL טירוזין קינאז מעכב
24 מ"מ Transwell עם הכנסה	Corning Life Sciences	3414
Gene Pulser Xcell מערכת אלקטרופורציה	Bio-Rad	1652660
0.4 ס"מ קוביות אלקטרופורציה	Bio-Rad	1652081
AAVS1-TALEN-L	Addgene	59025
AAVS1-TALEN-R	Addgene	59026
AAVS1-Neo-M2RTTA	Addgene	60843
AAVS1-Puro-iCas9	Addgene	58409
T7 אנדונוקלאז I	NEB	M0302L
מאגר 2	NEB	B7002S	NEBuffer 2
אוליגונוקלאוטיד ארוך	Eton Bioscience או נוגדן IDT
SOX17	R& D Systems	AF1924	1:500
נוגדן FOXA2	Millipore	07-633	1:100
נוגדן CXCR4-APC	R& D Systems	FAB170A	1:25
PDX1 נוגדנים	מו"פ D Systems	AF2419	1:500
NKX6.1 נוגדן	DSHB	F55A12	1:500
NKX2.2 נוגדן	DSHB	74.5A5	1:100
נוגדן NEUROD1	Santa Cruz Biotechnology	sc-1084	1:100
נוגדן אינסולין	Dako	A0564	1:2,000
נוגדן פפטיד C	DSHB	GN-ID4-c	1:2,000
נוגדן גלוקגון	Sigma-Aldrich	G2654	1:1,000