כאן, אנו מציגים שיטה להקמת מערכת מהירה במבחנה התומכת בתרבות תלת מימדית ובהתמיינות לומינלית לאחר מכן של תאי אפיתל ראשוניים של הערמונית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מסנן ראפיד הכנס מבוססת מערכת 3D תרבות התמיינות תאי ערמונית ראשית
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאים לתכנות מחדש מותנה (CRCs) לספק שיטת קיימא עבור תרבית תאים ראשונית ואת היכולת לפתח "biobanks חיים" הנרחב של שורות תאים שמקורם בחולה. עבור סוגים רבים של תאי אפיתל, שונות תלת ממדים (3D) גישות התרבות תואר התומכים מדינת בדיל השתפרה. בעוד CRCs לשמור מחויבות השושלת שלהם לרקמה שממנו הם מבודדים, הם לא מצליחים לבטא רבים של סמנים בידול הקשורים רקמות ממוצא כאשר גדל תחת נורמלי שני התנאים תרבות מימדי (2D). כדי לשפר את היישום של CRCs נגזרות החולות למחקר סרטן הערמונית, פורמט תרבות 3D הוגדר המאפשר בידול תא מהיר (2 שבועות סה"כ) לומינל בשני נורמלי גידולים שמקורם בתאי האפיתל ערמונית. בזאת, פורמט מבוסס כנס מסנן מתואר עבור culturing וההבחנה של שני CRCs ערמונית הנורמלי וממאירים. דהתיאור זנב של ההליכים הנדרשים לצורך איסוף תאים ועיבוד מכתים immunohistochemical ו immunofluorescent מסופקים. קולקטיבי בפורמט תרבות 3D תאר, בשילוב עם קווי CRC העיקריים, מספק בינוני חשוב גבוהה מערכת מודל תפוקה למחקר ערמונית מבוססת biospecimen.
מבוא
זיהוי והשימוש של טיפולים בסרטן שמותאם אנשים הם יעד מרכזי בחקר הסרטן. לאחרונה, גישות חדשות פותחו המאפשרות ביתר קל בהקמה בתרביות תאים ראשוניות, פוטנציאל לספק דרכים של שניהם זיהוי ובדיקת טיפולים אישית. לדוגמא, הערמונית מבוססת R-spondin גישת organoid 1 מאפשרת תלת ממדי (3D) culturing של תאי סרטן הערמונית נורמלים גרורתי בתוך תאי מטריקס מסחריים (למשל, Matrigel), בעוד Reprogramming המותנה של תאים (CRC) שיטה 2 שפותח בג'ורג'טאון, 3 מנצל תנאי תרבות 2D סטנדרטיים יותר. באופן ספציפי, השילוב של מעכבי קינאז Rho (Y-27632) ותאי מזין פיברובלסטים mu....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הקמת תא 3D תרבות כנס מערכת
- מניחים 2 מוסיף תרבית תאים פוליקרבונט אוריינטציה הפוכה (צד מסנן למעלה) מטה (איור 1 א) 6 גם צלחת.
- למרוח שכבה דקה של ג'לטין 0.1% במים אל הצד התחתון של הכנס ולאפשר לו להתייבש (10-20 דקות) בתוך ארון בטיחות ביולוגית כדי לשמור על סטריליות.
- חזור על שלב 1.2 פעמים נוספות עבור סכום כולל של 3 בקשות של ג'לטין 0.1% על ההכנסות.
הערה: ציפוי ג'לטין יעזור דיפוזיה גבול בין התאים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
את כנס תרבית תאי המערכת המבוססת היא הליך יחסי פשוט ומהיר להפקת תרבויות 3D של CRCs הערמונית שתומך התמיינות תאי luminal. סכמטי של המערכת מוצג (איור 1 א) המדגיש את היישום של ציפוי ג'לטין על פני השטח התחתונים של להכניס המסנן. המחדיר הפוך רק עבור היישום של ג'לטין. באיור 1B המסננים בכיוון המתאים עבור culturing. באמצעות תותב תא שקוף, תמונה מייצגת של תרבות CRC ערמונית 3D בריאה מוצגת (10X) (איור 2)........
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שורות תאים ראשיות הן פלטפורמה חשובה המתפתחת במהירות לחקר הסרטן. מערכת תרבות 3D תרבות מבוססת כנס תומכת הבידול של CRCs ערמונית העיקרי בתוך פרק זמן של שבועות. השיטה המסננת CRC מייצגת שיטת תפוקה חדשה, בינונית למחקר ערמונית. מודלי העכבר PDX קיימים הם זמן רב ויקר מאוד, ורבי דגימות PDX לא ניתן לגדל בתרבית, הגבלת ניסויים ביוזמת חוקר והתועלת שלהם. בנוסף, בעוד ששיעורי ההצלחה של הקמת PDX להשתנות 13 מאוד, השיטה CRC יש שיעור גבוה של הצלחה בהקמת שורות תאים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים אין לי מה לחשוף.
תודות
מחקר זה מומן על ידי T32 (CA 9686-18) ו TL1 (TL1TR001431) פרסים מענק עבודת הפוסט דוקטורט (שעון מקומי), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA) וכן U01 PAR-12-095 (קומאר) ו P30 CA051008-21 (ויינר). קיבעון לדוגמא, חתך מכתים בוצע היסטולוגיה במרכז לחקר הסרטן לומברדי מקיף ואת המשאב המשותף רקמות. אנו מודים ריצ'רד שלגל לדיונים מועילים. התוכן הוא באחריות הבלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצגים את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לסרטן או מכוני הבריאות הלאומיים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Corning Costar Snapwell Culture מוסיף | קורנינג | 3801 | |
| מילי-תא תרבית תאים מוסיף | Millipore | PIHP01250 | |
| Multiwell 6 בארות | פלקון | 353046 | |
| ג'לטין 0.1% במים | Stemcell Technologies | 7903 | |
| סטרילי Saftey Scapel 10 להב | אינטגרה Miltex | 4-510 | |
| אזמל סטנדרטי סטרילי 11 להב | אינטגרה Miltex | 4411 | |
| RIPA מאגר ליזה ומיצוי | Thermofisher Scientific | 89900 | |
| נתרן פלואוריד | Fishcer Scientific | S299-100 | |
| נתרן ואנדאט | Fishcer Scientific | 13721-39-6 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3483123 | |
| קוקטייל מעכב פרוטאז (AEBSF, אפרוטינין, בסטטין, E-64, לופפטין ופפסטין A) | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| 0.25% טריפסין-EDTA (1x) | Thermofisher Scientific | 25200-056 | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965-092 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| גלוטמין | תרמופישר | Scientific 25030081& נ.ב.פ; | |
| פניצילין סטרפטומיצין | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| F-12 Nutrient Mix Media | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Y-27632 מעכב סלע דיהידרוכלוריד | Enzo | ALX-270-333-M025 | |
| הידרוקורטיזון | סיגמא-אולדריץ' | H0888 | |
| EGF | Thermofisher Scientific | PHG0315 | |
| אינסולין | Thermofisher Scientific | 12585-014 | |
| רעלן כולרה | סיגמא-אולדריץ' | C3012 | |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710-064 | |
| Fungizone | Fisher Scientific | BP264550 | |
| טריזול ריאגנט | Invitrogen | 15596026 | |
| היסטוג'ל לעיבוד דגימה ( הידרוקסיאתיל אגרוז (HEA))Thermo | Scientific | HG-4000-012 | |
| חבישה לא דביקה | Telfa | KDL2132Z | |
| צלחת תרבית תאים | סיגמא | SIAL0167 | |
| HISTOSETTE II עיבוד רקמות / הטבעה קלטות | קריסטלגן | CG-M492 |
מקורות
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
