מאמר שיטה

אנקפסולציה תא יונקים ב Alginate חרוזים באמצעות כלי פשוט מתערבל

DOI:

10.3791/55280

⸱

29 ביוני 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, McGill University, 2Michael Smith Laboratories & Department of Chemical and Biological Engineering, University of British Columbia, 3Michael Smith Laboratories & Department of Pharmaceutical Sciences, University of British Columbia

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זה וידאו כתב היד לתאר שיטה המבוססת על תחליב לתמצת תאים יונקים 0.5% עד 10% חרוזים alginate אשר ניתן לייצר בקבוצות גדולות באמצעות כלי זעיר זעיר. תאים המארז יכול להיות מתורבת במבחנה או המושתלים עבור יישומים טיפול סלולרי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים אנקפסולציה של חרוזים אלגינט שימש לתרבות תאים משותקת במבחנה, כמו גם עבור immunoisolation in vivo . אנקפסולציה איון הלבלב נחקרה בהרחבה כאמצעי להגביר את הישרדות האיון בהשתלות אלוגניות או קסנוגניות. Alginate אנקפסולציה מושגת בדרך כלל על ידי שחול זרבובית ו gelation חיצוני. באמצעות שיטה זו, המכיל תאים alginate המכילים תאים בקצה החרירים נופלים לתוך פתרון המכיל קטיונים divalent שגורמים ionotropic alginate gelation כפי שהם מפוזרים לתוך טיפות. הדרישה להיווצרות טיפה בקצה קצה הזרבובית מגבילה את התפוקה הנפחית ואת הריכוז אלגינט שניתן להשיג. וידאו זה מתאר שיטה מתחלבת להרחבה לתמצת תאים יונקים ב 0.5% אלגינט 10% עם 70% עד 90% הישרדות התא. בשיטה חלופית זו, טיפות alginate המכילות תאים סידן פחמתי הם emulsified בשמן מינרלי, Folנמוך על ידי ירידה ב pH המוביל שחרור סידן פנימי ו gotation ionotropic alginate. השיטה הנוכחית מאפשרת ייצור של חרוזים אלגינט בתוך 20 דקות של תחליב. הציוד הנדרש לשלב אנקפסולציה מורכב כלי זעירים זעירים לרשות מעבדות ביותר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנקפסולציה תא יונקים נחקרה באופן רחב כאמצעי להגן על תאים המושתלים של דחייה החיסונית 1 או לספק תמיכה תלת מימדי לתרבות תאים משותקת 2 , 3 , 4 . אנקפסולציה איון הלבלב ב alginate חרוזים שימש כדי להפוך סוכרת ב 5 , 6 או xenogeneic 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 מכרסמים. ניסויים פרה-קליניים וקליניים של השתלת איבר הלבלב המבוצעת לטיפול בסוכרת מסוג 1 נמשכים 13 , 14 , 15 . עבור יישומים להשתלה או גדול יותרE במבחנה ייצור תאים משותקים, חרוזים מבוססי זרבובית חרוז משמשים בדרך כלל. בדרך כלל, תערובת של alginate ותאים נשאבים דרך זרבובית כדי ליצור טיפות נופל לתוך פתרון נסער המכיל קטיונים divalent, וכתוצאה מכך gelation חיצוני של טיפות. זרימת גז קואקסיאלית 16 , 17 , רטט זרבובית 18 , דחייה אלקטרוסטטית 19 או חוטים מסתובבים 20 להקל על היווצרות טיפות בקצה קצה הזרבובית.

החסרונות העיקריים של גנרטורים חרוז קונבנציונאלי הם התפוקה המוגבלת שלהם ואת טווח מוגבל של צמיגות פתרון אשר יביא ליצירת חרוז נאותה 21 . בשיעורי זרימה גבוהים, הנוזל היוצא מן הזרבובית נשבר לתוך טיפות קטנות יותר מקוטר הזרבובית, ומקטין את בקרת הגודל. Multi-nozzle חרוזים חרוזים ניתן להשתמש כדי להגדיל את התפוקה, אבלהתפלגות אחידה של הזרימה בין החרירים והשימוש בפתרונות> 0.2 PAS הוא בעייתי 22 . לבסוף, כל ההתקנים מבוססי נחיר צפויים להקנות נזק כלשהו איים, שכן קוטר החרירים המשמשים הוא בין 100 מיקרומטר ו 500 מיקרומטר, בעוד ~ 15% של איים האדם יכול להיות גדול מ 200 מיקרומטר 23 .

בסרטון זה, אנו מתארים שיטה חלופית לתמצת תאים יונקים על ידי יצירת טיפות בשלב אמולסיפיקציה אחת במקום טיפה אחר טיפה. מאז ייצור חרוז מבוצע בכלי זעיר זעיר, השיטה מתאימה קטן (~ 1 מ"ל) בקנה מידה גדול (10 3 L טווח) חרוז הייצור עם עלויות ציוד נמוך 24 . שיטה זו מאפשרת ייצור של חרוזים עם sphericity גבוהה באמצעות מגוון רחב של צמיגות alginate עם קצר ( למשל 20 דקות) פעמים חרוז הדור. שיטה זו פותחה במקור על ידי Poncelet et aL. 25 , 26 ו משמש immobilize DNA 27 , חלבונים 28 כולל אינסולין 29 , חיידקים 30 . יש לנו לאחרונה התאמת שיטות אלה כדי אנקפסולציה של תאים יונקים באמצעות תאים בלבלב בלבלב 31 , 32 ורקמת הלבלב העיקרי 32 .

העיקרון של השיטה היא ליצור מים ב-שמן תחליב המורכב טיפות alginate בשמן מינרלי, ואחריו gelation פנימי של טיפות alginate ( איור 1 ). ראשית encapsulant ( למשל, תאים) הוא התפזר פתרון alginate המכיל מלח סידן בסדר גרגר עם מסיסות נמוכה בתהליך pH הראשונית. תערובת אלגינט הוא הוסיף אז לשלב אורגני agitated ליצור תחליב, בדרך כלל בנוכחות של פעילי שטח. במקרה של אנקפסולציה תא יונקים, רכיבים הנוכחי בסרום יכול לשמש surfactants. לאחר מכן, pH מופחת על מנת solubilize מלח סידן על ידי הוספת שמן מסיס חומצה כי מחיצות לתוך השלב מימית. חומצה אצטית, עם מקדם מחצבים שמן / מים <0.005 33 , צריכה להתמוסס מראש בשמן, ולאחר מכן להוסיף את התחליב שבו הוא מעורבב בשלב השמן ומחיצות במהירות לתוך שלב מימית 34 . איור 2 ממחיש את התגובות הכימיות ודיפוזיה המתרחשות במהלך החמצון ואת שלב gelation פנימי. לבסוף, תאים encapsulated הם התאושש על ידי היפוך פאזה, הפרדת פאזה מואצת על ידי צנטריפוגה, צעדים כביסה חוזרת וסינון. צעדים אלה יכולים להיות ואחריו חרוז דגימה התא עבור ניתוחי בקרת איכות, בתרבית תאים חוץ גופית ו / או השתלת תאים encapsulated.

S = "jove_content" עבור: keep-together.within-page = "1"> תרשים תהליך מיקרו-אנקפסולציה עם שמן, חומצה אצטית, CaCO3, צנטריפוגה ושלבי סינון.
איור 1: סכמטי של תהליך המבוסס על תחליב לתמצת תאים יונקים. חרוזים מיוצרים לראשונה על ידי emulsifying alginate, תא CaCO 3 תערובת בשמן מינרלי (שלבים 1 ו 2 ב סכמטי), המפעילה gelation פנימי על ידי הוספת חומצה אצטית (שלב 3). החרוזים gelled מופרדים מכן מן השמן על ידי הוספת חיץ מימית כדי להפעיל היפוך פאזה (שלב 4), ואחריו צנטריפוגה ושאיפה שמן (שלב 5), ולאחר מכן סינון (שלב 6). לבסוף, החרוזים שנאספו על המסנן מועברים לתרבות תרבות תאים לתרבות חוץ גופית או להשתלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-introduction-2 איור 2: תגובות ושלבי דיפוזיה המתרחשים במהלך גלאציה פנימית. (1) חומצה אצטית מתווסף לשלב אורגני ומועבר לטיפות אלגינט על ידי הסעה. (2) מחיצות חומצה אצטית לתוך השלב מימית. (3) בנוכחות מים, חומצה dissociates ו מתפזרת להגיע CaCO 3 גרגרים מתואר כחול כהה. (4) יונים H + מוחלפים עם Ca 2 + יונים CaCO 3 , שחרור Ca 2 + יונים. (5) יוני סידן מפוזרים עד שהם נתקלים alginate unreacted, המוביל הצטלבות יונוטרופית של שרשראות אלגינט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

בניגוד קונבנציונאלי מבוססי זרבובית תא encapsulators, הפצה גודל חרוז גדול expeCted מתהליך זה בשל מנגנון של היווצרות טיפות ב emulsification עורר. עבור קבוצת משנה של יישומים, הפצה זו גודל חרוז עשוי להיות בעייתי. לדוגמה, חלק גדול יותר של תאים עשוי להיות חשוף על פני חרוז חרוזים קטנים יותר. אם מזין ( למשל חמצן) מגבלות הן דאגה, מגבלות אלה עשויים להיות החריפו ב גדול חרוזים. יתרון של שיטת אמולסיפיקציה מעוררת היא כי גודל החרוז הממוצע יכול בקלות להיות מותאם על ידי שינוי קצב התסיסה במהלך שלב תחליב. הפצה גודל חרוז רחב יכול גם להיות מנוצל כדי לחקור את ההשפעה של גודל חרוז על ביצועי התא encapsulated.

אנקפסולציה תא יונקים על ידי emulsification ו gelation פנימי הוא חלופה מעניינת עבור מעבדות שאינן מצוידים גנרטור חרוז. יתר על כן, שיטה זו נותנת למשתמשים את האפשרות של צמצום זמן העיבוד, או יצירת חרוזים ברמה נמוכה מאוד או גבוהה מאוד alginate concentrAtions.

פרוטוקול המתואר להלן מתאר כיצד לתמצת תאים 10.5 מ"ל של 5% פתרון alginate מוכן 10 מ"מ -4 (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES) חיץ. Alginate מורכב תערובת של 50:50 של LVM כיתה השתלה (צמיגות נמוכה תוכן חומצה גבוהה mannuronic) ו MVG (צמיגות בינונית גבוהה חומצה guluronic תוכן) alginate. סידן קרבונט בריכוז סופי של 24 מ"מ משמש כסוכן פיזי מקשר. שמן מינרלי קל מהווה את השלב האורגני, בעוד חומצה אצטית משמש לחומציות תחליב ולהפעיל gelation פנימי. עם זאת, סוג alginate והרכב, כמו גם המאגר תהליך שנבחרו תלויים ביישום הרצוי 32 . מגוון של סוגים alginate (ראה טבלה של חומרים) שימשו לייצור חרוזים עם פרוטוקול זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכן את פתרון Alginate, את CaCO 3 השעיה ואת שמן Acidified

  1. הכן את המאגר תהליך בינוני.
    1. הכן את המאגר תהליך טיפוסי המשמש לייצור חרוזים alginate ריכוז גבוהה באמצעות 10 מ"מ HEPES, 170 מ"מ NaCl. התאם את pH 7.4.
    2. הכינו את המדיום תרבות טיפוסי באמצעות Dulbecco השתנה הנשר בינוני (DMEM) המכיל 10% בסרום שור עוברית (FBS), 6 מ"מ גלוטמין, 100 פניקסילין U / מ"ל, ו 100 מ"ג / מ"ל ​​סטרפטומיצין.
  2. הכן את פתרון המניות alginate ב 1.17 לקפל את הריכוז הרצוי הסופי החרוזים.
    1. ראשית, לשקול את הכמות המתאימה של אבקת alginate. לדוגמה, כדי לקבל ריכוז סופי של 5% alginate עם 50:50 LVM ו- MVG alginate, לשקול את סך של 1.17 גרם alginate נתרן על ידי שילוב של אבקת אלגינט LVM 0.583 גרם ו 0.583 גרם אבקת Alginate MVG.
    2. מקום 20 למאגר תהליך מ"ל לתוך autocצנצנת זכוכית lavable על מגש מערבבים צלחת ו להסעיר ב ~ 200 סל"ד. באופן מתקדם להוסיף את אבקת alginate נתרן לפתרון.
    3. השאירו את הפתרון ערבוב בן לילה במהירות נמוכה. אם יש צורך, להדק את הבקבוק על צלחת מערבל.
    4. אם הפתרון הוא מומס לחלוטין, להדק את הבקבוק על מערבל סיבוב ולהמשיך ערבוב ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות נוספות.
    5. לעקר את פתרון alginate ידי מעוקר הפתרון למשך 30 דקות בכלי שיט פחות מחצי מלא. אפשר לטמפרטורה לרדת מתחת 60 מעלות צלזיוס לפני אחזור הפתרון.
    6. במידת הצורך, להסיר חלקיקים על ידי סינון הפתרון alginate זמן קצר לאחר מעוקר לפני שהוא מגיע לטמפרטורת החדר, בעוד צמיגות נשאר מספיק נמוך.
  3. הכן את ההשעיה סידן פחמתי ב 21 פי ריכוז הסופי הרצוי עבור gelation פנימי.
    1. לשקול את אבקת CaCO 3 . לדוגמה, מודעהD 1 גרם CaCO 3 עד 20 מ"ל תהליך חיץ להשיג 24 מ"מ CaCO 3 כמו ריכוז סוכן gelling הסופי.
    2. החיטוי השעיית CaCO 3 למשך 30 דקות.
      הערה: ריכוז CaCO 3 ישתנה עם הזמן עקב שיווי המשקל של ביקרבונט - CO 2 . הימנע משימוש באותו מלאי CaCO 3 השעיה במשך יותר מ -10 הליכי אנקפסולציה.
  4. החיטוי הספינה נעה המשמש בתהליך ההרכבה. לפני השימוש, להסיר את כל עקבות של מים מרוכז הנותרים בקבוק ספינר.
  5. מיד לפני תהליך האמולסיפיקציה, להכין את שמן acidified. ממיסים 44 חומצה אצטית μL לכל שמן מינרלי 11 מ"ל להציב צינור 50 מ"ל חרוטי.
    הערה: טעות נפוצה היא פירוק חלקי של חומצה אצטית. הימנע pipetting כמויות קטנות של חומצה אצטית ולוודא כי חומצה אצטית הוא מומס לחלוטין בשמן על ידי vortexing חוזרות.
    זהירות: חומצה אצטית היא רעילה חומצה נדיפה. טיפול זה מגיב מתחת למכסה המנוע קטר ולשמור על פתרון חומצה אצטית / שמן במיכל סגור עד שלב האמולסיפיקציה. לקבלת מידע נוסף, עיין במידע של MSDS על מגיב זה.
  6. אפשר את כל הפתרונות להגיע לטמפרטורת החדר לפני שתמשיך אנקפסולציה התא.

2. Alginate חרוז הדור על ידי אמולסיפיקציה פנימית Gelation

  1. מקום 10 מ"ל שמן מינרלי אור בבקבוק ספינר ולהתחיל תסיסה במהירות סיבוב נמוכה ( למשל 250 סל"ד עבור בקבוק ספינר בשימוש בסרטון זה).
  2. אם התאים המשמשים את התהליך הם מתרבויות חסיד, להחיל טריפסין להשעות את התאים. סיים את התגובה על ידי הוספת FBS המכיל בינוני או מעכב טריפסין ולאסוף מדגם עבור ספירה התא.
    1. קביעת ריכוז התא הכדאיות לאחר מכתים כחול Trypan באמצעות hemocytometer או מונה תא אוטומטי, כפי שתואר לעילהתחת = "xref"> 32.
  3. צנטריפוגה התאים 7 דקות ב XG 300 ו לשטוף אותם פעם אחת במדיום הרצוי immobilization תא. ודא כי המדיום מכיל תחליבים כגון FBS או אלבומין בסרום שור (BSA). לדוגמה, השתמש DMEM המכיל 10% FBS.
  4. Re- להשעות את גלולה התא באותו בינוני להשיג 10.5 לקפל את הריכוז הסופי הרצוי החרוזים.
  5. הוסף 1.1 מ"ל של 10.5 קפל מלאי תאים מרוכזים ל 9.9 מ"ל של פתרון alginate. לאחר מכן, להוסיף 550 μL של השעיה CaCO 3 ומערבבים על ידי ערבוב עם מרית סטרילית כדי להבטיח הפצה אפילו של CaCO 3 .
  6. מיד להעביר 10.5 מ"ל של אלגינט, תא CaCO 3 תערובת לתוך שמן agitating באמצעות מזרק.
    הערה: לקבלת פתרונות צמיגה גבוהה, לשאוב ולהוציא את התערובת לאט מאוד, כדי למנוע בועות אוויר. במקרים מסוימים, עדיף לעצור את התסיסה תוך הוספת תערובת בקבוק כדי להימנעאלגינט entryment על פיר האימפלר.
  7. מיד לאחר הוספת alginate, תא CaCO 3 תערובת לשמן, להגדיל את שיעור התסיסה.
    הערה: עבור 5% LVM: MVG alginate בשימוש כאן, מהירות סיבוב של 1025 סל"ד הוחל לייצר חרוזים של כ 900 מיקרומטר קוטר מתאים לתרבות חוץ גופית 35 . מהירויות סיבוב גבוהות יותר וריכוזי אלגינט נמוכים יותר יובילו לקוטר חרוז ממוצע נמוך יותר, כפי שתואר בפרסומים קודמים 25 , 32 . שינויים קלים במודע וגיאומטריה כלי, כמו גם תכונות alginate יכול מאוד להשפיע על קוטר חרוז הממוצע. עבור כל שינוי בתצורה כלי או alginate הרבה, עקומה סטנדרטית המתייחסת את השטח משטח רגע קוטר חרוז הממוצע מהירות סיבוב צריך להיווצר 32 .
  8. הפעל את הטיימר emulsify את alginate במשך 12 דקות.
  9. הוסף 10 מ"ל של tהוא שמן פתרון חומצה אצטית לחמצן את תחליב, להמיס את CaCO 3 ומכאן פיזית לחצות את alginate לתוך חרוזים gelled. אפשר 8 דקות עבור צעד זה החמצה.

3. שחזור חרוז

  1. להפחית את קצב התסיסה עד 400 סל"ד. הוסף 40 מ"ל של המאגר תהליך מעורבב עם בינוני 10% כדי להגדיל את ה- pH ולגרום היפוך פאזה.
  2. עצור את התסיסה 1 דקות מאוחר יותר ולהעביר את התערובת צינורות 50 צנטריפוגה מ"ל. יש לשטוף את הבקבוק ספינר עם בינוני נוסף 20 מ"ל ולהוסיף זה לצינור. לשאוב כמה שלב מימית ככל האפשר מן הבקבוק ספינר לפני aspirating השלב בשלב כדי למזער את חרוז קשר עם השמן בשלב.
    הערה: השתמש פיפטה גדולה נשא ( למשל 25 פיפטה מ"ל) בשלב זה ומנקודה זו על מנת למנוע נזק חרוזים. עבור כרכים קטנים יותר, ההשעיה חרוז יכול גם להיות מניפולציה עם טיפים לחתוך פיפטה. כדי להשיג עצות כאלה, לחתוך את קצה קצה פיפטה עם מספריים WHאייל מגן עין הגנה.
  3. צנטריפוגה צינורות במשך 3 דקות ב XG 630 כדי להאיץ חרוז יישוב הפרדת פאזה.
  4. הסר את השמן תמיסת מימית עודף על ידי aspirating עם פיפטה פסטר.
  5. שטפו את החרוזים לפחות פעם אחת עם המדיום. סינון ההשעיה חרוז על 40 מיקרומטר ניילון מסננים תא, וכן לשאוב נוזלים עודף הקשורים החרוזים מתחת מסננת. מעבירים את החרוזים לתוך אמצעי ידוע של בינוני באמצעות מרית סטרילית.
    הערה: מסננים בגודל קטן או גדול יותר של הנקבוביות ניתן להשתמש בשלב זה, בהתאם לקוטר חרוז המינימום היעד. עם זאת, סינון הכבידה מומלץ במקום סינון בלחץ מונע באמצעות תת מסננים הנקבוביות משנה מיקרון כדי למנוע נזק חרוזים.
  6. למדוד את נפח החרוז על ידי נפח עקירה (נפח לאחר הוספת חרוזים, מינוס נפח לפני הוספת חרוזים) ואת למעלה בינוני כדי להשיג את החרוז הרצוי: יחס נפח הכולל, אשר בדרך כלל 1: 5, או 1 mL חרוזים ב4 מ"ל בינוני. מנקודה זו ואילך, תמיד להשתמש גדול pipettes נשא כדי למנוע נזק חרוזים.
  7. מעבירים את התאים encapsulated לתוך T- צלוחיות עבור תרבות חוץ גופית או ניסויים להשתלות.

4. בקרת איכות ויישומים

הערה: על מנת להבטיח איכות תא חרוז ו חרוז, הפצה גודל חרוז הישרדות התא לאחר התהליך צריך לכמת. היפוך הג'ל כדי לשחזר את התאים מתוך חרוזים לניתוח נוסף מבוצע בדרך כלל.

  1. כדי להעריך את גודל חרוז הפצה, הכתם את החרוזים עם toluidine כחול-O.
    1. המקום 0.5 חרוז מ"ל לתוך 4 מאגר תהליך מ"ל המכיל 10% בינוני מלא.
    2. הוסף 500 μL של 1 גרם / L toluidine פתרון כחול מוכן למאגר התהליך.
    3. דגירה של 60 דקות בצינור חרוטי על שייקר סיבוב ב 50 סל"ד.
    4. הוסף למאגר 5 מ"ל התהליך המכיל 10% בינוני מלא immedלהעביר את החרוזים ואת הפתרון לתוך צלחת פטרי לרכוש תמונות על מיקרוסקופ בהגדלה נמוכה או באמצעות מצלמה דיגיטלית ביד. אם יש צורך, מניחים את צלחת פטרי על תיבת אור לפני רכישת תמונות עם מצלמה ביד כדי לשפר את הניגוד ולהימנע צללים.
    5. בצע ניתוח תמונה לכמת את גודל הפצה חרוז כפי שתואר לעיל 32 , למשל באמצעות ניתוח תמונה חופשית 36 .
  2. כדי להעריך את הישרדות התא מבחינה איכותית, הכתם את התאים באמצעות homodimer ethidium לזהות תאים מתים calcein AM לזהות תאים חיים.
    1. הוסף נפח 1 של חרוזים ל 4 כרכים של המאגר תהליך המכיל 10% בינוני מלא.
    2. הוסף את הכמות המתאימה של Calcein AM ו ethidium homodimer פתרונות המניות להשיג 4 מיקרומטר ו 2 מיקרומטר ריכוזים, בהתאמה. יצירת פקדים כתם יחיד על ידי הוספת רק אחד ריאגנטים כמה דגימות חרוז.
    3. דגירה החרוזים על הקרח במשך 20 דקות.
    4. מניחים את הפתרון בין שקופית ו coverslip באמצעות spacer כגון o טבעת כדי לדחוס את החרוזים.
    5. המשך מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השתמש בפקדים כתם בודד להעריך הקרינה דימום דרך. בחר מסננים הקרינה המתאימים מבוסס על אורכי גל / פליטה פליטה הקשורים calcein AM (494/517 ננומטר) ו ethidium homodimer קשור DNA (528/617 ננומטר).
  3. כדי לשחזר את התאים מן חרוזים לניתוח נוסף, degel אלגינט באמצעות ציטראט או פתרון chelating אחר.
    1. הכן פתרון degelling המכיל 55 מ"מ ציטראט, 10 מ"מ HEPES ו 95 מ"מ NaCl ב pH 7.4.
    2. מערבבים את הפתרון עם בינוני 10%, ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל alginate חרוזים ל 9 מ"ל של התערובת.
    3. Degel החרוזים על הקרח עם 75 תסיסה סל"ד במשך 20 דקות.
      הערה: התאים יכולים כעת לשמש לניתוח או להסיר מן solgin אלגינט degelledיון על ידי צנטריפוגה. לדוגמה, כדאיות התא לאחר degelling ניתן לכמת על ידי מכתים כחול Trypan. לחלופין, התאים ניתן centrifuged ו שטף, ואחריו mRNA, DNA ו / או דגימה חלבון וניתוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בסוף תהליך ההטמעה ותהליך הגלאציה הפנימיים, יש לשחזר נפח חרוז הדומה לקומבינציה ההתחלתית הראשונה. חרוזים צריך להיות כדורית ביותר עם פגמים מעטים ( איור 3 ). החרוזים צריכים להיות חזקים מספיק כדי לעמוד pipetting דרך pipettes גדול נשא. בריכוז גבוה alginate, שמן encapsulated או טיפות אוויר ניתן לצפות חרוזים. זה סביר מתרחשת עקב מלכודת של שמן טיפות alginate במהלך שלב תחליב (שמן / מים / שמן תחליב כפול). בידיים שלנו, אלה חרוזים י...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צעדים שונים (המתואר באיור 2 ) במהלך התגובה gelation פנימי יכול להגביל את הקינטיקה הכוללת. עבור סידן פחמתי גרגרי גדול מ ~ 2.5 מיקרומטר, שיעור הפירוק קרבונט הוכח להיות שיעור הגבלת 26 , 44 . צעד החמצון שמוביל לשחרור סידן פנימי הוכח גם הוא כמשתנה תהליך קריטי המשפיע על הישרדות התא. התנאים המביאים gelation פנימי ולכן הם חיוניים הן עבור איכות חרוז, כמו גם הישרדות התא. בהתאם ליישום הסופי עבור חרוזים, התנאים האופטי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לגלות.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לג'יל אוסבורן על עבודתה על תהליך ההטמעה ועל לורן וילקינסון לתמיכה טכנית. אנו מודים לד"ר איגור לאסיק, לד"ר טימותי ג 'קיפר וד"ר ג'יימס ד' ג 'ונסון על הקלט שלהם ושיתוף פעולה. אנו מודים ל- Diabète Québec, JDRF, ThéCell, המרכז לחקר תאי גזע (CQMF) של המרכז למדעי הטבע והנדסה (NSERC), המרכז להשתלת תאי אדם והתאוששות ביתא, רשת תאי הגזע הקנדית, קרן מייקל סמית 'לחקר הבריאות, לה פונדס דה לה ריצ'רשה סור לה טבע et les טכנולוגיות ו COST 865 לתמיכה כספית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים וחומרים מתכלים
LVM אלגינט (דרגת השתלה)Novamatrixלא ישיםמכונה "אלגינט #1" בתוצאות.
MVG אלגינט (דרגת השתלה)Novamatrixלא ישיםמכונה "אלגינט #2" בתוצאות.
אלגינט (דרגת תרבית תאים)סיגמאA0682 (צמיגות נמוכה) או A2033 (צמיגות בינונית)A2033 מכונה "אלגינט #3" בתוצאות.
DMEMLife Technologies11995-065
סרום בקר עוברי, מאופיין, ממקור קנדיThermo Fisher ScientificSH3039603
GlutamineLife Technologies25030
פניצילין וסטרפטומיציןSigmaP4333-100ML
HEPES, נבדק בתרבית תאיםSigmaH4034-100G
NaClThermo Fisher ScientificS271-1
CaCO3Avantor חומרים1301-01לאחר הכנת מתלה CaCO3, סוניקט ושימוש תוך חודש אחד.
שמן מינרלי קלThermo Fisher ScientificO121-4מסנן סטרילי דרך 0.22 μ ממברנה בגודל נקבוביות M לפני השימוש.
חומצה אצטית קרחוניתThermo Fisher ScientificA38-500טפל בזהירות: עיין ב-MSDS.
מרית סטריליתSigmaCLS3004-100EA
מסנני תאי ניילון סטריליים, 40 ומיקרו; mThermo Fisher Scientific08-771-1
פיפטות סרולוגיות (2 מ"ל, 5 מ"ל, 10 מ"ל, 25 מ"ל)Sarstedt86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 ו- 86.1685.001
פיפטות פסטרVWR14673-043
Toluidine Blue-OSigmaT3260
<חזק>ציוד
100 מ"ל צלוחיות ספינר מיקרו-מובילBellco1965-00100ייתכן שתצורת האימפלר עם הדגמים האחרונים לא תתאים לאמולסיה נאותה. להב המסוגל לטאטא את השמן עד 0.5 ס"מ מתחתית הבקבוק יכול להיות מיוצר בהתאמה אישית מגיליון טפלון.
פלטת ערבוב מגנטית עם מהירות מתכווננתBellco7760-06005יש לכייל את מהירות הסיבוב (למשל באמצעות טכומטר) לפני השימוש.
מונה סלולריInnovatisCedex AS20מערכת זו נמכרת כעת על ידי רוש. ניתן להחליף את מונה התאים האוטומטי הזה גם בספירת תאים ידנית לאחר צביעה כחולה של טריפן באמצעות המוציטומטר.
קופסת תאורת LEDArtographLightPad® PROניתן להחליף פריט זה בסוגים אחרים של תאורה.
מצלמת כף ידCanonPowerShot A590 ISניתן להשתמש במגוון מצלמות כף יד כדי לצלם תמונות חרוזים מוכתמים בכחול-O. יש להניח סרגל ליד צלחת הפטרי המכילה את החרוזים לפני קבלת התמונות.
מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם ניגודיות פאזה ומסנני פלואורסצנציה נאותיםאולימפוסIX81מספר מערכות מיקרוסקופיה שימשו להדמיית החרוזים. התוצאות המוצגות כאן התקבלו באמצעות מיקרוסקופ IX81 המצויד במסנני פלואורסצנטי GFP ו-TRITC. כדי ללכוד חרוזים שלמים, נעשה שימוש במטרות פי 4 עד פי 20 בהתאם לקצב התסיסה. תמונות צביעה חיות/מתות צולמו בדרך כלל עם יעדים של פי 20 עד פי 40.
תוכנה לרכישת תמונותMolecular DevicesMetamorphניתן להשתמש במגוון תוכנות לרכישת תמונות כדי לרכוש תמונות ניגודיות פאזה ופלואורסצנטיות.
תוכנה חינמית לניתוח תמונותCellProfilerלא ישיםניתן להשתמש במגוון תוכנות לניתוח תמונות כדי לזהות חרוזים כאובייקטים ולנתח את גודל החרוזים (למשל ImageJ).

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scharp, D. W., Marchetti, P. Encapsulated islets for diabetes therapy: history, current progress, and critical issues requiring solution. Adv Drug Deliv Rev. 67-68, 35-73 (2014).
  2. Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm. Biomaterials. 31 (3), 505-514 (2010).
  3. Sidhu, K., Kim, J., Chayosumrit, M., Dean, S., Sachdev, P. Alginate microcapsule as a 3D platform for propagation and differentiation of human embryonic stem cells (hESC) to different lineages. J Vis Exp. (61), (2012).
  4. Tostoes, R. M., et al. Perfusion of 3D encapsulated hepatocytes--a synergistic effect enhancing long-term functionality in bioreactors. Biotechnol Bioeng. 108 (1), 41-49 (2011).
  5. Duvivier-Kali, V. F., Omer, A., Parent, R. J., O'Neil, J. J., Weir, G. C. Complete protection of islets against allorejection and autoimmunity by a simple barium-alginate membrane. Diabetes. 50 (8), 1698-1705 (2001).
  6. Omer, A., et al. Long-term normoglycemia in rats receiving transplants with encapsulated islets. Transplantation. 79 (1), 52-58 (2005).
  7. Rayat, G. R., Rajotte, R. V., Ao, Z., Korbutt, G. S. Microencapsulation of neonatal porcine islets: protection from human antibody/complement-mediated cytolysis in vitro and long-term reversal of diabetes in nude mice. Transplantation. 69 (6), 1084-1090 (2000).
  8. Korbutt, G. S., Mallett, A. G., Ao, Z., Flashner, M., Rajotte, R. V. Improved survival of microencapsulated islets during in vitro culture and enhanced metabolic function following transplantation. Diabetologia. 47 (10), 1810-1818 (2004).
  9. Luca, G., et al. Improved function of rat islets upon co-microencapsulation with Sertoli's cells in alginate/poly-L-ornithine. AAPS PharmSciTech. 2 (3), E15(2001).
  10. Omer, A., et al. Survival and maturation of microencapsulated porcine neonatal pancreatic cell clusters transplanted into immunocompetent diabetic mice. Diabetes. 52 (1), 69-75 (2003).
  11. Schneider, S., et al. Long-term graft function of adult rat and human islets encapsulated in novel alginate-based microcapsules after transplantation in immunocompetent diabetic mice. Diabetes. 54 (3), 687-693 (2005).
  12. Cui, H., et al. Long-term metabolic control of autoimmune diabetes in spontaneously diabetic nonobese diabetic mice by nonvascularized microencapsulated adult porcine islets. Transplantation. 88 (2), 160-169 (2009).
  13. Krishnan, R., Alexander, M., Robles, L., Foster, C. E. 3rd, Lakey, J. R. Islet and stem cell encapsulation for clinical transplantation. Rev Diabet Stud. 11 (1), 84-101 (2014).
  14. Robles, L., Storrs, R., Lamb, M., Alexander, M., Lakey, J. R. Current status of islet encapsulation. Cell Transplant. 23 (11), 1321-1348 (2014).
  15. Desai, T., Shea, L. D. Advances in islet encapsulation technologies. Nat Rev Drug Discov. , (2016).
  16. Anilkumar, A. V., Lacik, I., Wang, T. G. A novel reactor for making uniform capsules. Biotechnol Bioeng. 75 (5), 581-589 (2001).
  17. Wolters, G. H., Fritschy, W. M., Gerrits, D., van Schilfgaarde, R. A versatile alginate droplet generator applicable for microencapsulation of pancreatic islets. J Appl Biomater. 3 (4), 281-286 (1991).
  18. Heinzen, C., Marison, I., Berger, A., von Stockar, U. Use of vibration technology for jet break-up for encapsulation of cells, microbes and liquids in monodisperse microcapsules. Practical Aspects of Encapsulation Technologies. , 19-25 (2002).
  19. Poncelet, D., et al. A Parallel plate electrostatic droplet generator: Parameters affecting microbead size. Applied Microbiology and Biotechnology. 42 (2-3), 251-255 (1994).
  20. Prüße, U., Dalluhn, J., Breford, J., Vorlop, K. D. Production of Spherical Beads by JetCutting. Chemical Engineering & Technology. 23 (12), 1105-1110 (2000).
  21. Hoesli, C. A. Bioprocess development for the cell-based treatment of diabetes (PhD thesis). , University of British Columbia. (2010).
  22. Brandenberger, H., Widmer, F. A new multinozzle encapsulation/immobilisation system to produce uniform beads of alginate. J Biotechnol. 63 (1), 73-80 (1998).
  23. Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. Br J Surg. 95 (12), 1449-1461 (2008).
  24. Reis, C. P., Neufeld, R. J., Vilela, S., Ribeiro, A. J., Veiga, F. Review and current status of emulsion/dispersion technology using an internal gelation process for the design of alginate particles. J Microencapsul. 23 (3), 245-257 (2006).
  25. Poncelet, D., et al. Production of alginate beads by emulsification/internal gelation. I. Methodology. Appl Microbiol Biotechnol. 38 (1), 39-45 (1992).
  26. Poncelet, D., et al. Production of alginate beads by emulsification/internal gelation. II. Physicochemistry. Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (4), 644-650 (1995).
  27. Alexakis, T., et al. Microencapsulation of DNA within alginate microspheres and crosslinked chitosan membranes for in vivo application. Appl Biochem Biotechnol. 50 (1), 93-106 (1995).
  28. Vandenberg, G. W., De La Noue, J. Evaluation of protein release from chitosan-alginate microcapsules produced using external or internal gelation. J Microencapsul. 18 (4), 433-441 (2001).
  29. Silva, C. M., Ribeiro, A. J., Figueiredo, I. V., Goncalves, A. R., Veiga, F. Alginate microspheres prepared by internal gelation: development and effect on insulin stability. Int J Pharm. 311 (1-2), 1-10 (2006).
  30. Larisch, B. C., Poncelet, D., Champagne, C. P., Neufeld, R. J. Microencapsulation of Lactococcus lactis subsp. cremoris. J Microencapsul. 11 (2), 189-195 (1994).
  31. Hoesli, C. A., et al. Reversal of diabetes by betaTC3 cells encapsulated in alginate beads generated by emulsion and internal gelation. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100 (4), 1017-1028 (2012).
  32. Hoesli, C. A., et al. Pancreatic cell immobilization in alginate beads produced by emulsion and internal gelation. Biotechnol Bioeng. 108 (2), 424-434 (2011).
  33. Reinsel, M. A., Borkowski, J. J., Sears, J. T. Partition Coefficients for Acetic, Propionic, and Butyric Acids in a Crude Oil/Water System. Journal of Chemical & Engineering Data. 39 (3), 513-516 (1994).
  34. Xiu-Dong, L., Wei-Ting, Y., Jun-Zhang, L., Xiao-Jun, M., Quan, Y. Diffusion of acetic acid across oil/water interface in emulsification-internal gelation process for preparation of alginate gel beads. Chemical Research in Chinese Universities. 23 (5), 579-584 (2007).
  35. Fernandez, S. A., et al. Emulsion-based islet encapsulation: predicting and overcoming islet hypoxia. Bioencapsulation Innovations. (220), 14-15 (2014).
  36. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100(2006).
  37. Hinze, J. O. Fundamentals of the hydrodynamic mechanism of splitting in dispersion processes. AIChE Journal. 1 (3), 289-295 (1955).
  38. Kolmogorov, A. N. On the breakage of drops in a turbulent flow (translated from Russian). Doklady Akademii Nauk. 66, 825-828 (1949).
  39. Davies, J. T. Drop Sizes of Emulsions Related to Turbulent Energy-Dissipation Rates. Chemical Engineering Science. 40 (5), 839-842 (1985).
  40. Pacek, A. W., Chamsart, S., Nienow, A. W., Bakker, A. The influence of impeller type on mean drop size and drop size distribution in an agitated vessel. Chemical Engineering Science. 54 (19), 4211-4222 (1999).
  41. Steiner, H., et al. Numerical simulation and experimental study of emulsification in a narrow-gap homogenizer. Chemical Engineering Science. 61 (17), 5841-5855 (2006).
  42. Tcholakova, S., Denkov, N. D., Lips, A. Comparison of solid particles, globular proteins and surfactants as emulsifiers. Phys Chem Chem Phys. 10 (12), 1608-1627 (2008).
  43. Lagisetty, J. S., Das, P. K., Kumar, R., Gandhi, K. S. Breakage of viscous and non-Newtonian drops in stirred dispersions. Chemical Engineering Science. 41 (1), 65-72 (1986).
  44. Draget, K. I., Ostgaard, K., Smidsrod, O. Homogeneous Alginate Gels - a Technical Approach. Carbohydrate Polymers. 14 (2), 159-178 (1990).
  45. Poncelet, D., Dulieu, C., Jacquot, M. Immobilized Cells. Wijffels, R. H. , Springer. Berlin Heidelberg. 15-30 (2001).
  46. Islam, A. W., Zavvadi, A., Kabadi, V. N. Analysis of Partition Coefficients of Ternary Liquid-Liquid Equilibrium Systems and Finding Consistency Using Uniquac Model. Chemical and Process Engineering-Inzynieria Chemiczna I Procesowa. 33 (2), 243-253 (2012).
  47. Quong, D., Neufeld, R. J., Skjak-Braek, G., Poncelet, D. External versus internal source of calcium during the gelation of alginate beads for DNA encapsulation. Biotechnol Bioeng. 57 (4), 438-446 (1998).
  48. De Vos, P., De Haan, B. J., Van Schilfgaarde, R. Upscaling the production of microencapsulated pancreatic islets. Biomaterials. 18 (16), 1085-1090 (1997).
  49. Gross, J. D., Constantinidis, I., Sambanis, A. Modeling of encapsulated cell systems. J Theor Biol. 244 (3), 500-510 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים