פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה מפורט לגילוי H2O2 לוקליזציה בתוך Solea senegalensis spermatozoa באמצעות fluorochrome רגיש DCFH-DA ROS, כתם המיטוכונדריה בשידור חי עבור המיטוכונדריה, דאפי עבור גרעינים ויזואליזציה, בהתאמה. הפרוטוקול נועד להתבצע בתוך 2 h עם spermatozoa טריים או המופשרים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הערכה של המיקום תאיים של מינים חמצן תגובתי ב- Solea Senegalensis Spermatozoa
במאמר זה
סיכום
תקציר
סטרס חמצוני הוא אחד הגורמים החשובים בהפחתת באיכות הזרע. פיתוח פרוטוקולי יעיל לגילוי מינים חמצן תגובתי (ROS) ב- spermatozoa היא בעלת חשיבות גבוהה בכל מין, אך שיטות אלה הן נדירות אפילו פחות teleost. הקפאה קריוגנית היא טכניקה שימושית בחקלאות ימית למטרות שונות, לרבות בנקאות ג'ין והבטיחה את הזרע זמינות לאורך כל השנה. הקפאה \ הפשרה הליכים יכול לגרום ROS הייצור, נזק לתאי הזרע. בהתחשב פוטנציאליים נזק זה עודף של ROS הפקה עלול לגרום ב spermatozoa תלוי לוקליזציה שלהם, הנה מתודולוגיה מפורט כדי לזהות2O H2 וכן להעריך שלה לוקליזציה תאיים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית מסופק. למטרה זו, שילוב של 3 fluorochromes (2 ′, 7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA), כתם המיטוכונדריה בשידור חי ו- 4 ′, 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (דאפי)) משמשים להערכת ההתאמה שיתוף של H2O2 עם spermatozoa גרעינים או המיטוכונדריה דגימות זרע Solea senegalesis .
מבוא
ההפקה של מינים חמצן תגובתי נקשרה עם איכות זרע לאחרונה1. למרות ROS הייצור בתוך המיטוכונדריה יכול להיחשב תהליך פיזיולוגי נורמלי, סטרס חמצוני על-ידי עודף הייצור ROS הוא סיבה ברורה של פגיעה ב spermatozoa ברמות שונות. בבני אדם, סטרס חמצוני מזוהה עם בעיות פוריות הגבר, שינוי תנועתיות ואת היכולת לעבור capacitation2; ביונקים, שינוי של שלמות הדנ א דגימות זרע קפוא גם קשורה סינתזה של H-2O-2-3.
הקפאה קריוגנית היא טכניקה נפוצה עבור ג'ין בנקאות, חקלאות ימית. טכנולוגיה זו חשוב במיוחד במינים עם בעיות הרבייה כגון Solea senegalensis. מין זה יקר בשוק מראה תפק....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: דגירה Fluorochrome וניתוח קונאפוקלית ייקח לפחות 2-3 h עבור פקד, מדגם שטופלו. חישוב זמן זה אינו כולל עיבוד נתונים. חומרים הדרושים ניתן למצוא את הטבלה של חומרים. פרוטוקול זה ניתן ליישם טריים או cryopreserved spermatozoa. Solea senegalensis הוא מין דג שמשריץ במים קרים, עבודה תמיד בתנאים קרים (4-7 ° C). ראה איור 1 מראה כללי של הפרוטוקול.
1. עבודת הכנה לפני הניסוי
- הכן 1 מ מ המיטוכונדריה כתם מניות פתרון אנליטי כיתה דימתיל סולפוקסיד.
- להכין עם 4 ′ 1 μg/mL, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (דאפי) פתרון מלאי במים יונים.
- להכין פתרון דומה מאוד mOsm/kg ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מיקרוסקופיה קונפוקלית היא שיטה אידיאלית להערכה ROS תאיים זרע teleost. השילוב של שלוש fluorochromes (דאפי, הכתם המיטוכונדריה, DCFH-DA) שהוצגו במחקר זה (איור 1) מספק הרבה מידע שימושי, זה יכול להיות מיושם במחקר בסיסי ויש יישומים לשיפור תהליכי בשימוש חקלאות מים תעשייתי צמחים, כגון פרוטוקולים הקפאה קריוגנית. סוגים שונים של ניתוח עשוי להתבצע על מנת לתאם תאיים ROS בנוכחות ופרמטרים אחרים: תנועתיות, הכדאיות, דפוסים שונים בין טוב ורע מגדלים, הפעלה של תנועתיות או וריאצי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
זה ידוע כי המיטוכונדריה הם organelles מפתח עבור זרע תנועתיות ותפקוד. Organelles אלה מעורבים במקביל ישירות בייצור ROS. מעניין, רמות מבוקרת של ROS נדרשים עבור זרע תקין פונקציה1. יחסים חיוביים בין פוריות סטרס חמצוני הוכחו יונקים11 אך רמות מוגזמות להשפיע על איכות הזרע12. גורם מכריע אחד זה יכול להיות מכריע לקראת אפקט חיובי או שלילי הוא לא רק רמות ROS, אלא גם לוקליזציה תאיים ROS. אחת ההשפעות המזיקות של ROS מפיק DNA נזק9 , ולכן נוכחו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
אנו מודים AQUAGAMETE פא 1205 עלות פעולה. עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי פרויקט AGL201568330-C2-1-R (MINECO/פדר). דוד ג Valcarce מומן על ידי דה חונטה ולאון (EDU1084 2012) ו Fondo Europeo חברתית. מחברים מכיר ד ר אנה Riaza, האנרגטי לים חווה דרום אמריקה, ד ר פאולין דה פז, ד ר איגנסיו מרטינס מונטרו, חוסה רמון Guiérrez. אנו מודים גם פאולה פרננדז Colado עבור צילום וידאו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 2&פריים;,7&פריים;-דיכלורודיהידרופלואורסצאין דיאצטט (DCFH-DA) | סיגמא-אולדריץ' | D6883 | |
| 4&פריים;,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) | סיגמא-אולדריץ' | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| מיקרוסקופיה קונפוקלית | Zeiss | LSM800 | |
| החלקות כיסוי | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, כיתה אנליטית | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| מתנול, כיתה אנליטית | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerאדום עמוק | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| מיקרוצנטריפוגה (מקוררת) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
מקורות
- Amaral, S., et al. Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function. Curr Med Chem. , (2016).
- Morielli, T., O'Flaherty, C. Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
