מאמר שיטה

בשנת מעקב Vivo של בצקת פיתוח ופתולוגיה מיקרוסקולרית במודל של מלריה מוחית ניסיוני באמצעות תהודה מגנטית הדמיה

DOI:

10.3791/55334

⸱

8 ביוני 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroradiology, Heidelberg University Hospital, 2Division of Experimental Radiology, Department of Neuroradiology, Heidelberg University Hospital, 3NeuroImaging Centre Research, Department of Neuroscience, Ruhr-University Bochum, 4Centre for Infectious Diseases, Parasitology Unit, Heidelberg University Hospital, 5German Centre for Infection Research (DZIF), 6Department of Neuroradiology, University of Würzburg, 7Center for Childhood and Adolescent Medicine, General Pediatrics, Heidelberg University Hospital

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים מודל עכבר של מלריה מוחית ניסיונית ומראים כיצד ניתן לעקוב אחר פתולוגיה דלקתית ומיקרו-וסקולרית in vivo באמצעות הדמיית תהודה מגנטית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מלריה מוחית היא סימן למחלת מלריה קשה ולעתים קרובות היא מבשרת מוות. בעוד שניהול אגרסיבי יכול להציל חיים, גילוי מלריה מוחית יכול להיות קשה. אנו מציגים מודל עכברי ניסיוני של מלריה מוחית החולקת מאפיינים מרובים של המחלה האנושית, כולל בצקת ופתולוגיה מיקרו-וסקולרית. באמצעות דימות תהודה מגנטית (MRI), אנו יכולים לזהות ולעקוב אחר הפרעה במחסום הדם-מוח, התפתחות בצקת ונפיחות מוחית לאחר מכן. אנו מתארים טכניקות MRI מרובות שיכולות לדמיין את השינויים הפתולוגיים הרלוונטיים הללו. לפיכך, אנו מראים ש-MRI מייצג כלי רב ערך להדמיה ומעקב אחר שינויים פתולוגיים, כגון בצקת, נפיחות במוח ופתולוגיה מיקרו-וסקולרית, in vivo.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מלריה היא בעיה בריאותית עולמית משמעותית. 1 מלריה חדה מאופיינת בחלקה במעורבות מוחית, ולעתים קרובות היא גורם פרוגנוסטי גרוע. מעורבות מוחית שכיחה אצל ילדים מתחת לגיל 5 באזורים של העברת מלריה גבוהה ומייצגת את הגורם העיקרי למוות הקשור למלריה בקבוצת גיל זו. 1 בעוד טיפול אגרסיבי יכול להיות הצלת חיים, איתור מלריה מוחית, במיוחד בשלבים הראשונים, יכול להיות קשה. התהליכים הפתולוגיים המעורבים במלריה מוחית כוללים הפרעות בכלי הדם ובצקת מוחית, אשר עלולים לגרום לנפיחות מוחית חמורה. במאמר זה, אנו מציגים הדמיה תהודה מגנטית (MRI) פרוטוקול המאפשר המוח כולו הדמיה vivo של מלריה מוחי ניסיוני (ECM). שיטות מוח מלאות ברזולוציה גבוהה מוחלשות במידה ניכרת במחלה זו, אף כי מעט ידוע על האופן שבו ECM יוזם במרכזמערכת העצבים או אילו מנגנונים ספציפיים מובילים למחלה. ב MRI vivo , מכסה את המוח כולו, מייצג כלי מחקר חשוב כדי להשיג הבנה טובה יותר של הפתולוגיה של ECM. MRI הוא מסוגל להעריך נפיחות מוחי מוחי עולמי, אשר הוכרה לאחרונה להיות מנבא חשוב למוות לא רק ב- ECM, אלא גם מלריה מוחית אנושית. 2 , 3 נפיחות מוחית חמורה מתרחשת במחלה קטלנית ומייצגת אחת ממספר תכונות פתולוגיות בין המודלים של ECM לבין מחלת האדם, מחלה המאופיינת בשינויים דלקתיים ומיקרוסקולריים כאחד. 4

ECM יכול להיות המושרה CBA או עכברים C57BL דרך זיהום עם פלסמודיום ברגי ANKA. 5 הופעת ה- ECM מתרחשת בדרך כלל בין ימים 6 ו -10 לאחר ההדבקה ומביאה למצבים הולמים, אטקסיה, נשימה ותרדמת, אשר מובילים לראפמוות מוות. 4 The Rapid Murine Coma וסולם התנהגות (RMCBS) הוא ציון מועיל להערכת תסמינים קליניים של ECM. זה מורכב מ 10 פרמטרים, כל אחד הבקיע מ 0 ל 2, עם ציון מקסימלי האפשרי של 20. 6 לאחרונה, הראינו הסכמה טובה בין חומרת ציוני RMCBS בעכברים ECM ושינויים פתולוגיים שהפגינו MRI. 7 בפרוטוקול זה, אנו מתארים אינדוקציה ECM בעכברים ב vivo הדמיה תהודה מגנטית של עכברים עם ECM.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בבעלי חיים שדווחו במאמר זה נערכו על פי האגודה הפדרלית למעבדות מדענים בבעלי חיים (FELASA) בקטגוריה B ו- GV-SOLAS, אשר אושרו על ידי הרשויות הגרמניות המקומיות בקרלסרוהה (Regierungspräsidium Karlsruhe) , גרמניה). לידיעתך, רמת הביו-שווה 2 חלה על יתושים ועל פלסמודיום ברגי ANKA sporozoite.

1. זיהום

  1. להדביק יתושים sthensians anopheles עם Plasmodium berghei ANKA ידי האכלה אותם במשך 15 דקות על עכבר gametocytemic. שמור על יתושים נגועים על לחות 80% ו 21 ° C.
  2. איסוף יתושים נקבה מן הכלוב שלהם 17-22 ימים לאחר ארוחה דם. מניחים אותם על קרח להרדים אותם.
  3. בעזרת מלקחיים, במקום שלושה עד ארבעה יתושים על שקופית זכוכית מכוסה עם ירידה של בינוני RPMI קר. מניחים את השקופית תחת מיקרוסקופ.
  4. באמצעות מלקחיים, בזהירות למתוח את היתוש בין הראש והגוף. לבודד את בלוטת הרוק באמצעות מזרק ומחט. חזור על הליך זה עם יתושים הנותרים.
  5. לאסוף את בלוטות הרוק מן השקופית זכוכית על ידי מציצת אותם עם פיפטה זכוכית לאסוף אותם צינור צנטריפוגות 1.5 מ"ל.
    הערה: בהתאם לשיעורי הזיהום, בדרך כלל 8,000 עד 15,000 sporozoites זיהומיות ניתן להשיג לכל בלוטת הרוק.
  6. במשך כ 3 דקות, לרסק את בלוטות הרוק מבודדים בתוך צינור צנטריפוגות עם קטן, מקל פלסטיק לבודד את sporozoites מ רקמת בלוטת הרוק.
  7. צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 1000 xg ו 4 ° C לטהר את sporozoites מן הרקמה שנותרה.
  8. פיפטה supernatant, אשר מכיל את sporozoites (SPZ), כדי צינור צנטריפוגה חדשה לספור את sporozoites מטוהרים hemocyer hemocytometer.
  9. התאם את הריכוז של sporozoites מטוהרים ל 10,000 / מ"ל ​​על ידי הוספת phאוספטים שנאגרו מלוחים.
  10. להזריק סך של 1,000 sporozoites (0.1 מ"ל) לתוך הוורידים הזנב של inbred C57BL / 6 עכברים ליזום זיהום. כדי להקל על זריקות, במקום C57BL / 6 עכברים מסננת ולשים את הזנבות לתוך חם (כ 37 מעלות צלזיוס) מים כדי לסייע עם ויזואליזציה של הוורידים הזנב;
    הערה: הזריקה עצמה היא הליך קצר שניתן לבצע תוך מספר שניות.
  11. פעם ביום, לבדוק את השלב parasitemia דם על כתמי דם מיום 3 ואילך לאחר ההדבקה SPZ.
    הערה: פרזיטמיה ניטור כבר דמיינו בעבר במאמר JoVE על ידי Mueller et al. 8
  12. להעריך את העכברים פעם ביום עם ניקוד Rapid Murine ו התנהגות סולם (RMCBS) ציון, החל מיום 5 לאחר הזרקת sporozoite.
    הערה: תיאור מפורט של הליך זה, כולל הפגנת וידאו, פורסם על ידי Caroll et al. 6
  13. לְהַעֲרִיךאת העכברים עם הדמיה MRI על פי ניקוד RMCBS ואת שאלת המחקר שיש לטפל. 6

2. הגדרת תהודה מגנטית

  1. בצע MRI על סורק בעל חיים קטן 9.4T באמצעות מהוד נפח עבור שידור רדיו תדר ו 4-channel-Phase-מערך מקלט סליל פני השטח. הפעל את אמבט טמפרטורה מבוקרת מים ל 42 מעלות צלזיוס על מנת לשמור על טמפרטורת הגוף של העכבר.
  2. להשרות הרדמה בחדר באמצעות 2% isoflurane ו אוויר דחוס עד העכבר כבר לא מגיב על קמצוץ אצבע. לשמור על הרדמה ב 1-1.5%.
  3. מניחים זחל וריד הזנב לתוך הווריד הזנב של העכבר. מקמו את העכבר עבור MRI על ידי הנחת אותו נוטה עם crunch בחזרה על מיטת בעלי חיים מצויד headlock ובר השן כדי למזער את תנועת הראש. הקפד לא ליישר את עמוד השדרה הצוואר של העכבר.
  4. חיבור מערכת הזרקת הזרקת סוכן כדי catheter וריד הזנב. השתמש בהזרקת מערכת בהזמנה אישית מלא מזרק GD-DTPA (0.3 mmol / kg) מזרק או להשתמש בצינור PE מחובר מזרק GD-DTPA (0.3 מ"מ / ק"ג) מזרק.
  5. החל משחת עיניים dexpanthenol לשני העיניים. מניחים את 4-channel-phase- מערך מערך ראש מקלט סליל ראש על הראש של העכבר. מניחים את לוח הנשימה על גב העכבר ומחברים אותו למכשיר לניטור הנשמה.

3. פרוטוקול הדמיה

הערה: בחר רצפים הדמיה מהפרוטוקול המפורט להלן על פי שאלות המחקר שיש לטפל. כל הפרמטרים הרשומים תקפים עבור תוכנת ה- MRI, אך ייתכן שיהיה צורך להתאים אותם אם נעשה שימוש בתוכנות אחרות.

  1. התחל על ידי ביצוע סריקה לוקליזציה כדי לוודא כי המוח העכבר נמצא isocenter של המגנט.
  2. כדי להעריך באופן איכותי את בצקת vasogenic, להשתמש 3D D2 משוקלל הדמיה על ידי בחירת רצף רב רצף נדיר.
    1. הזן את הבאRameters לתוך תוכנת MRI: זמן חזרה = 2.000 ms, הד זמן = 22 ms, רזולוציה איזוטרופית = 0.1mm, שדה תצוגה = 20 x 10 x 12 מ"מ 3 ; מטריצה ​​= 200 x 100 x 120, זווית הפוך = 90-180 °; (ספין הד), ו גורם נדיר = 8. הפעל את רצף ולחכות 10 דקות 48 שניות כדי לרכוש את התמונות גלם.
  3. כדי להעריך כמותית בצקת vasogenic לבצע T2 relaxometry על ידי בחירה רב פרוסה, מספר רב הד ספין רצף.
    1. השתמש בפרמטרים הבאים: זמן החזרה = 3.100 ms, זמן הד = 8-136 מילישניות במרווחים של 8 אלפיות השנייה, מספר הפרוסות = 17, עובי הפרוסה = 0.7 מ"מ, ברזולוציה של המטוס = 0.116 מ"מ 0.116 מ"מ, שדה הראייה 20 X 20 מ"מ 2 , מטריצה ​​= 172 x 172, זווית הפוך = 90-180 מעלות; (ספין הד). התחל את רצף לחכות 8 דקות 53 שניות כדי לרכוש את התמונות גלם.
  4. כדי להעריך כמותית הן בצקת ווזוגנית בצקת ציטוטוקסית, לבצע דיפוזיה משוקלל הדמיה / דיפוזיה לכאורה coeFficient (ADC) מיפוי על ידי בחירת ספין הד epi דיפוזיה רצף.
    1. השתמש בפרמטרים הבאים: זמן החזרה = 3.400 ms, זמן הד = 20 מילישניות, עובי פרוסה = 0.7 מ"מ, מספר פרוסות = 17, מספר כיווני רגישות דיפוזיה = 30, ערך b = 1.500 s / mm 2 , δ = 3 ms , Δ = 9 ms, גורם האצת קידוד חלקי של Fourier = 1.51, שדה הראייה = 12 x 15 מ"מ 2 , מטריצה ​​= 96 x 128, רזולוציה בתוך המטוס = 0.125 מ"מ x 0.117 מ"מ, זווית הפוך = 90-180 מעלות, מספר פרוסות הרוויה (sagittal) = 1. הפעל את רצף ולחכות 7 דקות 56 s עד תמונות גלם נרכשים.
  5. כדי להעריך microhemorrhages, השתמש 3D הדמיה T2 * -weighted. בחר רצף FLASH מפוצם זרימה.
    1. הזן את הפרמטרים הבאים בתוכנת ה- MRI: זמן החזרה = 2.000 ms, זמן הד = 22 ms, רזולוציה איזוטרופית 0.08 מ"מ, שדה תצוגה = 32 x 15 x 8 מ"מ 3 , גודל מטריצה ​​= 400 x 188 x 100, ו- fזווית השפתיים = 12 מעלות. התחל את רצף ולחכות 15 דקות 40 s כדי לרכוש את התמונות גלם.
  6. כדי להעריך פטריות עורקית, השתמש זמן של אנגיוגרפיה הטיסה על ידי בחירת רצף 3D FLASH.
    1. השתמש בפרמטרים הבאים בתוכנת ה- MRI: זמן החזרה = 16 ms, זמן הד = 3.5 מילישניות, עובי פרוסה = 0.07 מ"מ, רזולוציה בתוך המטוס = 0.104 x 0.104 מ"מ, שדה תצוגה = 20 x 20 x 10 מ"מ 3 , מטריצה = 192 x 192 x 142, והפוך זווית = 15 מעלות. הפעל את רצף לחכות 7 דקות 16 s עד התמונות נרכשים.
  7. כדי להעריך הפרעה מוחית מוח דם, השתמש 3D דימות משוקלל T1 לפני ואחרי הזרקת סוכן בניגוד 0.3 mmol / kg. בחר רצף FLASH תדר רדיו מפונק עם עירור תדר רדיו גלובלי.
    1. השתמש בפרמטרים הבאים ברצף בתוכנת ה- MRI: זמן חזרות = 5 ms, זמן הד = 1.9 ms, רזולוציה איזוטרופית = 0.156 מ"מ, שדה תצוגה 20 x 18.7X 18.7 מ"מ 3 , מטריצה ​​128 x 120 x 120 וזווית הפוך = 8.5 ° ;. התחל את רצף לחכות 1 דקות 14 עד התמונות נרכשים.

4. עיבוד תמונה וניתוח

  1. כדי לנתח את המוח הפרעה מחסום דם, לחסר 3D שאינם משופרת תמונות T1 משוקלל משופרת תמונות משוקלל T1 עם כלי אריתמטי או כלי תמונה התמונה ImageJ. להעריך את תמונות חיסור עבור עלייה של האות, אשר תואמת הפרעות במחסום דם מוחי. 9
  2. כדי לנתח את עוצמת הקול במוח, השתמש במערכי נתונים תלת-ממדיים משוקללים של T1 או 3D T2. מסדרים את המוח מן הנורה חוש הריח למוח הקטן באמצעות עורך פילוח. 10
  3. בצקת ואזוגנית
    1. לעבד את הנתונים T2 relaxometry עם תוכנת MRI או להשתמש הליך ליניארי לפחות ריבועים להתאים. 11 תהליך דיפוזיה משוקלל נתונים כדי להשיג מפות ADC באמצעות MRI sofTware או FDT ארגז כלים (ראה טבלת חומרים ).
    2. מקום אזורים של עניין באופן ידני לתוך אזורים אנטומיים שונים.
      הערה: המיקום האוטומטי של תחומי עניין עשוי להירשם בצורה לא נכונה עקב נפיחות מוחית משמעותית. T2 פעמים וערכים ADC של האזורים האנטומיים שנבחרו מתקבלים בצורה זו.
  4. כדי לנתח את נפח microhemorrhage, להגדיר microhemorrhages, אשר מופיעים כמו ovoid, מוקדים כהים על T2 * dedasets משקל, באמצעות עורך פילוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ב C57BL / 6 עכברים, הסימפטומים הקליניים הראשונים של ECM ניתן לראות בין הימים 6 ו 10 לאחר ההדבקה עם P. ברגי ANKA sporozoites. ECM מפתחת 60-80% של עכברים נגועים במהירות התקדמות לתרדמת ומוות בתוך 24 עד 48 שעות. לעומת זאת, עכברים שאינם מפתחים ECM מתים לאחר השבוע השני לאחר ההדבקה מאנמיה קשה עקב היפרפרסיטמיה. 12

ב MRI הדמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול MRI של המוח כולו כדי לקבוע שינויים במלריה במוח ניסיוני. אנו מאמינים כי MRI כבר under-utilised במחקר מלריה עד כה ומקווים כי הפרוטוקולים שלנו יסייע לחוקרים אחרים. ברצוננו לתאר כמה נקודות נוספות שעשויות להיות מועילות.

אם צילמו עכברים חולים קשות, המיקום הוא חיוני. בשל לחץ תוך גולגולתי מוגבר, עכברים רגישים למוות, ולכן, עמוד השדרה הצוואר לא צריך להיות מתוח. הרדמה צריך להישמר עד למינימום. א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הסיוע הטכני המומחה של מרים רייניג מודה בהכרת תודה. אה קיבל מימון ממלגה פוסט-דוקטורלית של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת היידלברג. חבר פרלמנט נתמך על ידי מענק הנצחה של קרן Else-Kröner-Fresenius. AKM היא מקבלת קצבת חופשת לידה על ידי האקדמיה DZIF של המרכז הגרמני לחקר זיהום (DZIF). JP הוא הנמען של מרכז מחקר היידלברג עבור רפואה מולקולרית (HRCMM) אחוות פיתוח קריירה. בנוסף, אנו מודים בהכרת תודה לג'וליה מ. סאטלר ולפרידריך פרישקנכט על מתן סרט מופת לתנועה ספורוזואית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
IsofluraneBaxter1001747להרדמה
DotaremGuebert1086923חומר ניגוד Gd-DTPA; 0.5 mmol/mL
Amira (תוכנית עיבוד תמונה)FEI GroupVersion Amira 5.3.2
MATLAB ארגז הכלים של MathWorks, Inc.,שחרור 2012b
FDT ספריית התוכנה של FMRIBhttp://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fdt/index.html

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. World Health Organization. World Malaria Report. , (2014).
  2. Seydel, K. B., et al. Brain swelling and death in children with cerebral malaria. N Engl J Med. 372 (12), 1126-1137 (2015).
  3. Penet, M. F., et al. Imaging experimental cerebral malaria in vivo: significant role of ischemic brain edema. J Neurosci. 25 (32), 7352-7358 (2005).
  4. de Souza, J. B., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes Infect. 4 (3), 291-300 (2002).
  5. Curfs, J. H., van der Meide, P. H., Billiau, A., Meuwissen, J. H., Eling, W. M. Plasmodium berghei: recombinant interferon-gamma and the development of parasitemia and cerebral lesions in malaria-infected mice. Exp Parasitol. 77 (2), 212-223 (1993).
  6. Carroll, R. W., et al. A rapid murine coma and behavior scale for quantitative assessment of murine cerebral malaria. PLoS One. 5 (10), (2010).
  7. Hoffmann, A., et al. Experimental Cerebral Malaria Spreads along the Rostral Migratory Stream. PLoS Pathog. 12 (3), e1005470(2016).
  8. Mueller, A. K., Behrends, J., Blank, J., Schaible, U. E., Schneider, B. E. An experimental model to study tuberculosis-malaria coinfection upon natural transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei. J Vis Exp. (84), e50829(2014).
  9. Hynynen, K., McDannold, N., Sheikov, N. A., Jolesz, F. A., Vykhodtseva, N. Local and reversible blood-brain barrier disruption by noninvasive focused ultrasound at frequencies suitable for trans-skull sonications. Neuroimage. 24 (1), 12-20 (2005).
  10. Nag, N., Mellott, T. J., Berger-Sweeney, J. E. Effects of postnatal dietary choline supplementation on motor regional brain volume and growth factor expression in a mouse model of Rett syndrome. Brain Res. 1237, 101-109 (2008).
  11. Giri, S., et al. T2 quantification for improved detection of myocardial edema. J Cardiovasc Magn Reson. 11, 56(2009).
  12. Engwerda, C., Belnoue, E., Gruner, A. C., Renia, L. Experimental models of cerebral malaria. Curr Top Microbiol Immunol. 297, 103-143 (2005).
  13. Zhao, H., et al. Olfactory plays a key role in spatiotemporal pathogenesis of cerebral malaria. Cell Host Microbe. 15 (5), 551-563 (2014).
  14. Nacer, A., et al. Experimental cerebral malaria pathogenesis--hemodynamics at the blood brain barrier. PLoS Pathog. 10 (12), e1004528(2014).
  15. Nacer, A., et al. Neuroimmunological blood brain barrier opening in experimental cerebral malaria. PLoS Pathog. 8 (10), e1002982(2012).
  16. Pai, S., et al. Real-time imaging reveals the dynamics of leukocyte behaviour during experimental cerebral malaria pathogenesis. PLoS Pathog. 10 (7), e1004236(2014).
  17. Shaw, T. N., et al. Perivascular Arrest of CD8+ T Cells Is a Signature of Experimental Cerebral Malaria. PLoS Pathog. 11 (11), e1005210(2015).
  18. Potchen, M. J., et al. Acute brain MRI findings in 120 Malawian children with cerebral malaria: new insights into an ancient disease. AJNR Am J Neuroradiol. 33 (9), 1740-1746 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

T2Time Of FlightGd DTPA

מאמרים קשורים