Method Article

Multimer-עמוד: שיטה לכידת וחלבון פתרון מתחמי דגימות ביולוגיות

DOI:

10.3791/55341

⸱

May 5th, 2017

 ,  ,  , 
1Physiology, Michigan State University, 2Center for Neurodegenerative Science Van Andel Institute, 3Pharmaceutical Sciences, Wayne State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה לייצוב ומפריד קומפלקסי חלבוני ילידים מן lysate ללא שינוי הרקמות באמצעות אמין-reactive protein צולב מקשר מצמיד את ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide דו ממדי רומן (עמוד) מערכת מוצגת.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ישנן שיטות רבות מפותחות לטיהור ולומד חלבונים ופפטידים יחידים. עם זאת, רוב הפונקציות הסלולר מבוצעות על ידי רשתות של קומפלקסי חלבוני אינטראקציה, אשר לעתים קשה לחקור, כי הכבילה אינה ניתן קוולנטיים ומודאג בקלות על ידי טכניקות טיהור. עבודה זו מתארת ​​שיטה של ​​ייצוב ומפריד קומפלקסים חלבונים ילידי מרקמות ללא שינוי באמצעות ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide דו מימדי. lysate רקמות נטען על ג'ל polyacrylamide כחול שאינם ילידי-denaturing, אז זרם חשמלי מוחל עד חלבון נודד מרחק קצר לתוך הג'ל. רצועת ג'ל המכיל חלבון שמועבר הוא נכרת אז וטופחו עם אמין-reactive-הצלב המקשר dithiobis ריאגנט (propionate succinimidyl), אשר קוולנטית מייצב קומפלקסים חלבונים. רצועת ג'ל המכיל מתחמי צולבים אז הוא יצוק לתוך ג'ל polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן, ו tהוא מורכב הם מופרדים לחלוטין. השיטה נשענת על טכניקות וחומרים המוכרים לרוב הביולוגים המולקולריים, כלומר היא זולה וקלה ללמוד. אמנם היא מוגבלת ביכולת שלה להפריד בין מכלולים גדולים מאוד, ולא הצליחה באופן אוניברסלי, אבל השיטה היתה מסוגלת ללכוד מגוון רחב של קומפלקסים שנלמדו היטב, וישימה ככל הנראה למערכות רבות של עניין.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פונקציה סלולרית רגילה תלויה אינטראקציות חלבון-חלבון 1, 2. כתוצאה מכך, מחל אנושיות מסומנות לעתים קרובות על ידי הפרעות באסיפה וההתנהגות של קומפלקסי חלבונים שונים 3. היכולת לאפיין אינטראקציות כזה ולכן הוא קריטי. נוכחי אמצעי לגילוי אינטראקציות אלה דורשים טיהור של חלבונים היעד, לעתים קרובות ואחריו הנפתח של השותפים באינטראקציה שלהם. טיהור קונבנציונלית מושג על ידי צנטריפוגה הפרש, משקעים, ו / או כרומטוגרפיה 4. שיטות אלה הן זמן רב, יש לשנותו לכל חלבון מטרה, ולעתים קרובות לגרום תשואות נמוכות. שיטות לטיהור מודרניות לערב את ההית....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. רקמות הכנה

  1. הכן 10 מ"ל של 4x חיץ מדגם BN-עמוד (200 מ"מ Bis (2-hydroxyethyl) אמינו-טריס (hydroxymethyl) מתאן (BIS-טריס), 200 מ"מ NaCl, 40% w / גליצרול נ, 0.004% Ponceau S, pH 7.2 ).
    הערה: פתרון מניות זה עשוי להתבצע מראש ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. לדלל 250 μL של חיץ מדגם 4x ב 750 μL DH 2 O המכילים מעכבי פרוטאז קוקטייל מסחרי 1x. וורטקס ומקררים על קרח.
  3. Homogenize 20 מ"ג של רקמת היעד מ"ל 1x 1 קרים כקרח חיץ מדגם BN-עמוד עם 30 מש....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בניסוי זה הפגנה, multimer-PAGE בוצע על lysate מוח שלם חולדה. החלבונים שהופרדו כתוצאה מכך היו מסוממים על ממברנות polyvinylidene diflouride (PVDF), ולאחר מכן לחקור עם נוגדנים נגד חלבונים הידועים כדי ליצור קומפלקסים. איור 1 מציג אימות של הפרוטוקול בשני אמצעים. ראשית, אנו מדגימים כי חלבונים צולבים הם מחוספס על ידי תוספת של סוכן הפחתת, כלומר גבוה יותר משקל המולקולרי משקל מיוצרים נוצרות על ידי מגיב חוצה מקשר, ולא בשל כל רכיב אחר של הפרוט.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אינטראקציות חלבון-חלבון חשובות עבור כל משימת חי דברים לפועל. מסיבה זו, הם מושא לביקורת ומחקר אינטנסיבי. Multimer-עמוד הוא שיטה חדשנית עבור לכידה, מפריד, וניתוח מגוון רחב של קומפלקסי חלבונים. הוכחנו ישימותה בעבר לומד oligimerization של 11-synuclein α חלבון הקשורים למחלות. עם זאת, היא ניתנת להרחבה ל קומפלקסי חלבונים רבים, כפי שמודגם באיור 2. בהשוואה לשיטות אחרות של לימוד קומפלקסי חלבונים,-עמוד multimer הוא יתרון בגלל הפשטות הקוצרת שלה. שעת ממ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בתמיכת DA034783 NIH / NIDA. אנו מודים בריאן א קילינגר לקבלת סיוע טכני עם-עמוד multimer.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<חזק>כימיקלים
&אפסילון;-חומצה אמינוקפרואיתסיגמאA2504
אקרילאמידאקרוס אורגני164855000רעילה.
אקרילאמיד/ביסקרילאמיד 37.5:1 (תמיסת מלאי 40%T)BioRad161-0148רעיל.
אמוניום פרסולפטסיגמאA3678
אנטי ארנב IgG-HRP מעיזסנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-2004
ערכת בדיקת חומצה ביסינצ'וניניתThermofisher23225
Bis-trisSigmaB9754
אלבומין סרום בקרסיגמאA9647
בוטנולפישר מדעיA399-1
ערכת מצע כימילומינסנציהThermoFisher24078
Coomassie כחול G-250סיגמא-אולדריץ'B0770
DigitoninSigmaD141רעיל.
דימתיל סולפוקסידפישר סיינטיפיקD128-1
דיתיוביס (succinimidylpropionate)Thermo Scientific22585
חלב יבש ללא שומןLabScientificM0841
גליצרולסיגמאG9012
גליציןפישר ScientificBP381-5
קוקטיילמעכב פרוטאז להפסיקThermofisher78430
חומצה הידרוכלוריתFisher ScientificA144SI-212לטיטרציה. קאוסטי.
מתנולפישר סיינטיפיקA412-4להפעלת ממברנת PVDF. רעיל.
מונוקלונלי אנטי &אלפא;-סינוקלאין IgG מארנבסנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-7011-R
N,N,N',N'-tetramethylethylenediamineSigmaT9281
N,N'-methylenebisacrylamideAcros Organics16479רעיל.
NP40Boston BioproductsP-872
פוליסורבט 20 (tween-20)Fisher ScientificBP337-500
ממברנות העברת פלואוריד פוליווינילידןThermo Scientific88518
Ponceau SSigmaP3504
אשלגן כלוריFisher ScientificP217-3
אשלגן פוספט monobasicSigmaP9791
קוקטייל מעכב פרוטאזThermo Scientific88265
תמיסת SDS (10% w/v)BioRad161-0416
נתרן כלוריפישר סיינטיפיקBP358-212
נתרן דודציל סולפטסיגמאL37771
נתרן פוספט מונו-בסיסיפישר סיינטיפיקBP329-1
TricineSigmaT0377
Tris baseFisher ScientificBP152-500
Tris-HCl (מאגר 0.5 M, pH 6.8)BioRad161-0799
Tris-HCl (מאגר 1.5 M, pH 8.8)BioRad161-0798
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק> מספר קטלוגיComments
Instruments
GE Imagequant LAS 4000GE Healthcare28-9558-10
תוכנתImageJ NIH
Synergy H1 קורא מיקרו-פלטותBioTek
Gel Former + StandBiorad
מיקרופוגה 22R צנטריפוגהבקמן קולטר
2 מ"ל הומוגנייזר
מערבל מערבולתפישר סיינטיפיק
הומוגנייזר רקמות אולטרסאונדפישר סיינטיפיקFB120220
dounce

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
  2. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes Dev

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein Complex AnalysisNative PAGEIn gel Cross linkingSDS PAGE SeparationBlue Native GelGel Re castingDSP Cross linkerTissue Lysate PreparationImmunoblot DetectionMolecular Weight Ladder

Related Articles