מאמר שיטה

השימוש של התניה קלאסית Eyeblink מעקב כדי להעריך תפקוד בהיפוקמפוס במודל של עכברים של אלכוהול עוברית ספקטרום הפרעות

9.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55350

⸱

5 באוגוסט 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychology, East Carolina University, 2Multidisciplinary Studies Program in Neuroscience, East Carolina University

במאמר זה

סיכום

מעקב eyeblink התניה קלאסית (ECC) נעשה שימוש כדי להעריך בהיפוקמפוס תלויי למידה associative בחולדות למבוגרים שהיו מנוהל ריכוז גבוה (11.9% v/v) של אלכוהול במהלך התפתחות המוח neonatal מוקדמת. באופן כללי, ECC שגרות הן כלי אבחון קול לגילוי חוסר תפקוד המוח על-פני הגדרות רבות הביו-רפואית ופסיכולוגית.

תקציר

חולדות neonatal נוהלו ריכוז גבוה יחסית של ספירט אתיל (11.9% v/v) כמחנכת בימים 4-9, זמן עובר שינוי ארגוני מהירה ומתי דומה למוח העובר מואצת שינויים במוח המתרחשים במהלך השליש השלישי בבני אדם. מודל זה של הפרעות הספקטרום אלכוהול עוברית (FASDs) מייצרת נזק מוחי חמור, מחקה את הכמות ואת התבנית של שתייה מרובה המתרחשת בכמה אלכוהוליסטיות בהריון. אנו מתארים את השימוש התניה קלאסית eyeblink מעקב (ECC), משתנה מיומנויות של למידה associative, כדי להעריך את תפקוד בהיפוקמפוס לטווח ארוך זה נתפסת בדרך כלל בצאצאים למבוגרים החשופים אלכוהול. ב 90 ימים של גיל, מכרסמים התכוננו בניתוח עם הקלטת, אלקטרודות מגרה, אשר נמדד electromyographic (EMG) למצמץ פעילות של שריר העפעף השמאלי ומסר מתון זעזועים אחורי לעין שמאל, בהתאמה. לאחר תקופת ההחלמה של חמישה ימים, הם עברו שישה מפגשים של מעקב ECC כדי לקבוע associative learning. ההבדלים בין אלכוהול חשופים ולשלוט חולדות. מעקב ECC הוא אחד אפשרי ECC הליכים רבים שניתן בקלות לשנות באמצעות ציוד באותה התוכנה, כך יכול להיות מוערך מערכות עצביות שונות. ECC הליכים באופן כללי, יכול לשמש כלי אבחון לגילוי פתולוגיות עצבית מערכות שונות במוח והתנאים שונים, זה להעליב את המוח.

מבוא

קשה לדמיין כי בעידן הנוכחי, עם שירותי בריאות טובים יותר וגישה לשירותי רפואה, עישון ושימוש מופרז באלכוהול נותרים דאגה בריאותית גלובלית מרכזית. למרבה הצער, הוכח כי אם בהריון הצורכת כמות גבוהה של אלכוהול עלולה להוליד ילד עם נזק מוחי חמור והפרעות התפתחותיות-עצביות הנמשכות לאורך כל החיים, כפי שניכר אצל הסובלים מתסמונת אלכוהול עוברית (FAS)1,2,3. בנשים עם היסטוריה מאומתת של שימוש באלכוהול במהלך ההיריון, העובר המתפתח רגיש גם לכמויות קטנות של אלכוהול או לדפוסי צריכה שונים הגורמים להבדלים משתנים בריכוז האלכוהול בדם. במקרה האחרון, למרות שהילדים עשויים שלא להפגין את השיבושים המורפולוגיים או הנוירו-התנהגותיים החמורים המאפיינים את FAS, הם עדיין עלולים לסבול ממוגבלויות קוגניטיביות ומהפרעות רגשיות לכל החיים, הנעות בין קלות לחמורות3,4. יחד, FAS וצורות פחות חמורות של שיבושים תת-עובריים המגוריםים על ידי אלכוהול מהוות מקבץ של הפרעות ספקטרום אלכוהול עוברי (FASDs). אין זה מפתיע שניתן למנוע לחלוטין את ה-FASDs, אך באופן מדהים, הערכות מראות כי באוכלוסיות שבהן שימוש מופרז באלכוהול הוא נפוץ למדי, הן נותרות הגורם הבלתי-גנטי העיקרי למוגבלות עצבית וקוגניטיבית, ומשפיעות על כ-2% עד 5% מהילדים הצעירים בארה"ב ובמדינות אירופיות כגון צרפת ושבדיה. בנוגע לשכיחות של FAS לבדה בארה"ב, השכיחות היא 2 עד 7 ל-1,000 לידות חיות5, מה שמרמז כי השכיחות הכוללת של FASDs גבוהה בהרבה מזו של FAS.

מחקרי דימות מוחי שנערכו בילדים עם FASDs הראו כי הם מציגים anomalias במוח, כגון corpus callosum דק יותר6, anterior cerebellar vermis קטן יותר7, והיפוקמפוס קטן יותר8. anomalias מוחיות אלו עומדות בבסיס חלק מהשיבושים הנוירו-קוגניטיביים ארוכי הטווח שנצפו בילדים עם FASDs. הקשרים המדויקים הקושרים בין וריאציות בשינויים מוחיים הנגרמים על ידי צריכת אלכוהול של האם לבין וריאציות בפרופיל (כלומר, סוג והיקף) של ליקויים נוירו-קוגניטיביים ספציפיים טרם נקבעו באופן ברור. אך כנקודת התחלה, ההיפוקמפוס הוא מועמד מצוין לקביעת הרגישות שלו להשפעות פרה-נטליות של אלכוהול. ואכן, ילדים עם FASDs מראים גירעונות בהתנהגויות המתווכות על ידי ההיפוקמפוס, כגון למידת מקום (place learning)9,10 וד Recall מושהה של אובייקטים11.

מודלים של מכרסמים להפרעות הספקטרום של סינדרום אלכוהול עוברי (FASDs) התגלו כבעלי ערך רב בבירור המנגנוים המובילים לשיבושים נוירו-קוגניטיביים הנצפים בילדים עם FASDs. מודל חשיפה מרוכזת (binge-exposure) מבוסס שאימצנו כולל מתן אלכוהול לחולדות במהלך הימים הפוסט-נטליים 4-9.12,13, תקופה שבה המוח עובר יצירה מהירה של סינפסות ומגעים דנדריטיים, באופן הדומה לשבוע 24 בעובר אנושי ונמשכת אל תוך ה-3rd שליש הריון14,15,16,17מודל ספציפי זה גורם לאובדן משמעותי של נוירונים בהיפוקמפוס18,19 ונוירונים באזורי מוח רבים אחרים, כגון המוחיסור (cerebellum)12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23, בליווי ליקויים חמורים בתפקודים קוגניטיביים המקיפים תחומים שונים21,24,25ניתן להעריך שיבוש קוגניטיבי כתוצאה מחשיפה מוקדמת לאלכוהול בחולדות בדרכים שונות, ובמיוחד באמצעות התניה קלאסית של ממצמץ העין (ECC). ECC היא פרדיגמה שבה נעשה שימוש במשך למעלה ממאה שנה כדי לחקור באופן מדעי את הבסיס היסודי של הלמידה26,27 וכך, היא מספקת שיטה יעילה להבנה טובה יותר של ההשלכות הנוירו-קוגניטיביות השליליות הנובעות מחשיפה של העובר לאלכוהול. זוהי פרדיגמה גמישה מאוד המאפשרת לחוקרים להשתמש במגוון פרוצדורות ECC שונות, שכל אחת מהן ניתנת לבחינה במגוון מיני יונקים לאורך הסולם הפילוגנטי (מעכברים ובני אדם) ובשלבים שונים של התפתחות המוח.28,29,30,31יתרה מכך, המעגלים העצביים הבסיסיים המתווכים למידה אסוציאטיבית בפרדיגמה זו נתמכים על ידי דיווחים ניסויים ונוירופסיכולוגיים באותם מינים.26,32,33,34,35,36,37.

סוג אחד של ECC, ה-trace ECC, מוצג במאמר זה (איור 1). כדי לספק הקשר, הוא מושווה לצורה המסורתית יותר - delay ECC. פרדיגמת ה-ECC מודלה על פי התניה קלאסית באמצעות כלבים, שנערכה לראשונה על ידי הפיזיולוג זוכה פרס נובל, איבן פבלוב. פבלוב גילה כי גירויים מסוימים, כגון צלילים, אינם מעוררים באופן טבעי הפרשת רוק, אך כאשר הם מקדימים את הגשת המזון וחופפים לה, ניתן לחזק את תגובת ההפרשה באמצעות הצגות חוזרות של השניים, בתנאי ששומרים על תלות זו בין הצליל למזון. זוהי דוגמה ל-delay ECC, מתוך התפיסה שעוצמה אסוציאטיבית מתווכת על ידי סמיכות זמנית מיידית בין שני הגירויים, ובכך הופכים את תנאי הלמידה לאופטימליים עבור בעל החיים. הוא בחן גם וריאציות אחרות של התלות בין הצליל למזון, כגון כיבוי הצליל והשארת תקופת "עקבה" (trace) לפני הגשת המזון. כאשר שני גירויים אלו היו לא סמיכים מספיק, הפך הדבר לקשה הרבה יותר עבור הכלבים להפיק תגובות של הפרשת רוק לפני הגשת המזון. חוסר הסמיכות בין כיבוי הצליל להגשת המזון הוא אם כן דוגמה ל-trace ECC. מכיוון שמכרסמים אינם מפרישים רוק באופן טבעי לנוכחות של מזון, נעשה שימוש בגירויים רלוונטיים יותר למין, כגון שוק חשמלי קל; הם גם אינם מפיקים באופן טבעי תגובות הגנה של מיצמץ עיניים לצלילים. על רקע זה, נהלי ECC במכרסמים כוללים הצגת צליל ברמת דציבל נתונה וצימוד שלו באופן מסוים עם שוק קל לשריר העפעף (orbicularis oculi) או לשריר ה-temporalis כדי לעורר תגובת מיצמץ. הצליל נחשב כגירוי מותנה (CS) בעוד שהשוק נחשב כגירוי לא מותנה (US). ב-delay ECC, ה-CS מוצג תחילה; גירוי זה נשאר פעיל למשך משך זמן נתון. לאחר מכן, מוענק ה-US. שני גירויים אלו חופפים למשך זמן נתון, ולאחר מכן שניהם מסתיימים בו-זמנית; תגובת המיצמץ הנובעת מה-US נחשבת כתגובה לא מותנה (UR). בהליך זה, מכרסמים לומדים להפיק תגובות מיצמץ זמן מה לאחר הצגת ה-CS, אך ממש לפני ה-US, כדי לצפות גירוי דוחה זה. תגובת המיצמץ הנלמדת נקראת תגובה מותנית (CR). עבור trace ECC, ה-CS וה-US מופרדים על ידי פרק זמן נטול גירויים הידוע כרווח עקבה (trace); הם אינם חופפים בזמן כפי שקורה ב-delay ECC. במהלך רווח זה, בעל החיים נדרש לפתור את הדרישות האסוציאטיביות בין הגירויים. בדומה ל-delay ECC, למידה מתרחשת כאשר בעל החיים מפיק בעקביות תגובת מיצמץ לאחר כיבוי ה-CS, אך מיד לפני הגשת ה-US. לאורך כמות מסוימת של אימון רכישה (CS מצומד ל-US), מתפתחות עקומות למידה (כלומר, על בסיס מדידות CR שונות). מחקרי נגעים והדמיה עצבית מראים כי למידה מוצלחת ב-delay ECC תלויה במעגלים עצביים תקינים בין המוחון לגזע המוח38,39,40, בעוד ש-trace ECC הוא הליך מסדר גבוה יותר הדורש מעורבות עצבית נוספת מההיפוקמפוס41,42,43,44 וממבנים קורטיקליים אחרים45,46. בשל הדרישות הקשורות לתזמון הנחוצות כדי לרכוש trace CRs בהצלחה, משימה זו היא גם קשה יותר ללמידה (אפילו עבור נבדקים נורמליים).

figure-introduction-1
איור 1: התנייה קלאסית של מצמוץ עיניים. מוצגת צורת גל ממיתית המייצגת חולדה בוגרת מקבוצת הביקורת ללא אינטובציה (UC). תחילה מוצג גירוי קולי מותנה (CS; עוצמה של 85 dB, תדר של 2.8 kHz) למשך 380 מילי-שניות. לאחר מכן חולף מרווח מעקב (trace interval) של 500 מילי-שניות, שבו לא מוצגים גירויים. לאחר מכן מוענק גירוי בלתי מותנה של הלם חשמלי (US; עוצמה של 1.6 mA) למשך 100 מילי-שניות. למידה מוצלחת במטלה זו מתרחשת כאשר התדירות (%) או האמפליטודה (בוולטים) של מצמוצי עיניים במהלך חלון הזמן של התגובה המותנית (CR) (תקופת ה-CR הכוללת) עולות לאורך מפגשי אימון רבים. בפרט, מכרסמים עם היפוקמפוס תקין יפיקו בדרך כלל יותר תגובות CR מתואמות בזמן (Adaptive CRs) רגע לפני תחילת ה-US של ההלם (בחלון זמן של 200 מילי-שניות). נמדדות גם תגובות בהלה (SRs) במהלך 80 המילי-שניות הראשונות לאחר תחילת ה-CS הקולי, ותגובות בלתי מותנות (URs). תגובות SR לא-אסוציאטיביות הן בדרך כלל נמוכות או אינן קיימות במכרסמים שעברו אימון טוב, בעוד שתגובות UR צפויות להיות גבוהות בתדירותן ובאמפליטודתן. מטלה זו דורשת מהמכרסם ללמוד לגשר על האסוציאציה בין סיום ה-CS לתחילת ה-US (במהלך מרווח המעקב), ולכן היא קשה יותר לרכישה מטבעה בהשוואה ל-ECC מסוג עיכוב (delay ECC). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של איור זה.

כאן אנו מדגימים את ההשלכות התפקודיות השליליות של חשיפה לאלכוהול בתקופה הניאונטלית שניתנה באופן דמוי-בינג' (binge-like), כפי שנמדדו באמצעות הליך trace ECC המעניק גירוי מותנה (CS) של צליל בעוצמה של 85 dB (בתדר 2.8 kHz) שנמשך 380 ms, ולאחריו גירוי לא מותנה (US) של שוק חשמלי בעוצמה של 1.6 mA שנמשך 100 ms, כאשר גירויים אלה מופרדים על ידי תקופת מעקב (trace period) של 500 ms. דיווחנו על התועלת של בדיקה התנהגותית זו במחקרים קודמים שבחנו התערבות באמצעות כולין ותוספי ברזל להפחתת ההשפעות של חשיפה לאלכוהול בתקופה הניאונטלית18,47. למעשה, ניתן להשתמש ב-trace ECC ככלי אבחנתי להערכת פתולוגיה של ההיפוקמפוס המושרית על ידי אלכוהול בתקופה הניאונטלית. היתרון שלו על פני delay ECC הוא רגישות גבוהה יותר לגילוי הפרעות בתפקוד ההיפוקמפוס, הפגוע בבני אדם עם FASDs.

הדגמה של ECC חורגת הרבה מעבר לתחום של אלכוהול עוברי. ניתן להשתמש בווריאנטים רבים של ECC (למשל, עיכוב, עקיבה, תרכוב, היפוך) כדי להשקיף על הבדלים אונטוגנטיים בלמידה לאורך ההתפתחות, הבסיס הנוירוביולוגי של למידה אסוציאטיבית ביונקים תקינים, וכן את הפגיעות של מערכות מוחיות שונות לאתגרים רבים, כולל (אך לא רק) טרטוגנים, רעלים סביבתיים, פגיעות מוח טראומטיות, מחלות נוירודגנרטיביות ומצבים פסיכיאטריים.

פרוטוקול

הערה: כל ההליכים אושרו ובוצעו בהתאם למדיניות שנקבעה על ידי ה-IACUC של East Carolina University. חולקי Long-Evans הופקו מנקבות שהורשבו עם זכרים פוריים. גורים מכל שלוש קבוצות הטיפול (ראו 1.1) הופקו מאותו שגר של אותה אם. הופקו חמישה שגרים, וכל שגר דלל ל-8 גורים ביום לאחר הלידה (PD) 3. שני הגורים שנותרו מכל שגר הוקצו לניסויים נפרדים. צאצאים זכרים ונקבות כאחד (אחד לכל קבוצת חשיפה) נכללו במחקר. בסך הכל נבחנו N = 27 צאצאים בוגרים במחקר זה; 3 חולקים הוצאו מהמחקר עקב קריעה של מובילי חוטי 3T (ראו 3.1.1) שלא ניתן היה לתקן ביום 1 של אימון ה-ECC.

1. הכנת הקבוצות, החומרים והתמיסות

  1. ביום PD 3, הוציאו את הגורים מהאם והניחו אותם על פד חימום במים עם ויסות תרמי כדי לשמור על חום גופם. השתמשו בהליך בחירה אקראי כדי לחלק את גורי החולדה לאחת משלוש קבוצות: (1) אינטובציה של אלכוהול (AI); (2) ביקורת אינטובציה דמיה (SI); או (3) ביקורת ללא אינטובציה (UC). בצעו הליכי זיהוי מאושרים, כגון קעקוע דיו [לא רעיל] בכפות הרגליים באמצעות מחט 30G x 1/2 in לפי סכימת מספור. החזירו את הגורים לאם עם סיום הקעקוע.
  2. הכינו צינור או צינורות לאינטובציה תוך-קיבית באמצעות פוליאתילן (PE) בגדלים 50 ו-10. האורך הכולל של צינור זה תלוי במשתמש וניתן להתאימו בהתאם.
    1. השתמשו במספרי מיקרו-דיסקציה כדי לחתוך פיסה של 3 in של צינור PE-50 ופיסה של 6 in של צינור PE-10.
    2. חברו בזהירות את צינור ה-PE-50 למחט היפודרמית סטרילית 22 G x 1 in.
    3. הכניסו קצה אחד של צינור ה-PE-10 אל תוך הקצה הפתוח של צינור ה-PE-50. ייתכן שיהיה צורך בחיתוך אלכסוני בקצה צינור ה-PE-10 כדי להכווינו לתוך צינור ה-PE-50.
    4. חתכו פיסה קטנה של צינור PE-50 (כ-2-3 mm) והכניסו אותה לקצה הפתוח של צינור ה-PE-10. פיסה זו תשמש כסטופר ויזואלי.
    5. אחסנו את צינור האינטובציה התוך-קיבית המלא באלכוהול איזופרופיל 70% טרי כדי לשמור עליו סטרילי.
  3. בצעו הליכים אספטיים להכנת תמיסת חלב מלאי בבקבוקי 50 mL. תמיסת החלב המלאית מבוססת על פורמולת תזונה שנקבעה לראשונה על ידי West et al. (1984)48. אחסנו את הבקבוקים בטמפרטורה של -18 °C עד למועד השימוש. הפשיתו שני בקבוקי חלב באמצעות מים חמים לפני השימוש.
    1. שאבו 7.16 mL של אתיל אלכוהול 95% (USP) באמצעות מזרק סטרילי והוסיפו אותו לבקבוק חלב אחד של 50 mL. פעולה זו יוצרת תמיסת אלכוהול בריכוז 11.9% v/v המועברת לגורי החולדה במהלך שתי ההאכלות הראשונות של היום (ראו 2.1.1); מינון האלכוהול היומי הכולל הוא 5.25 g/kg/day. התמיסה תוכננה להעברת האלכוהול בנפח (0.0278 mL/g לכל האכלה) בתמיסת חלב מועשרת.
      הערה: ניתן להתאים כמות זו בהתאם לגודל השגר ולשימוש הצפוי לאורך 3-4 ימים. יש להתאים גם את כמות האלכוהול המתווספת כדי ליצור תמיסה של 11.9% v/v.
    2. נערה בקבוק זה היטב וסמנו אותו בהתאם (כלומר, 11.9% v/v Ethyl Alcohol in Milk).
    3. סמנו את בקבוק החלב השני (ללא תוספת אלכוהול) בהתאם (למשל, Milk-Only) והשתמשו בו להאכלות משלימות כפי שצוין ב-2.1.1.
    4. אחסנו את שני בקבוקי החלב במקרר.

2. חשיפה לאלכוהול בגיל הרך (ימים פוסט-נטליים 4-9)

  1. בצעו לגורי ה-AI וה-SI סך של 4 אינטובציות ליום, החל מ-PD 4. הפרידו בין כל אינטובציה במרווח של 2 h. מכיוון שגורי ה-AI מקבלים אינטובציה עם תמיסה ממשית, כל אחת מהאינטובציות שלהם נחשבת להאכלה.
    1. בצעו אינטובציה לגורי ה-AI עם תמיסת 11.9% v/v Ethyl Alcohol בחלב במהלך שתי ההאכלות הראשונות של היום, ולאחר מכן בצעו להם אינטובציה עם תמיסת חלב בלבד במהלך שתי ההאכלות האחרונות של היום כדי להשלים את צמיחתם.
    2. בצעו אינטובציה לגורי ה-SI 4 פעמים ללא תמיסה, מדי שעתיים, כדי להבטיח את אותו משך חשיפה לצינור PE-10 שחווים גורי ה-AI. קבוצת ה-UC אינה מקבלת אינטובציות.
  2. הוציאו את הגורים מהאם והניחו אותם על פד חימום במים בויסות תרמי כדי לשמור על חומם. שקלו כל גור ורשמו את משקל גופו (ב-g). עיינו בטבלת האכלה מוכנה מראש כדי לקבוע את נפח האינטובציה עבור כל גור AI ורשמו זאת בגיליון הרישום.
    1. הניחו את תמיסת ה-11.9% v/v Ethyl Alcohol בחלב באמבט מים חמים ונערה אותה היטב.
    2. הליך אינטובציה תוך-קיבבית (Intragastric):
      1. שטפו היטב במים חמים את צינור האינטובציה התוך-קיבבית שאוחסן ב-70% isopropyl alcohol.
      2. שאבו את כמות התמיסה הנכונה באמצעות מזרק סטרילי של 1 mL.
      3. טבלו את קצה צינור האינטובציה (קצה ה-PE-10) בשמן תירס טרי (דבר זה מקל על ההחדרה).
      4. מדדו את אורך צינור ה-PE-10 מפיו של הגור ועד קיבתו. כווננו את מעצורי ה-PE-50 כדי שישמשו כסימון לנקודת העצירה.
      5. החדירו בזהירות את צינור ה-PE-10 לתוך פיו של הגור, המשיכו במורד הוושט, חלפו מעט דרך הספינקטר הגסטרו-אסופגאלי, והגיעו אל קיבתו. בדקו את הגור, ייצבו אותו, ולחצו על בוכנת המזרק כדי להעביר את התמיסה. בצעו זאת בקצב איטי.
        הערה: כדי למנוע החדרה מקרית של הצינור לקנה הנשימה, כוונו תחילה את הצינור כך שיתעקל ויבוא במגע עם החיך הרך לפני ההמשך קדימה. השתמשו בחיך כמדריך, שכן הצינור יסטה באופן טבעי מאזור זה ויונח במורד הוושט. אחרת, כל סטייה משמעותית של הקצה לכיוון הגב (ventrally) עלולה לגרום לכניסתו לקנה הנשימה. עדיף להוציא את הצינור ולא להמשיך באינטובציה אם אינכם בטוחים במיקום הכניסה - החדירו את הצינור מחדש בצורה נכונה בניסיון הבא.
      6. הוציאו בזהירות את צינור ה-PE-10 ובדקו את הגור לאיתור זליגה של תמיסה, דם או פגיעה פיזית. החזירו את הגור למשכורתו אם מצבו תקין. כל הליך האינטובציה אורך פחות מ-1 min לכל גור ובסך הכל כ-4 min עבור 4 הגורים שעברו אינטובציה בכל שגר (2 AI, 2 SI).
      7. הליך אינטובציה תוך-קיבבית לגורי SI: בצעו את אותו הליך החדרת PE-10 כפי שבוצע לגורי AI, אך ללא תמיסה, למשך זמן זהה (1 min).
      8. החזירו את כל הגורים לאם מיד לאחר השלמת הפעולות לגור האחרון בשגר. החזירו את האם לביבאריום עד למפגש ההאכלה הבא (בעוד 2 h).
      9. שטפו את צינור האינטובציה התוך-קיבבית במים סטריליים חמימים והחזירו אותו ל-70% isopropyl alcohol לאחסון. שטפו את הצינור היטב במים לפני כל מפגש האכלה.
      10. חזרו על שלבים 2.2 (למעט שקילת הגורים) עד 2.2.2.9 עבור מפגש ההאכלה השני. בשתי ההאכלות האחרונות, בצעו אינטובציה לגורי ה-AI עם תמיסת חלב בלבד, תוך שימוש בנפחי האינטובציה שנקבעו בשלב 2.2.
  3. שקלו את החולדות במרווחי זמן קבועים, כגון ב-PD 15 (כאשר העיניים נפתחות), PD 21 (גמילה), PD 30, PD 60, ו-PD 90 (ניתוח), כדי לקבל עקומות גדילה מייצגות.

3. ייצור ושינוי של אלקטרודות

  1. הכינו "ראש-מבצע" (headstage) אלקטרומיוגרפי (EMG) עבור כל חולדה (איור 2). ראש-המבצע מאפשר הקלטה של תגובות מצמוץ באמצעות מערכת המצמוץ (איור 4).
    1. בנו ראש-מבצע המורכב משני חוטים של פלדה אל-חלודה מצופה פוליטטרהפלואורואתילן (PTFE) בגודל 3T (כל אחד באורך 5 cm), חוט אחד של פלדה אל-חלודה מצופה PTFE בגודל 10T (באורך 5 cm), שלושה פיני מגע זכריים, ומבודד שקע רצועתי מיקרו שנקטע ל-3 חורים (ראו 3.1.4).
    2. הסירו את ציפוי ה-PTFE מחוט ה-10T על ידי תפיסת המרכז עם פינצטה משוננת בדיוק גבוה והסרת הציפוי לשני הכיוונים באמצעות פינצטה חלקה בדיוק גבוה. ודאו שכל עקבות הציפוי הוסרו מחוט זה.
      1. הדקו (Crimp) קצה אחד של חוט ה-10T לפין מגע באמצעות פלייר דנטלי בעל פלטפורמה משוננת; חוט זה ישמש כחוט הארקה. החזיקו חוט 3T בזהירות עם פינצטה חלקה בדיוק גבוה במרחק של 1 עד 1.5 mm מקצה אחד. הסירו את ציפוי ה-PTFE באורך 1 עד 1.5 mm תוך השארת שאר הציפוי שלם. הדקו פין מגע לקצה החשוף של חוט ה-3T.
      2. בצעו את אותם הפעולות עבור חוט ה-3T השני. שני החוטים ישמשו כמובילים החיובי והשלילי של אלקטרודות הקלטת ה-EMG.
    3. בצעו בדיקות מתיחה לכל החוטים כדי לוודא שהם מקובעים לפינים. היזהרו לא לכופף או להשחית את החוטים.
    4. חתכו מקטע של רצועת מבודד שקע ל-3.5 חורים (חתכו את מרכז החור הרביעי) באמצעות להב החיתוך של מקלף חוטים. צמצמו מקטע זה ל-3 חורים מלאים בלבד ושייפו את שני הצדדים במידת הצורך. דבר זה מסייע להבטיח ש-3 חורים מלאים זמינים. הכניסו את יחידות הפין-חוט לשלושת החורים של רצועת המיקרו עד שהקצוות המהדקים יהיו בקו אחד עם הקצה התחתון של מקטע המבודד. על מכלול ה-10T להיות באחד החורים החיצוניים של רצועת המיקרו ולא במרכז.
  2. התאימו אלקטרודות גירוי בי-פולריות (איור 2).
    1. ספקו לכל חולדה אלקטרודה אחת לגירוי בי-פולרי. אלקטרודה זו מעבירה כמות קטנה של זרם חשמלי באמצעות מבודד גירוי (ראו מערכת מצמוץ) כגירוי לא מותנה (US) של שוק במהלך ECC. האלקטרודות נרכשות מיצרן בצורה מלופפת והן ממוגנות.
    2. פתלו את שני המוליכים המתכתיים 2-3 פעמים כדי ליצור צורת V (מרווח של 5 mm) ולאחר מכן השתמשו בפינצטה חלקה בדיוק גבוה כדי ליישר כל "שיני" ככל האפשר. גרדו 1 mm מהמיגון מקצה כל שין (מסביב) באמצעות להב תער. בדקו כל שין לאי-סדירויות וכיפופים, ותקנו במידת הצורך ללא גרידה של מיגון נוסף.
  3. הסירו שמני ייצור ולכלוך זר מראשי-המבצע של ה-EMG ומהאלקטרודות הבי-פולריות על ידי שטיפתם באתנול 95%. הניחו להם להתייבש ולאחר מכן עקרו אותם באוטוקלאב.

figure-protocol-1
איור 2: אלקטרודות להקלטה אלקטרומיוגרפית (EMG) ואלקטרודה ביפולרית. שלב ההגברה המקדים (headstage) המוגמר של ה-EMG (מימין, כתום) בנוי משלושה פיני מגע זכרים, שני חוטים מצופים PTFE בגודל 3T, חוט אחד מצופה PTFE בגודל 10T, ופס מיקרו (micro strip) שעבר התאמה. שלושת החוטים הם באורך של כ-5 cm כל אחד ומהודקים לפיני המגע. האלקטרודה הביפולרית המוגמרת (מימין, לבן) פושרה, יושרה מחדש ועוצבה לצורת V (מרווח של 5 mm). הסיכוך הוסר מקצותיהם של שני הפינים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

4. פרוצדורה לניתוח עפעפיים (יום 90 לאחר הלידה)

  1. הכנת חומרים (ראו את סעיף החומרים למידע מפורט על האספקה), בעלי חיים, ואזורים כירורגיים ולא-כירורגיים:
    1. עיקור מכשירים ואספקה כירורגיים באוטוקלאב - המספר בסוגריים ( ) מציין בקירוב את הכמות הדרושה לכל חולדה בוגרת או למדידה: מכשירים כירורגיים (סט אחד ל-4 חולדות, כפי שאושר על ידי ה-ECU IACUC), רפידות גזה (3-4), מקלוני צמר גפן (5-6), עטיפה של 20 x 20 (4 לכל סשן ניתוח), כורח פורצלן (1), מיקרו-ספטולה מפלדת אל חלד (1), תמיסת סליין 0.9% (בקבוק שטיפה אחד), צלחת פטרי (1), וברגים מפלדת אל חלד 0-80 (3 לחולדה).
    2. אספקה סטרילית נוספת דרושה: להב ניתוחי גודל 10 (1 ל-4 חולדות), סדין ניתוחי (1 לחולדה), משחה אופתלמולוגית וטרינרית, פובידון-יוד (בקבוק שטיפה אחד), מחט היפודרמית 26G x 3/8" (2), מלחציים למחטים מצופים בניקל עם מקדח #55, מברג שעונים בעל ראש שטוח מצופה בניקל (להב 1.8-2 מ"מ).
    3. הכינו אזור אחסון סטרילי לכל הכלים והאספקה הכירורגיים באמצעות חומר חיטוי מאושר בדרגה מחקרית/רפואית. הניחו את החומרים במרחב זה כאשר האזור מוכן.
    4. הכינו מרחב ניתוחי סטרילי באמצעות חומר חיטוי מאושר בדרגה מחקרית/רפואית. מרחב זה כולל פד חימום מים בוויסות תרמי, מכשיר סטריאוטקסי המצויד במסכת הרדמה לחולדות, סטריליזטור חרוזי זכוכית, ומאייד גז איזופלוראן (להרדמה). למאייד יש צינורות למסכת ההרדמה ולתא השראה הממוקם במרחב נפרד להליכי הכנה לא-סטריליים של בעלי החיים; כל צינור נשלט על ידי שסתום משלו.
    5. קרצפו ידיים וזרועות ביסודיות עם סבון אנטימיקרוביאלי. ללא מגע עם החלק הפנימי, פתחו מראש פריטים שנארזו בשקיות או עטיפות סטריליזציה. לבשו כפפות סטריליות בשיטה אספטית והעבירו את כל הפריטים הרלוונטיים לאזור הניתוח. הגדירו את עומק המקדח כראוי במלחציים (~ 2 mm) והכינו את המברג. כסו את החומרים הסטריליים בעטיפה סטרילית עד שהניתוח מוכן להתחיל.
    6. הכינו מרחב לא-סטרילי עם מאזניים, מכונה חשמלית לקיצור פרווה, מזרקים סטריליים של 1 mL עם מחטים 26G x 3/8 in (1 לחולדה), יומן ניתוחים, ובופרנורפין (בריכוז 0.03 mg/mL) במנה של 0.1 mL ל-100 גרם.
      זהירות: בופרנורפין הוא אופיואיד חצי-סינתטי מרשימה III של ה-DEA, ויש לנעול אותו ולתעד את השימוש בו כראוי.
    7. בדקו את רמת הגז במאייד האיזופלוראן; הוסיפו גז אם הרמה נמוכה. השאירו את כפתורי זרימת הגז והערבוב כבויים כעת. הפעילו את מיכל ה-O2 ובדקו שיהיה מספיק גז לכל הניתוחים.
    8. שקלו כל חולדה ורשמו את משקל גופה ביומן הניתוחים. השתמשו בטבלת הזרקה של בופרנורפין כדי לקבוע את נפח ההזרקה המתאים.
    9. פתחו את שסתום המאייד לתא ההשראה והשאירו את השסתום למסכת הניתוח כבוי. כוון את התערובת ל-3 ואת קצב הזרימה ל-3 (3% איזופלוראן עם 100% O2 כגז נשא בנפח של 3 L/min).
    10. הניחו חולדה בתא ההשראה והמתינו עד שתגיע למישור הרדמה מתאים (נשימה איטית, היעדר רפלקס כפות רגליים, היעדר רפלקס מצמוץ). הוציאו את החולדה מהתא ברגע שהיא הגיעה למישור ההרדמה.
    11. גלחו את ראשה באמצעות מכונת קיצור הפרווה, תוך חשיפת כמות מספקת של עור עבור אתר החתך ועפעף שמאל. במידת הצורך, החזירו אותה לתא ההשראה כדי להגיע שוב למישור ההרדמה לפני המשך הגילוח.
    12. חטאו את העור החשוף על ידי שפשוף לסירוגין של איזופרופיל אלכוהול ופובידון-יוד שלוש פעמים. במידת הצורך, החזירו אותה לתא ההשראה כדי להגיע שוב למישור ההרדמה, לפני ההעברה לשולחן הניתוחים.
  2. ניתוח
    1. פתחו את שסתום המאייד למסכת ההרדמה וסגרו את השסתום לתא ההשראה. כוון את התערובת ל-2.5 ואת קצב הזרימה ל-2 (2.5% איזופלוראן עם 100% O2 כגז נשא בנפח של 2 L/min). העבירו את החולדה למכשיר הסטריאוטקסי ופעלו לפי הפרוטוקולים הסטנדרטיים לקיבוע ראשה לסרגל החותכים ולסרגלי האוזניים (ראו Geiger et al., 200849 לדוגמה).
    2. הזריקו לחולדה מנת בופרנורפין טרום-ניתוחית (SC) והשליכו בזהירות את המחט (ללא כיסוי) למכל חדים. הניחו סדין ניתוחי סטרילי על החולדה, כך שייחשף רק האזור הניתוחי ויהיה מבודד משאר הגוף.
    3. לבשו מסכת ניתוח, כובע ניתוח, חלוק ניתוח, משקפי מגן וכל ציוד מגן אישי אחר הנדרש על ידי ה-IACUC. שטפו וקרצפו ידיים וזרועות ביסודיות עם סבון אנטימיקרוביאלי. לבשו כפפות סטריליות בשיטה סטרילית.
    4. מרחו כמות קטנה של משחה אופתלמולוגית לשתי העיניים באמצעות מקל צמר גפן כדי למנוע את התייבשותן.
    5. המשיכו בניתוח כאשר החולדה מראה מישור הרדמה מתאים. נטרו את החולדה ברציפות לאורך כל הניתוח ובדקו את רמת האיזופלוראן מדי פעם. כוון את כפתורי הזרימה והערבוב בהתאם במהלך הניתוח בהתבסס על תגובת החולדה להרדמה.
    6. בצעו חתך קדמי-אחורי בקו האמצע של הגולגולת בעזרת להב סקלפל. חתך זה צריך לחשוף שטח מספיק לפני העיניים (כלומר, חשיפת עצם המצח) ומעט מאחורי התפר הלמבדואידי.
    7. גרדו את הפריאוסטאום מעל הגולגולת בזהירות כדי לא לגרום לדימום מופרז. נגבו רקמת חיבור ודם עודפים באמצעות מקל צמר גפן.
    8. קדחו חור באמצעות המקדח בעזרת מלחציים למחטים, החל מיד מאחורי התפר הקורונלי באחת מעצמות הפריאטליות. הסירו דם ושאריות עצם בעזרת מקל צמר גפן. אחזו בבורג 0-80 בהברגה באמצעות פינצטה דקה והדקו אותו לחור בעזרת מברג השעונים; הדקו את הבורג רק במידה מספקת כדי לא לפגוע ברקמת המוח הקורטיקלית (בדרך כלל 3-4 סיבובים מלאים).
    9. בצעו את אותם הליכים המתוארים בסעיף 4.2.8 כדי לקבע שני ברגי 0-80 נוספים לגולגולת, אחד מיד מאחורי התפר הקורונלי של העצם הפריאטלית הנגדית ואחד מיד לפני התפר הלמבדואידי הימני. נמצא כי 3 ברגים מספיקים לעיגון המלט הדנטלי (ראו 4.2.18) לגולגולת, שכן בורג רביעי (לפני התפר הלמבדואידי השמאלי) יפריע להצבת האלקטרודה הביפולרית.
    10. הוציאו headstage של EMG מצלחת הפטרי. כוון את ה-headstage כך שחוט ה-10T יהיה בצדה הימני של החולדה. כופפו את חוט ה-10T כלפי מעלה, כך שיהיה מקביל לקצה התחתון של המיקרו-סטריפ. כופפו אותו מעט לצד ימין כדי שהחוט יוכל לעבור סביב ברגי ה-0-80 הקדמי והאחורי. הניחו אותו בצד אך קרוב מספיק להגעה.
    11. [בהנחה שהמנתח הוא ימני] החזיקו פינצטה לחיבוש של 3 אינץ' ביד שמאל ופינצטה לחיבוש של 4 אינץ' ביד ימין. אחזו בעור העליון באתר החתך של עין שמאל עם פינצטת ה-4 אינץ' וכוונו את פינצטת ה-3 אינץ' לעבר פינת העין הזו; אחזו בעור בפינה זו. שמרו על האחיזה עם פינצטת ה-3 אינץ' תוך שחרור פינצטת ה-4 אינץ'.
    12. קחו מחט אחת 26G x 3/8 in והחדירו אותה דרך פינת העפעף; סובבו את המחט כך שהצד המשופע פונה כלפי מעלה. השתמשו בפינצטה למיקרו-דיסקציה עם פלטפורמה כדי להחדיר את חוט ה-3T האמצעי לחור המחט. דחפו אותו דרך החור מספר סנטימטרים מבלי להחדירו עד הסוף; חוט זה הוא המוליך השלילי.
    13. בצעו את ההליכים המתוארים בסעיפים 4.2.11 ו-4.2.12 כדי להחדיר את חוט ה-3T החיצוני לחלק האמצעי של העפעף; חוט זה הוא המוליך החיובי.
    14. אחזו בשתי המחטים ביד אחת בעודכם אוחזים ב-headstage ביד השנייה (או בפינצטה). משכו את המחטים מהעפעף תוך הנחיית ה-headstage לאותו כיוון בתנועה אחת רציפה. במידת הצורך, סובבו את ה-headstage כך שחוט ה-10T יהיה לכיוון עין ימין של בעל החיים; אל תאפשרו לחוטי ה-3T להצטלב. השתמשו בפינצטה בעלת קצה דק כדי לוודא שוב שהמוליך החיובי נמצא במרכז העפעף.
    15. כוון את ה-headstage כך שיהיה ממורכז בין העיניים ובמיקום אופטימלי מעל עצם המצח, קדמה לברגים שהוחדרו באופן בילטרלי. החזיקו את ה-headstage ביד אחת ואת פינצטת ה-3 אינץ' ביד השנייה. לפפו את חוט ה-10T סביב בורג אחד או שניים בצד ה-10T.
    16. הניחו פינצטה לחיבוש של 3 אינץ' ביד אחת ופינצטה לחיבוש של 4 אינץ' ביד השנייה. השתמשו בפינצטת ה-3 אינץ' כדי לאחוז בעור באתר החתך לכיוון הרקה השמאלית. השתמשו בפינצטת ה-4 אינץ' כדי ליצור "כיס" קטן על ידי הפרדת העור (כלומר, הפסציה השטחית) משריר הטמפורליס. השתמשו במספרי איריס כדי לגזור עוד רקמת חיבור, תוך עבודה לכיוון פינת עין שמאל, כדי להגדיל את גודל כיס זה. היזהרו לא להיכנס עמוק מדי או לחתוך כלי דם.
    17. קחו אלקטרודה ביפולרית ועצבו את מוליכי החוט כך שיתאימו לקימור של שריר הטמפורליס, בעוד ששני הפינים ממוקמים (גבאי ובטני) מאחורי עין שמאל (ראו וידאו), והקצה התחתון של האלקטרודה הביפולרית ממוקם ישירות מעל הגולגולת. השאירו מרחק מספיק בין ה-headstage לאלקטרודה זו כדי שתושבי כבל הקומוטטור (איור 3) יתחברו ללא הפרעה.
    18. שפכו אבקת מלט דנטלי לכורח - התחילו עם כ-1/3 מהכורח, ואז התאימו את הכמות לפי הצורך. הוסיפו את הרכיב הנוזלי עד שהעקביות תהיה מימית, וערבבו רכיבים אלה עם הספטולה. כאשר עקביות המלט הופכת לצמיגית יותר, מרחו אותה על אתר החתך - תוך כיסוי כל קצוות העור בשוליים של לפחות 1/8 אינץ'.
      1. מרחו מספיק מלט כדי לבצר את ה-headstage ואת האלקטרודה הביפולרית מבלי למנוע מהחולדה לסגור את שתי עיניה.
    19. ודאו שלפחות 4-5 הברגות של האלקטרודה הביפולרית נשארות לא אטומות במלט כדי שניתן יהיה לסובב פנימה את התקע הביפולרי (איור 3). הסירו מלט עודף מה-headstage - החלק העליון של המיקרו-סטריפ ושלושת פיני המגע חייבים להיות נקיים. המלט מתקשה במהירות ועשוי למנוע בקלות צימוד מלא של כל אחת מהאלקטרודות הללו לתשבי כבל הקומוטטור. השתמשו בפינצטה דקה כדי להסיר מלט עודף שהתייבש חלקית.
    20. המתינו שהמלט יתקשה; הוא יהפוך לשקוף. השתמשו במספרי מיקרו-דיסקציה כדי לגזור את האורך העודף משני חוטי ה-3T, תוך השארת מספר סנטימטרים למרחב עבודה.
    21. אחזו בפינצטה למיקרו-דיסקציה עם פלטפורמה ביד שמאל ובפינצטה למיקרו-דיסקציה עם קצוות דקים ביד ימין. אחזו בחוט 3T אחד עם הפינצטה השמאלית מעט לפני העפעף. בעזרת הפינצטה הימנית, דחפו את העפעף למעלה כדי לחשוף יותר מחוט ה-3T והחזיקו אותו שם. שחררו את הפינצטה השמאלית והשתמשו ביד שמאל כדי לאחוז ב-headstage (ודאו שהוא מקובע כעת). השתמשו בפינצטה הימנית כדי לקלף חלק מבידוד ה-PTFE, מה שמאפשר לחוט ליצור מגע עם שריר ה-orbicularis oculi.
      הערה: היזהרו לא למשוך חזק מדי בחוט 3T, שכן הוא עלול להתנתק מפין המגע. אם חוט מתנתק, לא ניתן יהיה להחליף את פין המגע כיוון שהמלט שהתקשה לא ישתחרר בחופשיות מהגולגולת מבלי לגרום לשבירת עצם.
    22. בצעו את השלבים בסעיף 4.2.21 כדי לקלף PTFE עודף מחוט ה-3T השני.
    23. אחזו בשתי פינצטות המיקרו-דיסקציה כפי שצוין בסעיף 4.2.21 (פלטפורמה בשמאל, קצוות דקים בימין). מנו את הפינצטה השמאלית מעט לפני חוט 3T אחד תוך השארת מקום לפינצטה הימנית להיות ממוקמת ישירות לפני העפעף. אחזו בחוט עם שתי הפינצטות.
      1. צרו "וו" על ידי החזקת הפינצטה הימנית ללא תנועה וסיבוב הפינצטה השמאלית למעלה ומסביב לכיוון העפעף; עשו זאת בתנועה אחת. שחררו בזהירות את הפינצטה הימנית, ולאחר מכן את השמאלית.
        הערה: תליית האלקטרודות על העפעפיים עוזרת למזער את האפשרות שהן ישפשפו את הקרנית. זה גם ממזער את האפשרות לשבירת חוטים בכל נקודה בשלב הבדיקות ההתנהגותיות. בעוד שהתלייה אינה מונעת לחלוטין את שפשוף החוט בקרנית עבור כל בעלי החיים, הם בדרך כלל אינם מראים סימנים לנזק בעיניים, כפי שמשתקף באמפליטודות המצמוץ הגבוהות שלהם (שנמדדו על ידי האוסצילוסקופ הדיגיטלי ב-5.1.7) ומתוך תצפיות בריאות יומיות לאחר הניתוח (דמעות מרובות, סגירה חלקית של העפעף, היעדר ניידות עקב נזק לעין). אם חולדה מראה סימנים ראשוניים של אי-נוחות, היא מורדמת באיזופלוראן (ראו 4.1.10) והאלקטרודות שלה נבדקות מחדש ו/או ממוקמות מחדש. משחה אופתלמולוגית נמרחת כדי למנוע את התייבשות הקרנית. החולדה נבדקת מדי יום לאיתור סיבוכים עיניים לאחר הפרוצדורה, ובמידה ואלה נמשכים, יש לפנות לטיפול וטרינרי. חולדות המראות סיבוכים חמורים בעיניים שלא ניתן לתקן על ידי מיקום מחדש של האלקטרודות או טיפול וטרינרי, מושמדות באופן הומני בהתאם לנהלי העבודה הסטנדרטיים של ה-ECU IACUC.
    24. בצעו את השלבים בסעיף 4.2.23 עבור חוט ה-3T השני. גזרו חוט עודף באמצעות מספרי המיקרו-דיסקציה.
    25. השתמשו ביד אחת כדי לשחרר את החולדה מסרגלי האוזניים תוך תמיכה בגופה ביד השנייה. בדקו את ראשה לאיתור דם או שאריות, נקו במידת הצורך, ותנו לה זריקה של בופרנורפין לאחר הניתוח.
    26. הניחו את החולדה במכל התאוששות הכולל מקור חום (כגון פד חימום מים בוויסות תרמי) כדי לסייע בהתאוששות. רשמו ביומן הניתוחים את שעת סיום הניתוח וכל הערה רלוונטית על החולדה במהלך הניתוח. נטרו את נשימת החולדה, וכאשר היא מראה שכיבה על הבטן (sternal recumbency) או נעה, ניתן להחזירה לכלוב הביתי שלה.
    27. העבירו שוב סטריליזציה למכשירים (למעט פינצטות למיקרו-דיסקציה - שכן הן עלולות להינזק) באמצעות הסטריליזטור החרוזי וודאו שהאזור הניתוחי נשאר אספטי, וחזרו על הפרוטוקולים האספטיים אם יבוצעו מספר ניתוחי עפעפיים.

5. פרוצדורה של התניה קלאסית של מצמוץ עיניים

figure-protocol-2
איור 3: תיבת התניה אופרנטית מותאמת להתניית מצמוץ עיניים. חולדות הן יונקים הנעים בחופשיות, ולכן נעשה שימוש במחליף סיבוב (commutator) כדי לשמור על מגע של אותות חשמליים מה-EMG ומהתקעים הביפולריים המחוברים לראש. מחליף הסיבוב מחובר לזרוע של המעמד, שאיזון משקליו נועד להפחית את הלחץ על החולדה. טוויטר פייזו (רמקול) מפיק צליל בתדר 2.8 kHz ובעוצמה של 85 dB, וערכים אלו מכויילים באופן קבוע. ספוג אקוסטי מסייע בהנחתת רעשים סביבתיים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-3
איור 4: מערכת התנייה של מנצנץ עיניים (Eyeblink).מערכת מותאמת אישית זו מורכבת מיחידת EMG Integrator המסננת ומגבירה אותות נכנסים מהחולדות, יחידת בקרת גירויים (Stimulus Control) המספקת גירויים שונים בנוסף לצלילים ושוקים חשמליים, קדם-מגבר לכל תיבת אופרנט להגברת עוצמת אות ה-EMG, ומבודד גירויים לכל תיבת אופרנט; המערכת מספקת רמות שונות של שוקים חשמליים (ב-mA). אוסצילוסקופ דיגיטלי (שאינו חלק ממערכת ה-eyeblink הסטנדרטית) משמש למטרות אבחון במהלך תקופת ההביטואציה והרכישה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

  1. התחילו את אימון ההרגלה והרכישה 5 ימים לאחר הניתוח. העניקו לכל חולדה יום אחד של טיפול והרגלה למ apparatus האימון - המורכב מתיבת התנייה אופרנטית מותאמת השוכנת בתוך תא גדול יותר בעל בידוד אקוסטי (איור 3) - ולאחר מכן בצעו 6 ימי אימון רכישה. את מפגשי ההתרגלות והרכישה יש לבצע באמצעות מערכת מיצמץ עיניים שנבנתה בהתאמה אישית (איור 4).
    1. צרו קובץ יומן אימון והדפיסו אותו לשימוש לרישום יומי. ביומן זה יש להקצות את קבוצת החולדות לתיבות האימון שלהן באופן פסאודו-אקראי (או בשיטת אקראיות אחרת).
    2. הפעילו את מערכת ה-eyeblink, את המחשב והריצו את תוכנת ה-eyeblink. גרסה זו של התוכנה כוללת מודולים (או יישומים) שונים הפועלים באופן עצמאי. הפעילו את מודול החיות (Animal module) כדי ליצור קובץ *.RAT המכיל מידע על הנבדקים (מספר סשן, מזהה חיה, מין, משקל ומספר כלוב). קובץ RAT בודד מנהל עד ארבע חולדות, המהוות צוות של נבדקים. הזינו את הערכים בהתאם ושמרו את הקובץ. צרו קובץ RAT נפרד עבור כל צוות חולדות המיועד לאימון.
    3. העבירו את החולדות מהוויבאריום לחדר הבדיקות וסגרו את הדלת. טפלו בכל חולדה במשך 5 דקות.
    4. העבירו חולדה לקופסה המיועדת לה וחברו את תקעי ה-EMG והתקעים הביפולריים של כבל הקומוטטור (commutator) לראש-הבמה (headstage) של ה-EMG ולאלקטרודה הביפולרית התואמות שעל ראשה.
      הערה: בחשיפה הראשונה לכבל הקומוטטור, חולדה עשויה להתנגד ולהפגין סימני סטרס. יש לטפל בחולדה בזהירות ולאפשר הפסקות בין ניסיונות חיבור שלא הצליחו כדי להפחית את רמת הסטרס שלה.
    5. השתמשו בממער (commutator) מסתובב 360° תוך שמירה על העברת/קליטת אותות חשמליים בעוד החולדה נעה בחופשיות בתוך קופסה. למערכת 5 ערוצים (3 עבור אלקטרודות ה-EMG, 2 עבור אלקטרודות ביפולריות) המובילים ליחידת ה-EMG Integrator, המסננת ומגבירה את האות הגולמי.
    6. ודאו שהחולדה נעה בחופשיות וכי היא אינה מוגבלת על ידי משקל מכלול כבל הקומוטטור או זרוע המעמד. במידת הצורך, כווננו את משקולת האיזון בחלק האחורי של המעמד. בדקו שכל התקעים מהודקים, ולאחר מכן סגרו את דלת הכלוב. בצעו את אותו הליך חיבור ובדיקה עבור כל החולדות.
    7. השתמשו באוסצילוסקופ כדי לבחון את פעילות ה-EMG שלהם לאיתור אותות חריגים (למשל, פעילות חשמלית בתדר גבוה ו/או באמפליטודה גבוהה) ובמערכת מעקב בווידאו כדי לבדוק את מצבם (למשל, פעילות מוטורית, רגישות לסביבה, סימני כאב), אם זמינה. רשמו כל בעיה שנצפתה ביומן האימון.
    8. אפשרו לחולדות להתרגל לתאים שלהן במשך 10 דקות, ולאחר מכן החזירו אותן לכלובי המגורים שלהן.
    9. יש לנקות ולחטא את תיבות הלמידה האופרנטית, לטאטא את הרצפה ולנקות את השולחן או השולחנות. יש לבצע הליכים אלו לאחר כל מפגש.
  2. אימון הרכישה מתבצע לאורך 6 ימים (מפגשים) רצופים.
    1. יום 1: העבירו חולדה לקופסה המיועדת לה וחברו את תקעי ה-EMG והתקעים הביפולריים מכבל הקומוטטור לראש-הקלט (headstage) של ה-EMG ולאלקטרודה הביפולרית התואמות שעל ראשה. בצעו את אותם הליכים שצוינו בסעיפים 5.1.6 ו-5.1.7.
    2. הפעילו את מבודדי הגירויים וכווןנו את הזרם שיוספק ל-0.4 mA (4% מ-10 mA, כפי שמוצג בסרטון). המבודדים מספקים זרם חשמלי באופן{(-}חלופ{(-)}(כלומר, מניסוי לניסוי), בין הפינים הגביים (dorsal) והבטני (ventral) של האלקטרודה הביפולרית. פעולה זו מסייעת בהפחתת עייפות של סיבי השריר (בכל אתר שריר) לאורך הגשות גירויים חוזרות.
    3. יש להתרחשות את כל תגובות ממצמץ העיניים שהופעלו ואת הסביבלויות שהופגנו בכל ניסוי עבור כל החולדות. לאחר כל ניסוי שני, הגבירו את עוצמת הגירוי הבלתי מותנה (US) של השוק ב-0.4 mA עבור כל חולדה, עד להגעה ל-1.6 mA (בניסויים 7 ו-8). ודאו שוב שכל החולדות מגיבות באופן תקין בכלובים שלהן, שכל הגדרות ההגברה וההגבר (gain) קבועות, ושהסיגנלים החשמליים המתקבלים מהן תקינים (כלומר, רעש EMG נמוך/מינימלי). השתמשו בעוצמת גירוי בלתי מותנה (US) של 1.6 mA בכל ימי אימון הרכישה.
      הערה: אם חולדה מפגינה סימני כאב ברמת זעזוע נתונה (למשל, קפיצות גבוהות מהרצפה, טיפוס על קירות, ריצה סביב), הניסוי יופסק והחולדה תחזור להגדרת ה-mA הקודמת (0.4 mA פחות) למשך שני ניסיונות. לאחר מכן, החולדה תקבל שוב את ערך הזעזוע הגבוה שלא סבלה ממנו, ואם תפגין סבילות, היא תקבל ערכים עולים עד להגעה ל-1.6 mA. אם היא אינה מסוגלת לסבול אף ערך, ייעשה שימוש בערך הנמוך הבא (במרווחים של 0.4) שבו היא מפגינה סבילות לאורך כל האימון.
    4. השתמש באוסצילוסקופ כדי לצפות בפעילות ה-EMG שלהם לאיתור אותות חריגים (לדוגמה, פעילות חשמלית בתדר גבוה ו/או באמפליטודה גבוהה) ומערכת מעקב וידאו לבדיקת מצבם (למשל, פעילות מוטורית, רגישות לסביבה, סימני כאב).
      הערה: הסבר על מעקב ECC: תקופה מייצגת של ניסוי עם גלי EMG שנלכדו מומחשת ב- איור 1 והליך ה-ECC (התניה נגדית) מוסבר בפירוט בסרטון. קובץ אימון ההתניה של ה-trace מוגדר לספק 100 ניסיונות (90 ניסיונות של צימוד CS-US ו-10 ניסיונות של CS בלבד בכל 10th (ניסוי) עם מרווח ממוצע בין ניסויים של 30 שניות. מפגש האימון כולו נמשך כ-52 דקות (בהנחה שלא היו הפסקות). כל החולדות הן נאיביות במפגש 1, ויפתחו עקומות למידה דיפרנציאליות (כפי שנקבע על ידי ביטוי של תגובות מותנות - CRs) ככל שיתקדמו במהלך מספר ימי אימון.
    5. התחלת האימון: הפעילו את מודול התוכנה Blink. כאשר תתבקשו, בחרו את קובץ ה-RAT הנכון ואת קובץ האימון עבור "עקבה" התניית מצמוץ עיניים.
    6. רשמו את זמן ההתחלה ואת שם הנסיין ביומן האימון. עקבו בנקודה זו אחר כל הפעילות: אותות EMG תקינים, תגובות מצמוץ תקינות לגירוי החשמלי (כלומר, תגובות לא מותנות (URs) גבוהות/תכופות), מצב בריאותם של בעלי החיים ותפקוד תקין של החומרה. רשמו כל הערה ראויה לציון ביומן האימון.
    7. איסוף הנתונים מתבצע באופן אוטומטי על ידי התוכנה כקבצי RAW (קובץ אחד לכל חולדה, לכל יום). קבצי ה-RAW מכילים אמפליטודת EMG (בוולטים), ספירת תדרים, חביון ונתונים שטח עבור תגובות בהלה (SRs), תגובות לא מותנות (URs) ותגובות מותנות (CRs) (סך הכל ואדפטיביות). ארטיפקט של השוק מסתיר את 100 המילי-שניות הראשונות של תקופת ה-UR, ולכן רק 140 המילי-שניות האחרונות של תקופת ה-UR מכילות נתוני UR.
    8. בסיום האימון, התוכנה תיסגר באופן אוטומטי. הוציאו את כל החולדות מקופסאות האימון שלהן והחזירו אותן אל הוויבאריום.
    9. חזרו על שלבים 5.2.5 - 5.2.6 עבור כל ימי האימון הבאים. לפני התחלת מודול ה-Blink ביום נתון, עדכנו את מספר הסשן (session number) בתוך קובץ ה-RAT. פעולה זו מאפשרת יצירה של קובצי RAW חדשים עבור כל החולדות באותו יום. לכל חולדה צריכים להיות 6 קובצי RAW, בהנחה שאף אחת לא הוסרה מהאימון.
  3. עבד את קובצי ה-RAW וצור קובץ שעבר סינון לצורך ניתוח סטטיסטי.
    1. הפעילו את מודול הניתוח (Analysis module). עברו על כל סשן עבור כל חולדה בבסיס של ניסוי-ניסוי (trial-by-trial) כדי לאתר ניסויים בעייתיים. פעולה זו מבוצעת כדי לסנן ניסויים שעלולים להיות פגומיםים מסיבות שונות (למשל, פעילות בסיס מוגברת לפני ה-CS, תנועה מוגברת, ניתוק אלקטרודות, בעיות בכבילה/בחוטים). התוכנה כוללת אלגוריתמים המסייעים לנסיין בזיהוי ובהסרה של "ניסויים לקויים" מלהיות חלק ממערך הנתונים המסונן.
    2. ייבאו את הנתונים המסוננים לתוכנת גיליונות אלקטרוניים ובצעו ניתוחים סטטיסטיים רלוונטיים.

תוצאות

התוכנה eyeblink היא מסוגל לספק ערכה גדול ומקיף של נתונים עבור סוגים רבים של מדידות. לשם קיצור, אנחנו מדווחים במחקר זה, נציג תוצאות עבור למידה וביצועים אמצעים הכוללים אחוז CR מסתגלת, משרעת CR מסתגלת, אחוז UR UR משרעת. תקופת הסתגלות CR נבחר מאחר והוא מייצג את רכישת eyeblink מתוזמנת היטב תגובות על אימונים חוזרים ונשנים, כתוצאה משופרים הפלסטיות הסינפטית בהיפוקמפוס במהלך מעקב ECC50,51,52. האמצעים UR נבחרו כדי להבהיר אם לגירעונות למידה בהשפעת אלכוהול neonatal מעקב ECC היו עקב שיבושים בתפקוד associative learning או שיבושים כתגובה לאסונות ההלם אותנו - אשר עשוי להצביע על ההבדלים מוטיבציה או מוטוריים, יותר מאשר למידה הבדלים בין קבוצות הטיפול. נתונים עבור כל מדד נותחו באמצעות 2 (מיני) x 3 (ילודים ופגם הקבוצה) x 6 (הפעלה) מעורב ANOVAs, עם הפעלת כגורם אמצעים חוזר על עצמו. תופעות משמעותיות העיקרי לטיפול neonatal נותחו באמצעות בדיקות לאחר הוק של Tukey, אינטראקציות משמעותיות נותחו באמצעות בדיקות אפקטים פשוטים. כל ניתוחים סטטיסטיים נערכו באמצעות רמת אלפא מינימלית של 0.05, התוצאות בגרפים ב- SEM. זאת אומרת ±

החל מהמדד אחוז CR אדפטיבית, מקרה ANOVA ציינו השפעה רבה הראשי של קבוצת neonatal, F(2,21) = 11.69, p < 0.001, אבל אין השפעה משמעותית הראשי של סקס (p = 0.71) או אינטראקציה משמעותית בין גורמים אלה (p = 0.20). כצפוי, אחוז CR מסתגלת גדל במהלך המפגשים שישה אימונים, F(5, 105) = 81.15, p < 0.001, ואת ההבדלים בין קבוצות neonatal היו תלויים רמה מסוימת של הפעלה, F(10, 105) = 4.58, p < 0.001. היו אין אינטראקציות משמעותיים אחרים המערבים את הפקטור בהפעלה. באופן דומה משרעת CR אדפטיבית, היה שוב השפעה רבה הראשי של קבוצת neonatal, F(2,21) = 22.32, p < 0.001, אבל אין השפעה משמעותית הראשי של סקס (p = 0.21) או אינטראקציה משמעותית בין גורמים אלה (p = 0.48). משרעת CR גם גדל באופן משמעותי במהלך המפגשים שישה אימונים, F(5, 105) = 59.27, p < 0.001, ואת ההבדלים בין קבוצות neonatal היו תלויים רמה מסוימת של הפעלה, F(10, 105) = 4.31, p < 0.001. בסך הכל, בשני אמצעים CR הראה הבדלים משמעותיים בין האמצעים קבוצה, אמצעים אלה מופרדים באופן משמעותי-הפעלות שונות של אימון. כדי לוודא אילו קבוצות שונה משמעותית, בדיקות לאחר הוק של Tukey הראו כי העכברים (AI) לצינורות אלכוהול המבוצעת באופן משמעותי יותר גרוע בשני אמצעים CR מאשר unintubated-control (UC) וחולדות לצינורות דמה (SI) (p < 0.01 עבור CR אחוז; p < 0.001 עבור CR משרעת), אשר ולא נבדלים אחד את השני (שלp> 0.05). אפקטים פשוטים בדיקות המבוצעות על הקבוצה ילודים ופגם משמעותי x אינטראקציות הפעלה בשני אמצעים CR, אישר החולדות AI היו ליקויי יותר באופן משמעותי ברכישת CRs שמתחילים בשיעור 2 וממשיכה עד 6 מושב בהשוואה סי והן UC עכברושים (כל pשל < 0.05), אשר ולא נבדלים אחד את השני במשך שש פעמים. החריג היחיד היה משרעת CR מסתגלת כי חולדות סי לא להתחיל דברים שונים באופן משמעותי AI חולדות עד שיעור 3. תוצאות אלו מוצגים באיור 5A, 5B.

היו הבדלים משמעותיים אין האמצעים UR בשל מין, קבוצת neonatal או אינטראקציות של גורמים אלו, יחד עם הגורם הפעלה. ממצאים שליליים אלו עולה כי כל קבוצה הצליח לפלוט eyeblink התגובות ההלם אותנו באותה מידה, כי הגירעונות למידה הנהוגות העכברושים AI לא הושפעו על ידי הבדלים מוטיבציה או מנוע מהבהבת (איור 6A, 6B).

figure-results-1
איור 5 : רכישת מעקב ממוזגים מגיבה (זאת אומרת ± SEM). אלכוהול בתחילת החשיפה (קבוצה AI) השפיעה באופן משמעותי רכישת אחוז מותנה מסתגלת התגובה (CR) (א) ו משרעת (B). מעקב ECC קשה מטבעו לרכוש, לכן בצעדים נמוכים יחסית עבור כל קבוצות - עם השהיה ECC, אחוזי עשוי להגיע 80-85% במודלים מכרסמים FASD21,53. בכל זאת, מעקב ECC ההליך הוא יותר מכביד על ההיפוקמפוס, אשר חשופה להשפעות אלכוהול במהלך התפתחות המוח מוקדמת. * = p < 0.05, * * = p < 0.01, * * * = p < 0.001 בין ה-UC ו- AI חולדות; גודל מדגם ניתנים בסוגריים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-2
איור 6 : רכישת unconditioned תגובות (אומר ± SEM). Eyeblink ביצועים (אחוז UR UR משרעת) לא היתה שונה באופן משמעותי בקרב קבוצות. העדר הבדלים מציינים כי עוצמת ההלם בשימוש במהלך רכישת ההכשרה לא באופן שונה לשנות מוטיבציה אצל החולדות AI או וביכולתם לייצר הגנתית למצמץ התגובות ההלם, לעומת שתי קבוצות הבקרה (UC ו- SI). גודל מדגם ניתנים בסוגריים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

דיון

הגורים neonatal עכברים שקיבלו אתיל אלכוהול בימים כמחנכת 4-9 הציג מעקב eyeblink מיזוג ליקויי בבגרות. ממצאים אלה תומכים את הרעיון כי אלכוהול הוא teratogen עם ומתמשך השפעות מזיקות על הפונקציה בהיפוקמפוס. באופן כללי, ממוזגים להגיב בהליך מעקב היה נמוך עבור חולדות נחשפים אלכוהול לעומת חולדות בשתי הקבוצות שליטה. ליקויי associative learning בחולדות החשופים אלכוהול לא הושפעו על ידי הבדלים מוטיבציה או מוטוריים (כלומר., אין הבדל בין מהבהב על עוצמת ההלם בארה ב).

בעוד מעקב ECC היא כלי אבחון שימושי עבור שחקרתי אתגר-induced neuropathology בהיפוקמפוס, התוצאות של שיטה זו יש להציב לתוך בהקשר הנכון. ראשית, מרכיבים פרוצדורלי בהפגנה זו מעורב מסירה יישוב של אלכוהול במהלך חלון הידוע של פגיעות במוח המתפתח, ייצור של חומרה אלקטרודה מאפשר הקלטה של פעילות electromyographic, מספק הלם, למועד ההשתלה של החומרה הנ ל, וכן הניסויים בחיות עוקבות באמצעות פרדיגמה למידה הבודק פונקציה קוגניטיבית של ריבית. בכל שלב בתהליך, יש לנקוט בכדי לא לגרום נזק מיותרים/לא מכוונות הנושאים מכרסמים וכדי לפקח שלטי בריאות באופן קבוע. התוצאות ההתנהגות שלהם לספק את "חלון" קוגניציה, מבנה פסיכולוגי זה רק במדויק תיאר כאשר מצבם הבריאותי לא נפגעת על ידי שגיאות ניסיוני המקיף מינון אלכוהול, ליקויי חומרה או ניתוח ההשתלה. לפיכך, כל רכיב פרוצדורלי בתהליך המחקר חייב ניתן ליישם באופן קול על מנת להבטיח כי יכול להיות אומדן תוצאות ECC לממצאי בבני אדם. שנית, הפרדיגמה ECC מספק תובנה על טיב associative learning, אך חייבים להקפיד לא כדי להרחיב את הממצאים באמצעות גישה זו בהרחבה לייחס אותם בתחומים קוגניטיביים אחרים - זיכרון העבודה, זיכרונות קצרים/לטווח ארוך ותודעה - אלא אם כן אחד שילבה איזה היבט של תחומים אלה במסגרת מחקר ECC על ידי עיצוב ניסיוני. לדוגמה, ההדגמה בחן את שלב הרכישה של מעקב ECC למידה, אך לא לבחון שימור זיכרון בחולדות לאחר הם סיימו את האימונים. זיכרון הוא לפיכך תהליך פסיכולוגי עצמאי צריך להעריכו בנוסף למידה. על ידי עיצוב, אחד עשויים לשלב את מרווח זמן השמירה בזיכרון כדי להעריך את יכולת הזיכרון לטווח קצר או לטווח ארוך גם. שלישית, הכרה כי ישנם מערכות זיכרון מקבילים54 ייתכן עובדים בו זמנית יחד עם גורמי מוטיבציה, חווייתיים, הורמונלי אשר תורמים להתנהגות, חיונית להבנה זו associativity (במהלך ECC), אך אחת של תהליכים רבים לגלות מהו "טוב" או "המסכן" על למידה. לבסוף, מעקב ECC אינה משימה בהיפוקמפוס תלוית גרידא, כמו באזורים אחרים במוח עשויים לתווך רכיבים מסוימים של הכי טובים ביותר. לפיכך, הבנה של האינטראקציות בין מעגלים עצביים שונים ו/או הסוג של גירוי פרמטרים שאינם מנוצלים במחקר, חייב להילקח בחשבון בעת ביצוע השלכות בהתבסס על תוצאות דיסקרטית. המוח הקטן, לדוגמה, תורם גם מעקב ECC, שבו הוא משפיע על מאפיינים טופוגרפיים של CR ו- CR תזמון, במיוחד כאשר המודיעין הפקיסטאני הוא קצר משך. מעקב ECC לא מושפע בבני עם אסטרוציטומה נזק אשר נבדקים עם מרווח זמן מעקב (ms 1000), אלא היא מושפעת אלה המקבלים מרווח (400 ms) מעקב קצר34. יתר על כן, פצעים דו-צדדים של הגבי המדיאלי קליפת המוח הקדם חזיתית (mPFC) המכוון את האזורים agranular anterior cingulate, המדיאלי בעכברים, למנוע רכישת מעקב CRs55, בעוד הרס mPFC סימטרית בארנבים מייצרת תוצאות דומות46. ממצאים אלה גם להדגיש את חשיבות בהתחשב הבדלים בין המינים ב הקדם חזיתית תרומות מוח-אסטרוציטומה גזע מונע associative learning, כגון מעקב ECC. בזמן חשיפה neonatal אלכוהול במהלך 4-9 המינימאליים PD של 500-ms CRs מעקב למבוגר עכברים מחקר זה ואחרים47,56, זה אינו המקרה אותו neonatal החשופים אלכוהול חולדות להיתקל מרווח מעקב 300-ms, גם כאשר אתגר במינון גבוה יחסית של אלכוהול (5 g/kg)57, רומז ירידת ערך מעקב בחולדות חשוף-אלכוהול הוא תלוי המשך מעקב מרווח.

במחקר זה, ההיפוקמפוס הודגש כמו להיות לתדרוך על תיווכה מעקב ECC, וכאשר תיגר על ידי חשיפה אלכוהול neonatal, תערוכות נזקים עצביים הקשורים כפי שהיא משתקפת לקויות ברכישת מעקב CRs. זה בטח הזהיר, עם זאת, כי המעגלים גזע המוח-מוח, בעיקר לגרעין interpositus, חיונית עבור היבטים רבים של ECC, לרבות רכישת, ביטוי, תכונות הטופוגרפי של CR, בהתאם לסוג של פעילות ECC כולל מעקב ECC36,40,55,58,59. אכן, מעגל עצבי זה מקיים אינטראקציה עם ההיפוקמפוס נהיגה הביטוי של CRs במהלך מסדר גבוה צורות של ECC, כגון מעקב ECC60. חשיפה אלכוהול במהלך התפתחות המוח מוקדמת משפיעה במיוחד בהיפוקמפוס פונקציית מעקב ECC אינו ברור לחלוטין. אזורים שונים במוח רבים פגיעים עלבון אלכוהול מוקדם, לרבות mPFC, המוח הקטן, ההיפוקמפוס18,19,23,47,61,62, וזה קרוב לוודאי כי אלכוהול משבש את התפקוד של מבנים אלה בדרגות שונות, משתנה, אך הבדלים חשובים מבחינה תפקודית על פני הליכים ECC רבים. למרות מלכודות לגבי הפרשנות של תוצאות מעקב ECC מחקרים, רכישה מוצלחת של מעקב CRs הוכח לפחות סומכים ההיפוקמפוס ללא פגע, נתמך על ידי חיות הנגע מחקרים42,44,63,64,65. הליך זה ובכך נשאר בגישה בעלי ערך גבוה עבור הממחיש הקישורים בין אלכוהול התפתחותית חשיפה לאתר ממוזגים להגיב כי המעגלים העצביים שבבסיס, זה הרבה יותר מובן מזה של משימות אחרות תלוי בהיפוקמפוס, כגון מקום למידה במבוך המים מוריס, הרומן וראייה, דימוגראפיים ותלויי המעקב פחד מיזוג.

ECC כשיטה התנהגותית כדי "assay" קוגניציה, יש הישימות נרחבת בתחום neuroteratology התפתחותית. אכן, הממצאים האחרונים מהמעבדה שלנו תומך התפישה ההיפוקמפוס המתפתח היא רגישה מאוד תופעות אלכוהול, אשר עשוי להיות חמאני אסטרטגיות שונות התערבותית18,47. היתרון העיקרי כאן הוא עם הבנה טובה יותר של השפעת אלכוהול מעקב ECC למידה גירעונות, שהם עשויים להיות חזוי של בעיות אחרות בפונקציות בהיפוקמפוס מבוסס מחוץ associative learning - במיוחד אלה ידוע בתיווכו neurocircuitry בהיפוקמפוס אותו.

היישום של מעקב ECC שלה גרסאות אחרות (למשל, עיכוב, היפוך, אפליה, מתחם) להבהיר את הנוירוביולוגי מנגנונים ומערכות העצבים המעורבים associative learning, ניתן להרחיב מעבר לשדה המחקר אלכוהול עוברית. לדוגמה, פרדיגמה זו קיבל תשומת לב רבה המקרים האדם, מודלים חייתיים של מחלות פסיכיאטריות כמו סכיזופרניה66,67, מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר68,69ותרופות של התעללות-70,-71,-72. היתרונות כשיטת מחקר להעריך תפקוד נוירוקוגניטיבי לקוי ניכרות ובכך על פני תחומים הביו-רפואית ופסיכולוגית רבים, לרבות מדעי המוח.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק כדי TDT מ אלכוהול ומשקאות רפואי מחקר קרן (ABMRF).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חשיפה לאלכוהול בילודים
190 אלכוהול אתילי הוכחה (USP)Pharmco-AAPER225-36000 [מחסן רפואי ECU]ניתן להחליף; צריך להיות USP; הימנע משימוש במיכל/סל אלכוהול אתילי 200 הוכחה
לגוריםכל
שמן תירסכל
משאבת טיפול במים מחוממים בדרגת מזון עם/ רפידותGaymarTP-500כדי לשמור על חום הגורים; ניתן להחליף
מחטים היפודרמיות 22 גרם x 1 אינץ', סטריליותכל
מחטים היפודרמיות 30 גרם x 1/2 אינץ', סטריליותכל
אלכוהול איזופרופיל 70%EMD MilliporePX1840-4 [פישר סיינטיפיק]ניתן להחליף; מגיב דרגה
www.fishersci.com
לונג-אוונס חולדות (מגדלים נקבות וזכרים)מעבדות צ'ארלס ריברN/A [המחלקה לרפואה השוואתית]יש לציין גיל ומשקל; התמחור משתנה לפי גורמים אלה
www.criver.com
מספריים מיקרו ניתוח, 3.5 אינץ', 23 מ"מ להביםמכשירי מחקר ביו-רפואיים11-2200לחיתוך צינורות PE
brisurgical.com
פוליאתילן 10 צינורות (0.011 אינץ'. תעודת זהות; 0.024 אינץ' O.D.)BD Diagnostic Systems22-204008 [Fisher Scientific]ניתן להחליף
www.fishersci.com
פוליאתילן 50 צינורות (0.023 אינץ'. תעודת זהות; 0.038 אינץ' O.D.)BD Diagnostic Systems22270835 [Fisher Scientific]ניתן להחליף
www.fishersci.com
מחמם מים מוסדר או מחמם בקבוקי חלב לתינוקותכלאופציונלי; מסייע בחימום תמיסות חלב קר
מזרקי טוברקולין, סטרילי, 1.0 מ"לכל
מזרקי טוברקולין, סטרילי, 10 מ"לכלניתן להשתמש בו כדי להוציא אלכוהול אתילי או להשתמש בסולם שקילה של מיקרופיפט בגודל מתאים
כל אחדצריך להיות בעל רזולוציה טובה (ביחידות גרם)
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
><חזק>ייצור במה של EMG ואלקטרודה דו קוטבית אלקטרודה שינוי
דו קוטבית, 2 ערוצים SS TwistedPlastics One, Inc.MS303/2-B/SPC  נבחר SS  2C TW .008 "חייב לציין אורך מותאם אישית של 20 מ"מ מתחת להדום
www.plastics1.com
Centi-Loc Strip Socket Insulator (המכונה גם Micro Strip Strip Insulator)ITT Cannon / ITT Interconnect SolutionsCTA4-IS-60* או CTA4-1S-60**תלוי בספק; ראה www.onlinecomponents.com או www.avnetexpress.avnet.com
צבת שיניים, CMF Medicon390.20.05ניתן להחליף; השתמש כדי לכווץ חוטים לפיני מגע זכריים
www.medicon.de
מספריים לניתוח, 3.5 אינץ', 23 מ"מלהבים מכשירי מחקר ביו-רפואיים11-2200השתמש רק לחיתוך חוטי 3T; חיתוך חוטי 10T יפגע בלהב - השתמש במקום זאת בלהב של מסיר החוטים
brisurgical.com
PTFE, 10T (קוטר חשוף .010 אינץ')זיגמונד כהן-מדווייר316SS10T
www.sigmundcohn.com
PTFE-מצופה חוט נירוסטה, 3T (קוטר חשוף 0.003 אינץ')זיגמונד כהן-מדווייר316SS3T
www.sigmundcohn.com
סכין גילוחכל כדילהסיר 1 מ"מ משיניים של אלקטרודה דו-קוטבית
Relia-Tac שקע מגע פין, זכרCooper Interconnect220-P02-100ראה Allied Electronics Cat # 70144761
www.alliedelec.com
פינצטה, דיוק גבוה, משונן, 4 3/4 במדעימיקרוסקופיית אלקטרונים78314-00Dכדי לתפוס חוט 10T בחוזקה תוך הפשטת PTFE בפינצטה חלקה
www.emsdiasum.com
פינצטה, דיוק גבוה, חלק, 4 3/4במדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים78313-00B
www.emsdiasum.com
פינצטה, טיפים עדינים במיוחד, 4 3/4במדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים78510-0כדי להפשיט 1 מ"מ של PTFE מקצה אחד של חוט 3T; אחוז בחלק מוגן עם פינצטה חלקה
www.emsdiasum.com
מסיר חוטים, 16-26 AWGכלהשתמש בקצה הלהב כדי לחתוך רצועות מיקרו
<חזקות>שם<חזקות>חברה<חזקות>מספר קטלוגי<חזק>הערות
><חזק>ניתוח עפעפיים
מכשירים כירורגיים (נירוסטה באיכות גבוהה)
2 x מלקחיים חבישה, 4 במכשירימחקר ביו-רפואיים30-1205ניתנים להחלפה; מלקחיים נוספים לאחיזת אלקטרודות/ברגים מחוץ למגש הניתוח
brisurgical.com
מלקחיים חבישה, 3 במכשירימחקר ביו-רפואיים30-1200ניתן להחליף
brisurgical.com
מגש מכשיריםמכשירי מחקר ביו-רפואיים24-1355ניתן להחליף
brisurgical.com
ידית סכין מס' 3, 5 במכשירימחקר ביו-רפואיים26-1000ניתן להחליף
brisurgical.com
מיקרו מלקחיים, 3.5 אינץ', נקודות עדינותמכשירי מחקר ביו-רפואיים10-1630ניתן להחליף
brisurgical.com
מיקרו מלקחיים, 3.5 אינץ', פלטפורמה חלקה (0.3 x 5 מ"מ)מכשירי מחקר ביו-רפואיים10-1720
brisurgical.com
מספריים לניתוח, 3.5 אינץ', עדינים במיוחד, 15 מ"מ להביםמחקר ביו-רפואיים11-2000ניתנים להחלפה
brisurgical.com
מלקחיים רסיסים רגילים, 3.5 אינץ' מכשירי מחקר ביו-רפואיים30-1600ניתנים להחלפה
brisurgical.com
#10 להב כירורגי מנירוסטה לידית #3, סטרילילהחליףכל
0-80 x 0.125 בברגי נירוסטהPlastics One, Inc.0-80 x 0.125ניתן להחליף
www.plastics1.com
Alcohol Prep Pads, SterileFisher Scientific22-363-750 [ניתן להחליף את Fisher Scientific
www.fishersci.comBetadine
Povidone-IodinePurdue Frederick Co.6761815101 [Fisher Scientific]ניתן להחליף
www.fishersci.com
Betadine Povidone-Iodine Prep PadsMoore Medical19-898-946 [Fisher Scientific]ניתן להחליף
www.fishersci.com
ספוגיות כותנה, ניתנות לחיטויכלבדרך כלל מקדח באורך 7.6 ס"מ או 15.2 ס"מ
עבור מגן סיכה, #55 (0.052 אינץ')כלמתכת צריכה לעמוד בפני חלודה וקורוזיה
רפידות גזה, 2 אינץ' x 2בפישר סיינטיפיק22-362-178 [פישר סיינטיפיק]ניתן להחליף
www.fishersci.com
כפפות לטקס/ניטריל/ויניל לשימוש כלליכל
מעקר חרוזי זכוכיתכלמכשירי עיקור בין ניתוחים
משאבת טיפול במים מחוממים עם רפידות x 2GaymarTP-500מומלץ להשתמש במשאבות נפרדות - 1 לניתוח, 1 להתאוששות
מחטים היפודרמיות 26 גרם x 3/8 אינץ', סטריליותכל
איזופלורןVedcoNDC 50989-150-12ניתן להחליף את Manfacturer; ייתכן שיידרש אישור וטרינרי
מערכת אידוי איזופלורן, שולחן,פארקלנד מדעיV3000PKניתן להחליף
www.parklandscientific.com
Jewelers מברג עם להב 1.8-2 מ"מכלמתכת צריכה לעמוד בפני חלודה וקורוזיה
חבילת BCA אורתו-ג'ט (מלט דנטל)Lang DentalB1334מכיל אבקה (1 פאונד) ונוזל
www.langdental.com
מיכל חמצן עם ווסת לחץ,ספק מקומי
כור היתוך חרסינה, High-Form, מזוגג, 10 מ"לCoorsTek, Inc.07-965C [Fisher Scientific]ניתן להחליף ב-Fisher FB-965-I Wide-Form Crucible
www.fishersci.com
Puralube משחת עיניים וטרינרית,חברת הנרי שייןסטרילית NC0144682 [Fisher Scientific]ניתן להחליף
www.fishersci.com
Quatricide PV-15PV-15תרופתי; ניתן להחליף
www.pharmacal.com
מסכות הרדמה בגז עכברוש לניתוח סטריאוטקסי חברת סטולטינג51610
www.stoeltingco.com
עכברוש מכשיר סטריאוטקסי עם מוטות אוזניים (45 מעלות)כלמוטות 45 מעלות מומלצים למניעת נזק לעור התוף
כירורגי רובוז חלברובוז NC9358575 כירורגי[פישר סיינטיפיק]ניתן להחליף; למכשירי סיכה במהלך חיטוי
www.fishersci.com
גוזם שיער מכרסמיםכל
נתרן כלוריפישר סיינטיפיקS641-500 [פישר סיינטיפיק]להכנת 0.9% מי מלח; דרגת ריאגנט; USP
www.fishersci.com
מיקרו-מרית נירוסטה (להב: 0.75 ליטר x 0.18 אינץ'. W)פישר סיינטיפיק21-401-15 [פישר סיינטיפיק]ניתן להחלפה
www.fishersci.com
Starrett Pin Vise, 0.000 אינץ' - 0.055 בכלציפוי ניקל או שווה ערך מומלץ לעמוד בפני חלודה וקורוזיה
כפפות כירורגיות סטריליותכל
עטיפות עיקור, 20 אינץ' x 20 אינץ', ניתנות לחיטויPropper Manufacturing11-890-8C [Fisher Scientific]שימושי לעטיפת אספקה הניתנת לחיטוי ובשדה סטרילי במהלך הניתוח
www.fishersci.com
וילון כירורגי, סטרילי/ניתן לחיטויכל ייתכןשיהיה צורך לחתוך לגודל עבור חולדות
חלוק כירורגי *כלנדרש על ידי
מסכה כירורגית IACUCכל
מזרקי טוברקולין, סטריליים, 1.0 מ"לכל
משקלכל אחדצריך להיות בעל רזולוציה טובה (ביחידות גרם)
שםCatalog NumberComments
<מערכת ורכיבים >חזקיםמצמוץ (בהנחה של מערכת 4 מכרסמים)
5 קומוטטור 5 ערוצים x 4פלסטיק One, Inc.SL2 + 3C
www.plastics1.com
כבל אלקטרודה דו קוטבי, כפול 305 x 4Plastics One, Inc.305-305 80 ס"מ TT2 (C)מספק קצה תקע לאלקטרודה דו-קוטבית על חולדה ולקומוטטור; יש לשנות
www.plastics1.com
כבל, 5 ערוצים, מוגן, 26 AWG x 4כל כדילייצר כבל קומוטטור; זה חייב להיות עשוי מתא שריטות
עבור תיבת בדיקה אופרנטית (בפנים: ניתן להחליף 24 H x 23 W x 14 D in) x 4Med-Associates; המידות הפנימיות צריכות להתאים לתיבת בדיקה אופרנטית בנוחות, עם מקום לקצף אקוסטי; מתאים למאוורר - 55-60 dB
www.med-associates.com
צינורות כיווץ חום (קוטר 3/16 אינץ', 1/4 אינץ', 3/8 אינץ', 1/2 אינץ')כלכדי להגן על כבל קומוטטור שונה קצוות מולחמים וחיבורים
מלמין קצף אקוסטי משולש שיא עם Hypalon שחור (24 x 48 אינץ')McMaster-Carr9162T5; חתוך כך שיתאים ל-4 תאי דיור
www.mcmaster.com
תיבת בדיקה אופרנטית (חיצונית 12.5 L x 10 W x 13.5 אינץ' H),Med-AssociatesENV-007עם רצפת רשת נירוסטה וחלק עליון מותאם אישית (3 בחור במרכז לכבל קומוטטור)
www.med-associates.com
אוסצילוסקופ (אופציונלי)כלמפרט מינימלי מומלץ: רוחב פס אנלוגי של 200 מגה-הרץ, דגימה בזמן אמת של 1 GS/s, 4 ערוצים; ראה www.picotech.com
/td>
Piezo Tweeters (רמקולים) x 4 (7 x 3 אינץ')MCM Electronics53-805חייב להתאים למפרטי טווח התדרים עבור מערכת מצמוץ (2500 הרץ - 25 קילו-הרץ)
www.mcmelectronics.com
תחנת הלחמה, הלחמה, שטף, טינרכללהלחמת 26 כבלי AWG לשקעי נקבה (המתאימים לפיני מגע זכריים relia-tac) ותקעים דו-קוטביים
מבודדי גירוי x 4WPI InternationalA365יחידות אלו פועלות על סוללות אלקליין 16-9V; גרסה נטענת מתאימה (A365R) זמינה
www.wpiinc.com
כבל אלקטרודה תלת-קוטבי עבור קומוטטור SL3C x 4פלסטיק אחד, בע"מ335-335 80 ס"מ TT3 Cמספק קצה תקע ל-EMG headstage על חולדה ולקומוטטור; יש לשנות
www.plastics1.com
נורות LED USB x 4כלנורות מבוססות USB אינן גורמות ל"רעש" חשמלי עם אותות ה-EMG מהחולדות
www.plastics1.com
webcams x 4, תוכנת מעקבכל
מחשב מחשב המריץ מערכת הפעלה MS Windowsכל
משוננים משוננים מכשירי ניתן ניתן להחליף; שאינו נושם מחדש גדול חומר חיטוי אנטי מיקרוביאלי מכשיר *אם מערכת ותוכנה JSA Designs N/A קנייני ומותאם אישית למעבדת מחקר ניתן להחליף חבילה מותאמת אישית מלאה x 4

מקורות

  1. Jones, K. L., Smith, D. W. Recognition of the fetal alcohol syndrome in early infancy. Lancet. 2, 999-1001 (1973).
  2. Stratton, K. R., Howe, C. J., Battaglia, F. C. Fetal alcohol syndrome: Diagnosis, epidemiology, prevention, and treatment. , National Academy Press. (1996).
  3. Streissguth, A. P., Barr, H. M., Martin, D. C., Herman, C. S. Effects of maternal alcohol, nicotine, and caffeine use during pregnancy on infant mental and motor development at eight months. Alcohol Clin Exp Res. 4 (2), 152-164 (1980).
  4. Streissguth, A. P., O'Malley, K. Neuropsychiatric implications and long-term consequences of fetal alcohol spectrum disorders. Semin Clin Neuropsychiatry. 5 (3), 177-190 (2000).
  5. May, P. A., et al. Prevalence and epidemiologic characteristics of FASD from various research methods with an emphasis on recent in-school studies. Dev Disabil Res Rev. 15 (3), 176-192 (2009).
  6. Sowell, E. R., et al. Mapping callosal morphology and cognitive correlates: Effects of heavy prenatal alcohol exposure. Neurology. 57 (2), 235-244 (2001).
  7. Sowell, E. R., et al. Abnormal development of the cerebellar vermis in children prenatally exposed to alcohol: Size reduction in lobules I-V. Alcohol Clin Exp Res. 20 (1), 31-34 (1996).
  8. Autti-Ramo, I., et al. MRI findings in children with school problems who had been exposed prenatally to alcohol. Dev Med Child Neurol. 44 (2), 98-106 (2002).
  9. Hamilton, D. A., Kodituwakku, P., Sutherland, R. J., Savage, D. D. Children with Fetal Alcohol Syndrome are impaired at place learning but not cued-navigation in a virtual Morris water task. Behav Brain Res. 143 (1), 85-94 (2003).
  10. Uecker, A., Nadel, L. Spatial but not object memory impairments in children with fetal alcohol syndrome. Am J Ment Retard. 103 (1), 12-18 (1998).
  11. Uecker, A., Nadel, L. Spatial locations gone awry: object and spatial memory deficits in children with fetal alcohol syndrome. Neuropsychologia. 34 (3), 209-223 (1996).
  12. Goodlett, C. R., Lundahl, K. R. Temporal determinants of neonatal alcohol-induced cerebellar damage and motor performance deficits. Pharmacol Biochem Behav. 55 (4), 531-540 (1996).
  13. Goodlett, C. R., Kelly, S. J., West, J. R. Early postnatal alcohol exposure that produces high blood alcohol levels impairs development of spatial navigation learning. Psychobiol. 15, 64-74 (1987).
  14. Bayer, S. A., Altman, J., Russo, R. J., Zhang, X. Timetables of neurogenesis in the human brain based on experimentally determined patterns in the rat. Neurotoxicol. 14 (1), 83-144 (1993).
  15. Dobbing, J., Sands, J. Quantitative growth and development of human brain. Arch Dis Child. 48 (10), 757-767 (1973).
  16. West, J. R. Fetal alcohol-induced brain damage and the problem of determining temporal vulnerability: A review. Alcohol Drug Res. 7 (5-6), 423-441 (1987).
  17. Zecevic, N., Rakic, P. Differentiation of Purkinje cells and their relationship to other components of developing cerebellar cortex in man. J Comp Neurol. 167, 27-48 (1976).
  18. Rufer, E. S., et al. Adequacy of maternal iron status protects against behavioral, neuroanatomical, and growth deficits in fetal alcohol spectrum disorders. PLoS One. 7 (10), e47499(2012).
  19. Tran, T. D., Kelly, S. J. Critical periods for ethanol-induced cell loss in the hippocampal formation. Neurotoxicol Teratol. 25 (5), 519-528 (2003).
  20. Pierce, D. R., Goodlett, C. R., West, J. R. Differential neuronal loss following early postnatal alcohol exposure. Teratology. 40 (2), 113-126 (1989).
  21. Tran, T. D., Jackson, H. J., Horn, K. H., Goodlett, C. R. Vitamin E does not protect against neonatal ethanol-induced cerebellar damage or deficits in eyeblink classical conditioning in rats. Alcohol Clin Exp Res. 29 (1), 117-129 (2005).
  22. Goodlett, C. R., Peterson, S. D., Lundahl, K. R., Pearlman, A. D. Binge-like alcohol exposure of neonatal rats via intragastric intubation induces both Purkinje cell loss and cortical astrogliosis. Alcohol Clin Exp Res. 21 (6), 1010-1017 (1997).
  23. Green, J. T., Tran, T. D., Steinmetz, J. E., Goodlett, C. R. Neonatal ethanol produces cerebellar deep nuclear cell loss and correlated disruption of eyeblink conditioning in adult rats. Brain Res. 956, 302-311 (2002).
  24. Cronise, K., Marino, M. D., Tran, T. D., Kelly, S. J. Critical periods for the effects of alcohol exposure on learning in rats. Behav Neurosci. 115 (1), 138-145 (2001).
  25. Tran, T. D., Cronise, K., Marino, M. D., Jenkins, W. J., Kelly, S. J. Critical periods for the effects of alcohol exposure on brain weight, body weight, activity and investigation. Behav Brain Res. 116 (1), 99-110 (2000).
  26. Steinmetz, J. E. Brain substrates of classical eyeblink conditioning: A highly localized but also distributed system. Behav Brain Res. 110 (1-2), 13-24 (2000).
  27. Thompson, R. F. The neurobiology of learning and memory. Science. 233 (4767), 941-947 (1986).
  28. Ivkovich, D., Eckerman, C. O., Krasnegor, N. A., Stanton, M. E. Eyeblink classical conditioning: Vol. 1 Applications in humans. Woodruff-Pak, D. S., Steinmetz, J. E. , Kluwer Academic Publishers. 119-142 (2000).
  29. Woodruff-Pak, D. S., Steinmetz, J. E. Eyeblink classical conditioning: Volume I - Applications in humans. , Kluwer Academic Publishers. (2000).
  30. Woodruff-Pak, D. S., Steinmetz, J. E. Eyeblink classical conditioning: Volume II - Animal models. , Kluwer Academic Publishers. (2000).
  31. Kishimoto, Y., et al. Implicit Memory in Monkeys: Development of a Delay Eyeblink Conditioning System with Parallel Electromyographic and High-Speed Video Measurements. PLoS One. 10 (6), e0129828(2015).
  32. Chen, L., Bao, S., Lockard, J. M., Kim, J. K., Thompson, R. F. Impaired classical eyeblink conditioning in cerebellar-lesioned and Purkinje cell degeneration (pcd) mutant mice. J Neurosci. 16 (8), 2829-2838 (1996).
  33. Freeman, J. H. Jr, Carter, C. S., Stanton, M. E. Early cerebellar lesions impair eyeblink conditioning in developing rats: Differential effects of unilateral lesions on postnatal day 10 or 20. Behav Neurosci. 109 (5), 893-902 (1995).
  34. Gerwig, M., et al. Trace eyeblink conditioning in patients with cerebellar degeneration: Comparison of short and long trace intervals. Exp Brain Res. 187 (1), 85-96 (2008).
  35. LaBar, K. S., Disterhoft, J. F. Conditioning, awareness, and the hippocampus. Hippocampus. 8 (6), 620-626 (1998).
  36. McCormick, D. A., Steinmetz, J. E., Thompson, R. F. Lesions of the inferior olivary complex cause extinction of the classically conditioned eyeblink response. Brain Res. 359 (1-2), 120-130 (1985).
  37. Clark, R. E., Zola, S. Trace eyeblink classical conditioning in the monkey: a nonsurgical method and behavioral analysis. Behav Neurosci. 112 (5), 1062-1068 (1998).
  38. Anderson, B. J., Steinmetz, J. E. Cerebellar and brainstem circuits involved in classical eyeblink conditioning. Rev Neurosci. 5 (3), 251-273 (1994).
  39. Thompson, R. F., Krupa, D. J. Organization of memory traces in the mammalian brain. Annu Rev Neurosci. 17, 519-549 (1994).
  40. Miller, M. J., et al. fMRI of the conscious rabbit during unilateral classical eyeblink conditioning reveals bilateral cerebellar activation. J Neurosci. 23 (37), 11753-11758 (2003).
  41. Geinisman, Y., et al. Remodeling of hippocampal synapses after hippocampus-dependent associative learning. J Comp Neurol. 417 (1), 49-59 (2000).
  42. Ivkovich, D., Stanton, M. E. Effects of early hippocampal lesions on trace, delay, and long-delay eyeblink conditioning in developing rats. Neurobiol Learn Mem. 76 (3), 426-446 (2001).
  43. Moyer, J. R. Jr, Deyo, R. A., Disterhoft, J. F. Hippocampectomy disrupts trace eye-blink conditioning in rabbits. Behav Neurosci. 104 (2), 243-252 (1990).
  44. Solomon, P. R., Vander Schaaf, E. R., Thompson, R. F., Weisz, D. J. Hippocampus and trace conditioning of the rabbit's classically conditioned nictitating membrane response. Behav Neurosci. 100 (5), 729-744 (1986).
  45. Kronforst-Collins, M. A., Disterhoft, J. F. Lesions of the caudal area of rabbit medial prefrontal cortex impair trace eyeblink conditioning. Neurobiol Learn Mem. 69 (2), 147-162 (1998).
  46. Weible, A. P., McEchron, M. D., Disterhoft, J. F. Cortical involvement in acquisition and extinction of trace eyeblink conditioning. Behav Neurosci. 114 (6), 1058-1067 (2000).
  47. Thomas, J. D., Tran, T. D. Choline supplementation mitigates trace, but not delay, eyeblink conditioning deficits in rats exposed to alcohol during development. Hippocampus. 22 (3), 619-630 (2012).
  48. West, J. R., Hamre, K. M., Pierce, D. R. Delay in brain growth induced by alcohol in artificially reared rat pups. Alcohol. 1 (3), 213-222 (1984).
  49. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. J Vis Exp. (20), e880(2008).
  50. Christian, K. M., Thompson, R. F. Neural substrates of eyeblink conditioning: acquisition and retention. Learn Mem. 10 (6), 427-455 (2003).
  51. Kishimoto, Y., Nakazawa, K., Tonegawa, S., Kirino, Y., Kano, M. Hippocampal CA3 NMDA receptors are crucial for adaptive timing of trace eyeblink conditioned response. J Neurosci. 26 (5), 1562-1570 (2006).
  52. Shors, T. J., et al. Neurogenesis in the adult is involved in the formation of trace memories. Nature. 410 (6826), 372-376 (2001).
  53. Tran, T. D., Stanton, M. E., Goodlett, C. R. Binge-like ethanol exposure during the early postnatal period impairs eyeblink conditioning of short and long CS-US intervals in rats. Dev Psychobiol. 49 (6), 589-605 (2007).
  54. Mizumori, S. J., Yeshenko, O., Gill, K. M., Davis, D. M. Parallel processing across neural systems: Implications for a multiple memory system hypothesis. Neurobiol Learn Mem. 82 (3), 278-298 (2004).
  55. Siegel, J. J., et al. Trace Eyeblink Conditioning in Mice Is Dependent upon the Dorsal Medial Prefrontal Cortex, Cerebellum, and Amygdala: Behavioral Characterization and Functional Circuitry(1,2,3). eNeuro. 2 (4), (2015).
  56. Murawski, N. J., Jablonski, S. A., Brown, K. L., Stanton, M. E. Effects of neonatal alcohol dose and exposure window on long delay and trace eyeblink conditioning in juvenile rats. Behav Brain Res. 236 (1), 307-318 (2013).
  57. Lindquist, D. H. Hippocampal-dependent Pavlovian conditioning in adult rats exposed to binge-like doses of ethanol as neonates. Behav Brain Res. 242, 191-199 (2013).
  58. Ivarsson, M., Svensson, P. Conditioned eyeblink response consists of two distinct components. J Neurophysiol. 83 (2), 796-807 (2000).
  59. Woodruff-Pak, D. S., Lavond, D. G., Thompson, R. F. Trace conditioning: abolished by cerebellar nuclear lesions but not lateral cerebellar cortex aspirations. Brain Res. 348 (2), 249-260 (1985).
  60. Takehara-Nishiuchi, K. The Anatomy and Physiology of Eyeblink Classical Conditioning. Curr Top Behav Neurosci. , (2016).
  61. Mattson, S. N., Schoenfeld, A. M., Riley, E. P. Teratogenic effects of alcohol on brain and behavior. Alcohol Res Health. 25 (3), 185-191 (2001).
  62. Goodfellow, M. J., Abdulla, K. A., Lindquist, D. H. Neonatal Ethanol Exposure Impairs Trace Fear Conditioning and Alters NMDA Receptor Subunit Expression in Adult Male and Female Rats. Alcohol Clin Exp Res. 40 (2), 309-318 (2016).
  63. Beylin, A. V., et al. The role of the hippocampus in trace conditioning: Temporal discontinuity or task difficulty? Neurobiol Learn Mem. 76 (3), 447-461 (2001).
  64. Port, R. L., Romano, A. G., Steinmetz, J. E., Mikhail, A. A., Patterson, M. M. Retention and acquisition of classical trace conditioned responses by rabbits with hippocampal lesions. Behav Neurosci. 100 (5), 745-752 (1986).
  65. Weiss, C., Bouwmeester, H., Power, J. M., Disterhoft, J. F. Hippocampal lesions prevent trace eyeblink conditioning in the freely moving rat. Behav Brain Res. 99 (2), 123-132 (1999).
  66. Brown, S. M., et al. Eyeblink conditioning deficits indicate timing and cerebellar abnormalities in schizophrenia. Brain Cogn. 58 (1), 94-108 (2005).
  67. Sears, L. L., Steinmetz, J. E. Effects of haloperidol on sensory processing in the hippocampus during classical eyeblink conditioning. Psychopharmacology. 130 (3), 254-260 (1997).
  68. Kronforst-Collins, M. A., Moriearty, P. L., Schmidt, B., Disterhoft, J. F. Metrifonate improves associative learning and retention in aging rabbits. Behav Neurosci. 111 (5), 1031-1040 (1997).
  69. Woodruff-Pak, D. S., Finkbiner, R. G., Sasse, D. K. Eyeblink conditioning discriminates Alzheimer's patients from non-demented aged. Neuroreport. 1 (1), 45-48 (1990).
  70. Oristaglio, J., Romano, A. G., Harvey, J. A. Amphetamine influences conditioned response timing and laterality of anterior cingulate cortex activity during rabbit delay eyeblink conditioning. Neurobiol Learn Mem. 92 (1), 1-18 (2009).
  71. Scavio, M. J., Clift, P. S., Wills, J. C. Posttraining effects of amphetamine, chlorpromazine, ketamine, and scopolamine on the acquisition and extinction of the rabbit's conditioned nictitating membrane response. Behav Neurosci. 106 (6), 900-908 (1992).
  72. Fortier, C. B., et al. Delay discrimination and reversal eyeblink classical conditioning in abstinent chronic alcoholics. Neuropsychology. 22 (2), 196-208 (2008).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים