Method Article

נוירונים הדמיה בתוך חלקים במוח עבים שימוש בשיטת גולגי-קוקס

DOI:

10.3791/55358

⸱

April 18th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College, University of Guelph

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול בשיטת מכתים גולגי-קוקס בסעיפי מוח עבים, כדי להמחיש נוירונים עם עצי דנדריטים ארוכים בתוך דגימות רקמה אחת. שתי גרסאות של פרוטוקול זה גם מוצגים שכוללות counterstaining סגול cresyl, והקפאת המוח מעובד עבור אחסון לטווח ארוך.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטת גולגי-קוקס של מכתים נוירון הועסקה במשך יותר ממאתיים שנים כדי לקדם את ההבנה שלנו של מורפולוגיה הנוירון בתוך דגימות מוח היסטולוגית. אמנם עדיף מנקודת מבט מעשי להכין חלקים במוח על העובי הרב ככל האפשר, על מנת להגדיל את ההסתברות לזיהוי נוירונים צבעונית כלולות מלאות בקטעים בודדים, גישה זו היא מוגבלת מבחינה טכנית על ידי מרחק העבודה של גבוה -magnification מטרות מיקרוסקופ. אנו מדווחים כאן פרוטוקול להכתים נוירונים בשיטת גולגי-קוקס בסעיפים המוח העכבר כי נחתכות על עובי 500 מיקרומטר, וכדי להמחיש נוירונים ברחבי עומק סעיפים אלה באמצעות מיקרוסקופ זקוף מצויד סיליקון 30X ברזולוציה גבוהה 1.05 NA מטרת נפט טבילה כי יש מרחק עבודת 800 מיקרומטר. בנוסף, אנו מדווחים שתי הגירסות שימושיות של פרוטוקול זה שעשוי להיות מועסק על מנת counterstain פני השטח שלרכוב חלקים במוח עם כתם Nissl סגול cresyl, או להקפיא את המוח כולו עבור אחסון לטווח ארוך לפני חתך ועיבוד סופי. הפרוטוקול העיקרי ושתי גרסותיה לייצר חלקים במוח עבים צבעוניים, ברחבי אשר עצי דנדריטים נוירון מלאים קוצי דנדריט ניתן דמיינו בצורה מהימנה לכמת.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה של נוירונים בודדים בתוך דגימות רקמה מאפשר לניתוח באתרו של מאפיינים מורפולוגיים נוירון, אשר באופן משמעותי קידם את ההבנה שלנו של המוח ואיך זה עלול להיות מושפע המחלה אנדוגניים או גורמים סביבתיים חיצוניים. השיטה המכתימה גולגי-קוקס היא אמצעי פשוט יחסית, חסכוני של מכתים מדגם אקראי של תאי עצב במוח. ראשון שפותח על ידי גולגי 1 ו שונה על ידי קוקס 2 בשנת 1800, חוקר מעודן יותר טכניקה זו לאורך השנים לייצר ברור, נוירונים גם בכתמי רטיבות, יכול לשמש כדי לחזות ולכמת הוא מורפולוגיה עץ הדנדריטים וצפיפות עמוד שדרת 3, 4,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עכברות CD1-זן למבוגרים שימשו במחקר זה. מכתים דומה ניתן להשיג באמצעות שני המינים בגילאים שונים. חיות ניסוי טופלו על פי העקרונות והקווים המנחים של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי החיים, וכן את פרוטוקול הניסוי אושר על ידי האוניברסיטה של ​​ועדת Care Guelph Animal.

1. גולגי-קוקס מכתים

  1. גולגי-קוקס הספגה של מוח
    1. הפוך הפתרון גולגי-קוקס של 1% (w / v) dichromate אשלגן, 0.8% (w / v)....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול מכתים גולגי-קוקס זה והגירסות האופציונליות שניית תיאר שלה עשויים להיות מועסקים על מנת להמחיש נוירונים בודדים בתוך 400 - 500 מיקרומטר חלקים במוח עבה. מצרפי תמונה נציג תחזיות-Z דו ממדים שנתפסו באמצעות מטרת 10X ו 5 מיקרומטר שלבי ציר Z מוצגים באיור 1: A1 - C1 עבור שטח גדול של חלקים במוח עטרה הכולל באזור קליפת המוח הקדמי cingulate 1 ואת הקורטקס המוטורי משנית 18. סעיפים נחתכו ב 500 מיקרומטר. שים לב וריאנט .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים כאן פרוטוקול מכתים גולגי-קוקס יחד עם שתי הגירסות שימושיות המאפשרים הדמיה נוירונים בתוך חלקים במוח עבים. כפי שניתן לראות תוצאות הנציג, השימוש מטרה ברזולוציה גבוהה כי יש מרחק 800 מיקרומטר עבודה ארוך מאפשר הדמיה של נוירונים אמינות כולו ברחבי העומק חלק במוח לחתוך ב 500 מיקרומטר. מחקר זה של חלקים במוח עבים יחסית מגדיל את ההסתברות כי נוירונים מוכתמים מכל סוג מוכלים במלואם בתוך הפרוסה, אשר חשובה במיוחד עבור עצב פירמידליים עם עצי דנדריט פסגה ארוכים ומסובכים. לדוגמא, בסעיפי עטרה.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי דיסקברי גרנט כדי CDCB מן למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC), מענק התשתית המחקרית קרן מנהיגים ג'ון ר אוונס כדי CDCB מקנדה קרן חדשנות (מספר הפרוייקט CFI 30,381), ועל ידי דיסקברי גרנט כדי NJM מן NSERC. ELL נתמכה על ידי מלגת בוגר אונטריו ידי מלגות OVC מהמכללה וטרינרית אונטריו באוניברסיטת Guelph. CDS נתמכה על ידי משרת אסיסטנט מחקר סטודנט לתואר ראשון מ NSERC. ALM נתמכה על ידי מלגת אלכסנדר גרהם בל מ NSERC ועל ידי מלגות OVC מהמכללה וטרינרית אונטריו באוניברסיטת Guelph.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
אשלגן דיכרומטפישר סיינטיפיקP188-100
אשלגן כרומטפישר סיינטיפיקP220-100
כלוריד כספיפישר סיינטיפיקS25423מסוכן
ווטמן דרגה 1 נייר סינוןפישר סיינטיפיק1001-185
איזופלורןשותפים פרמצבטיים של קנדה
CP0406V2 בקבוקון נצנוץ 20 מ"לפישר סיינטיפיק03-337-4
סוכרוזביושופ קנדהSUC700.1
נתרן פוספט מונו-בסיסיסיגמא אולדריץ'S5011-500G
נתרן פוספט דיבסיסיגמא אולדריץ'S9390-500G
50 מ"ל צינור חרוטיפישר סיינטיפיק12-565-271
איזופנטןפישר סיינטיפיקAC126470010הידוע גם בשם 2-מתילבוטן; אגר מסוכן
סיגמא אולדריץ'A1296-100G
צלחת משקל קטנהפישר סיינטיפיק02-202-100
ויברטוםLeicaVT1000 S
צלחות תרבית רקמות 6 בארותפישר סיינטיפיק08-772-1b
רשת תחתית תרבית רקמה מוסיפהפישר סיינטיפיק07-200-214
פרפורמאדלהייד (PFA), 16%מיקרוסקופ אלקטרונים מדעי15710-S
אמוניום הידרוקסידפישר סיינטיפיקA669S-500קודאק מסוכן
קיבוע Aסיגמא אולדריץ'P7542
סופרפרוסט פלוס שקופיותפישר סיינטיפיק12-550-15
סוכן ניקוי CitroSolvפישר סיינטיפיק22-143-975
אלכוהול אתילי נטול מיםאלכוהול מסחריN/A
סגול קרזילסיגמא אולדריץ'C1791
permountפישר סיינטיפיקSP15-100
מיקרוסקופ זקוףדגם
אולימפוס BX53מצלמה צבעונית, 12 סיביותMBF BiosciencesDV-47dQחלק מגמה 01-MBF-2000R-F-CLR-12
שלב מיקרוסקופ ממונע תלת מימדי, בקר ואנודריםMBF BiosciencesN/Aמסופק ומשולב עם מיקרוסקופ על ידי MBF Biosciences
4X מיקרוסקופ אובייקטיביאולימפוס4x 0.16 N.A. UplanSApo
10X מיקרוסקופ אובייקטיביאולימפוס10x 0.3 N.A. UPlan FL N 
מיקרוסקופ 30X אובייקטיביאולימפוס30x 1.05 N.A. UPlanSApo 
60X מיקרוסקופ אובייקטיביאולימפוס60x 1.42 N.A. PlanAPO N
שמן טבילה סיליקוןאולימפוסZ-81114
תוכנת NeurolucidaMBF Biosciencesגרסה 10
תוכנת ImageJהמכונים הלאומיים לבריאות בארה"גרסה נוכחיתעם התוסף OME Bio-Formats מותקנת
תוכנתפוטושופAdobeגרסה CS6
מסוכן מסוכן מסוכן ב

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Golgi, C. Sulla struttura della sostanza grigia del cervello. Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).
  2. Cox, W. H. Imprägnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen. Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).
  3. Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox Staining Step by Step....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Golgi Cox MethodNeuron StainingThick Brain SectionsSilicone Oil ImmersionCresyl Violet StainBrain SectioningVibratome SectioningImage Stack AcquisitionDendritic Tree VisualizationSpine Density Analysis

Related Articles