מאמר שיטה

נוירונים הדמיה בתוך חלקים במוח עבים שימוש בשיטת גולגי-קוקס

DOI:

10.3791/55358

⸱

18 באפריל 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College, University of Guelph

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול בשיטת מכתים גולגי-קוקס בסעיפי מוח עבים, כדי להמחיש נוירונים עם עצי דנדריטים ארוכים בתוך דגימות רקמה אחת. שתי גרסאות של פרוטוקול זה גם מוצגים שכוללות counterstaining סגול cresyl, והקפאת המוח מעובד עבור אחסון לטווח ארוך.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטת גולגי-קוקס של מכתים נוירון הועסקה במשך יותר ממאתיים שנים כדי לקדם את ההבנה שלנו של מורפולוגיה הנוירון בתוך דגימות מוח היסטולוגית. אמנם עדיף מנקודת מבט מעשי להכין חלקים במוח על העובי הרב ככל האפשר, על מנת להגדיל את ההסתברות לזיהוי נוירונים צבעונית כלולות מלאות בקטעים בודדים, גישה זו היא מוגבלת מבחינה טכנית על ידי מרחק העבודה של גבוה -magnification מטרות מיקרוסקופ. אנו מדווחים כאן פרוטוקול להכתים נוירונים בשיטת גולגי-קוקס בסעיפים המוח העכבר כי נחתכות על עובי 500 מיקרומטר, וכדי להמחיש נוירונים ברחבי עומק סעיפים אלה באמצעות מיקרוסקופ זקוף מצויד סיליקון 30X ברזולוציה גבוהה 1.05 NA מטרת נפט טבילה כי יש מרחק עבודת 800 מיקרומטר. בנוסף, אנו מדווחים שתי הגירסות שימושיות של פרוטוקול זה שעשוי להיות מועסק על מנת counterstain פני השטח שלרכוב חלקים במוח עם כתם Nissl סגול cresyl, או להקפיא את המוח כולו עבור אחסון לטווח ארוך לפני חתך ועיבוד סופי. הפרוטוקול העיקרי ושתי גרסותיה לייצר חלקים במוח עבים צבעוניים, ברחבי אשר עצי דנדריטים נוירון מלאים קוצי דנדריט ניתן דמיינו בצורה מהימנה לכמת.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה של נוירונים בודדים בתוך דגימות רקמה מאפשר לניתוח באתרו של מאפיינים מורפולוגיים נוירון, אשר באופן משמעותי קידם את ההבנה שלנו של המוח ואיך זה עלול להיות מושפע המחלה אנדוגניים או גורמים סביבתיים חיצוניים. השיטה המכתימה גולגי-קוקס היא אמצעי פשוט יחסית, חסכוני של מכתים מדגם אקראי של תאי עצב במוח. ראשון שפותח על ידי גולגי 1 ו שונה על ידי קוקס 2 בשנת 1800, חוקר מעודן יותר טכניקה זו לאורך השנים לייצר ברור, נוירונים גם בכתמי רטיבות, יכול לשמש כדי לחזות ולכמת הוא מורפולוגיה עץ הדנדריטים וצפיפות עמוד שדרת 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9.

שיקול טכני עיקרי עבור להדמיה של נוירונים מוכתמים בתוך חלקים במוח הוא עובי הפרוסה המרבי, אשר מוגבל על ידי מרחק העבודה של מטרות מיקרוסקופ גבוהה הגדלה זמינות / ברזולוציה גבוהה. מטרות נפט טבילה נפוצות 60 - 100X טווחים מהוות ברזולוציה מעולה, אבל הם מוגבלות על ידי מרחקי העבודה שלהם, כי הם בדרך כלל לא יותר מ 200 מיקרומטר. חלקים במוח לחתוך בטווח 200 מיקרומטר יכול להיות מספיק כדי להמחיש סוגי נוירונים מסוימים שיכולים להיות בתוך עובי פרוסה זה, עבור עצב פירמידליים למשל בשכבות רדודות של קליפת המוח 10, 11, 12, עצב פירמידליים באזור CA1 של 13, 14 בהיפוקמפוס, וכן תאי גרגיר של gyrus המשוננת של ההיפוקמפוס 15. נוירונים עם יחסית יותרהעצים הדנדריטים, כגון עצב פירמידליים בתוך רבדים עמוקים של קליפת המוח כי לעכבר יכול להאריך יותר מ 800 מיקרומטר מגוף התא 16, מספקים אתגר גדול כי המוח היה צריך להיות מחולק בזווית מושלמת להכיל את העץ דנדריט כולו בתוך 200 מיקרומטר פרוסות. זה לא יכול אפילו להיות ריאלי אם דנדריט או כל ענפיו להאריך בכיוון המקורי או זנב. למרות זאת, ניתן להתייחס מגבלה זו על ידי התחקות נוירון בקטעים שונים במוח מרובים הסמוכים, גישה זו מציבה אתגר טכני משמעותי יישור הסעיפים במדויק עבור התחקות 17. גישה מעשית יותר תהיה לדמיין נוירונים כולו בתוך חלקים במוח כי נחתכים על עובי גדול יותר.

אנו מדווחים כאן טכניקה להכתים נוירונים בתוך 400 - 500 מיקרומטר חלקים במוח עבה של עכברים באמצעות שיטת גולגי-קוקס, וכדי להמחיש mo שלהםrphology באמצעות טבילה אובייקטיבי שמן סיליקון ברזולוציה גבוהה כי יש מרחק עבודה 800 מיקרומטר. פרוטוקול גולגי-קוקס ההספגה ועיבוד שאנחנו מתארים משתנה מאחד הפרוטוקולים המודרניים ביותר המצוטטים בספרות 6. הגישה שלנו עם חלקים במוח עבים מספקת את היתרון של הגדלת ההסתברות של זיהוי נוירונים מכל סוג כלול במלואה בתוך הקטע. בנוסף הפרוטוקול העיקרי, אנו נוכחים גם שתי וריאציות המספקות יתרונות ייחודיים: (1) מכתים גולגי-קוקס עם counterstain הסגול cresyl על פני השטח של חלקים רכובים, על מנת להגדיר גבולות אזורים במוח כדי לזהות שכבות של קליפת המוח, ו (2) מכתים גולגי-קוקס עם צעד הקפאה ביניים עבור אחסון לטווח ארוך של המוח כולו ספוג לפני חתך ועיבוד סופי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עכברות CD1-זן למבוגרים שימשו במחקר זה. מכתים דומה ניתן להשיג באמצעות שני המינים בגילאים שונים. חיות ניסוי טופלו על פי העקרונות והקווים המנחים של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי החיים, וכן את פרוטוקול הניסוי אושר על ידי האוניברסיטה של ​​ועדת Care Guelph Animal.

1. גולגי-קוקס מכתים

  1. גולגי-קוקס הספגה של מוח
    1. הפוך הפתרון גולגי-קוקס של 1% (w / v) dichromate אשלגן, 0.8% (w / v) כרומטי אשלגן 1% (w / v) כלוריד כספיתי ידי המסת dichromate אשלגן כרומטי אשלגן לתוך מים באיכות גבוהה בנפרד . מערבבים הפתרונות, להוסיף את כלוריד כספיתי ולסנן את הפתרון הסופי באמצעות נייר פילטר כיתה 1. אחסן את הפתרון בחושך עד חודש אחד.
    2. להרדים את העכבר באמצעות isoflurane 5%.
    3. להרדים את העכבר על ידי עריפת ראש ובמהירות להסיר את המוח.
    4. מניחים את המוח לתוך בקבוקון הנצנץ זכוכית 20 מ"ל המכיל 17 מ"ל של תמיסת גולגי-קוקס דגירה בחושך ב RT עבור 25 ד.
    5. Cryoprotect המוח על ידי הצבת אותו לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל המכיל 40 מ"ל של cryoprotectant סוכרוז (30% (w / v) סוכרוז במאגר פוספט 0.1 M, pH 7.4) בחושך ב 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
      הערה: שלושת הצעדים האופציונליים הבאים עשוי להיות מועסק כאלטרנטיבה הפרוטוקול העיקרי, על מנת להקפיא את המוח בשלב זה עבור אחסון לטווח ארוך.
    6. להקפיא את המוח כולו על ידי טבילה אותו לתוך 200 מ"ל איזופנטאן כי כבר precooled על קרח יבש.
    7. מניחים את המוח הקפוא לתוך צינור וחנות חרוטי 50 מ"ל בחושך ב -80 מעלות צלזיוס.
    8. כאשר מוכן להמשיך, להפשיר את המוח על ידי הצבת אותו לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל המכיל 40 מ"ל של cryoprotectant סוכרוז בחושך ב 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  2. מוח חתך
    1. הסר את המוח מן סוכרוז גושk זה עבור חתך ידי ניתוק המוחון באמצעות סכין גילוח ולהשאיר יתרון שטוח בסוף הזנב הנותר של המוח.
    2. אגר חום (3% (w / v) במים) עד שהוא נמס ומצננים עד שהוא מעט מעל נקודת ההיתוך שלה.
    3. מניח את המוח בצלחת לשקול הפנויה קטנה עם מטה פנים סוף הזנב שלה ולהוסיף כמות מספקת של אגר המומס כדי לכסות את המוח.
    4. לאחר אגר יש הקרושה, לקצץ אגר עודף עוזב כ 2 - 4 מ"מ המקיפים את המוח ואת הדבק המוח לשלב של vibratome עם הפנים כלפי מטה סוף הזנב שלה באמצעות כמות קטנה של דבק cyanoacrylate אתיל.
    5. מלא את אזור הבמה של vibratome עם כמות מספקת של cryoprotectant סוכרוז כדי לכסות את המוח, וסעיף המוח בכל עובי פרוס 400 - 500 מיקרומטר (תלויים באזור במוח להיבחן) באמצעות תדר רטט של 86 רץ מהיר התקדמות להב של 0.125 מ"מ / s.
    6. בעזרת מברשת צבע קטנההמוח במקום, סעיפים לתוך באר של צלחת בתרבית רקמה 6-היטב המכיל מוסיף רשת-bottom-זמינים מסחרית מראש מלא 10 מ"ל של 6% (w / v) סוכרוז במאגר 0.1 M פוספט, pH 7.4.
    7. סעיפי דגירה בחושך ב 4 ° CO / N.
  3. פיתוח חלק במוח
    1. שימוש מוסיף התחתונה רשת, להעביר חלקים במוח לתוך באר חדשה המכילה 5 מ"ל של 2% (w / v) paraformaldehyde (ה.ה.ר.) במאגר 0.1 M פוספט, pH 7.4. דגירה על כיסא נדנדה נעה במהירות איטית בחושך ב RT עבור 15 דקות.
    2. לשטוף חלקים פעמים באמצעות העביר בארות חדשות המכילות 5 מיליליטר מים. לשטוף על כיסא נדנדה נעה במהירות בינונית בחושך ב RT עבור 5 דקות.
    3. העברת חלקים לתוך באר חדשה המכילה 5 מ"ל של 2.7% (v / v) אמוניום הידרוקסיד. דגירה על כיסא נדנדה נעה במהירות איטית בחושך ב RT עבור 15 דקות.
    4. לשטוף חלקים פעמים באמצעות העביר בארות חדשות המכילות 5 מיליליטר מים. לשטוף oנה רוקר נע במהירות בינונית בחושך ב RT עבור 5 דקות.
    5. חלקים העבירו לתוך באר חדשה המכיל 5 מיליליטר של המקבע A (ראו טבלת חומרים) כי כבר מדוללים 10x מים מן הריכוז שנרכש מקורי. דגירה על כיסא נדנדה נעה במהירות איטית בחושך ב RT עבור 25 דקות.
    6. לשטוף חלקים פעמים באמצעות העביר בארות חדשות המכילות 5 מיליליטר מים. לשטוף על כיסא נדנדה נעה במהירות בינונית בחושך ב RT עבור 5 דקות.
  4. הרכבה חלקה במוח
    1. בעזרת מברשת צבע קטנה, הר חלק על גבי שקופיות מיקרוסקופ. הסרת עודפי מים אגרו באמצעות פינצטה רקמה קטנה. ודא כי כל אגר יוסר לפני שתמשיך עם התייבשות.
    2. אפשר סעיפים לאוויר יבש ב RT במשך כ 45 דקות (400 מיקרומטר חלקים) או 90 דקות (500 מיקרומטר חלקים).
      הערה: התזמון נכון רמת היובש היא קריטית, ואולי צריכה להיקבע בכלמעבדה תלוי בטמפרטורת הסביבה ורמת הלחות. זמן קצר מדי ייבוש מוביל סעיפי נפילה של שקופיות במהלך שלבי התייבשות עקב, וארוך מדי זמן ייבוש מוביל סעיפי פיצוח. סעיפים ימשיכו להיראות מבריק ברמה של יובש המתאימה.
    3. חלקים כתמים סגול cresyl ידי צבת שקופיות לצנצנות מכתימות Coplin כמצוין.
      הערה: צעד אופציונאלי זה עשוי להיות מועסק על סעיפים שמעולם לא קפוא, כדי להכתים גרעינים עצביים עם סגול cresyl. מצאנו כי סליקת rehydrating סעיפים לפני הדגירה ב סגול cresyl מובילה גם מכתימה ורקע נמוך בקטעים שונים.
      1. מניחים בקרחת סוכן עבור 5 דקות. חזור פעם אחת.
      2. מניחים באתנול 100% עבור 5 דקות. חזור פעם אחת.
      3. מניחים באתנול 95% במים, אז 75% אתנול במים, ולאחר מכן אתנול 50% במים במשך 2 דקות כל אחד.
      4. מניחים במים למשך 5 דקות.
      5. מניחים ב 0.5% (w / v) creסגול סיל במים למשך 7 דקות.
      6. מניחים במים במשך 2 דקות. חזור פעם אחת.
    4. מייבשי סעיפים ידי צבת שקופיות לצנצנות מכתימות Coplin כמצוין.
      1. מניחים באתנול 50% במים, אז 75% אתנול במים, ולאחר מכן אתנול 95% במים במשך 2 דקות כל אחד.
      2. מניחים באתנול 100% עבור 5 דקות. חזור פעם אחת.
      3. מניחים בקרחת סוכן עבור 5 דקות. חזור פעם אחת.
        הערה: פעמים התייבשות וסליקה אלה מספיקים כדי לעבד מוח עכבר כמתואר בכתב היד הזה. עם זאת, ראינו עבור מינים אחרים כוללים חולדה cowbird, כי צעד הסליקה הסופי ייתכן שיהיה הצורך להאריך עד 15 דק 'בסה"כ.
    5. חלקי coverslip באמצעות מדיום הרכבה נטול מים.
    6. אפשר שקופיות לייבוש במאוזן בחושך ב RT לפחות ד 5.

2. הדמיה ויטראז נוירונים בתוך חלקים במוח עבים

  1. לכידת תמונה סטאקס
    1. הפעל את נורת מיקרוסקופ, מצלמה, ואת הבקר הבמה.
    2. פתח את תוכנת מיקרוסקופ (למשל, Neurolucida).
    3. מקום שקופית על במת מיקרוסקופ.
    4. צלם תמונת 2D בתצוגה רחבה של סעיף המוח באמצעות מטרה בהגדלה נמוכה כגון 0.4 1.25x NA PlanAPO או 4X 0.16 NA
      1. פוקוס התמונה ולהתאים הגדרות המצלמה כולל זמן חשיפה ואיזון לבן.
      2. צור נקודת התייחסות ידי לחיצה שמאלה בכל מקום על הסעיף
      3. צלם את התמונה על ידי בחירה "לרכוש תמונה אחת" בתוך חלון רכישת תמונה.
    5. לכידת ערימות תמונת האמצע ברזולוציה של האזור המכיל את הנוירונים (ים) של עניין, באמצעות מטרת 10X 0.3 NA UPlan FL N.
      1. מקדו את התמונה ולהתאים הגדרות המצלמה כולל חשיפה ואיזון לבן.
      2. קבע את הגבולות העליונים ותחתונים עבור מחסנית התמונה על ידי התמקדות לחלק העליון של המקטעnd בחירה "להגדיר" ליד "בראש הערימה" בתוך חלון רכישת תמונה, ולאחר מכן התמקדות לתחתית בסעיף ובחירה "להגדיר" שליד "בתחתית הערימה" בתוך חלון רכישת תמונה.
      3. הגדר את מרחק צעד 5 מיקרומטר ידי הזנה "5 מיקרומטר" ליד "מרחק בין תמונות" בתוך חלון רכישת תמונה.
      4. צלם את ערימת תמונה על ידי בחירה "ערימת תמונה לרכוש" בתוך חלון רכישת תמונה.
      5. חזור על השלבים לעיל כדי ללכוד את כל האזור של עניין, מוודא שכל ערימות התמונה חופפים ידי 10% לפחות ציר X לציר Y.
    6. לכידת ערימות תמונה ברזולוציה גבוהה של האזור המכיל הנוירון של עניין, באמצעות טבילה אובייקטיבי שמן סיליקון 30X 1.05 NA.
      1. החל 3 - 4 טיפות של שמן טבילת סיליקון לשקופית ולמקם את המטרה על השקופית, הבטיח ליצור קשר בין המטרה לבין אויl.
      2. מקדו את התמונה ולהתאים הגדרות המצלמה כולל חשיפה ואיזון לבן.
      3. קבע את הגבולות העליונים ותחתונים עבור מחסנית התמונה על ידי התמקדות לחלק העליון של הסעיף ובחירה "להגדיר" ליד "בראש הערימה" בתוך חלון רכישת תמונה, ולאחר מכן התמקדות לתחתית בסעיף ובחירה "להגדיר" ליד "בתחתית הערימה" בתוך חלון רכישת תמונה.
      4. הגדר את מרחק צעד 1 מיקרומטר ידי הזנה "1 מיקרומטר" ליד "מרחק בין תמונות" בתוך חלון רכישת תמונה.
      5. צלם את ערימת תמונה על ידי בחירה "ערימת תמונה לרכוש" בתוך חלון רכישת תמונה.
      6. חזור על השלבים לעיל כדי ללכוד את כל האזור של עניין, מוודא שכל ערימות התמונה חופפים ידי 10% לפחות ציר X לציר Y.
    7. שמור את קובץ הנתונים ולשמור את כל קבצי תמונה בפורמט TIFF עבור עיבוד חיצוני.
  2. יצירת תמונות הקרנת Z ו- Image מצרפים
    1. צור תמונות הקרנת Z ב ImageJ
      1. תוכנת ImageJ Open כי יש התוסף ביו-הפורמטים מותקנים.
      2. בחר "תוספים" -> "ביו-פורמטים" -> "יבואן ביו-פורמטים".
      3. בחר את קובץ ערימת התמונה להיפתח.
      4. לאחר שהקובץ נפתח, לשנות את הפורמט ל RGB על ידי בחירת "תמונה" -> "סוג" -> "צבע RGB".
      5. צור את הקרנת-Z על ידי בחירת "תמונה" -> "סטאקס" -> "פרויקט Z ...".
      6. שמור תמונה דו-ממדית Z-הקרנה כקובץ TIFF.
    2. צור מונטאז תמונה דו-ממדית של כל האזור של עניין.
      1. פתח את התוכנה (למשל, Adobe Photoshop).
      2. בחר "קובץ" -> "אוטומציה" -> "מיזוג תמונות".
      3. בחר "עיון" ולאחר מכן להוסיף את כל imagקבצי es ימוזגו.
      4. ודא כי "למזג את התמונות יחד" נבחרה ולאחר מכן בחר "אישור".
      5. שמור את תמונת מונטאז וכתוצאה של האזור כולו עניין כקובץ TIFF.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול מכתים גולגי-קוקס זה והגירסות האופציונליות שניית תיאר שלה עשויים להיות מועסקים על מנת להמחיש נוירונים בודדים בתוך 400 - 500 מיקרומטר חלקים במוח עבה. מצרפי תמונה נציג תחזיות-Z דו ממדים שנתפסו באמצעות מטרת 10X ו 5 מיקרומטר שלבי ציר Z מוצגים באיור 1: A1 - C1 עבור שטח גדול של חלקים במוח עטרה הכולל באזור קליפת המוח הקדמי cingulate 1 ואת הקורטקס המוטורי משנית 18. סעיפים נחתכו ב 500 מיקרומטר. שים לב וריאנט ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים כאן פרוטוקול מכתים גולגי-קוקס יחד עם שתי הגירסות שימושיות המאפשרים הדמיה נוירונים בתוך חלקים במוח עבים. כפי שניתן לראות תוצאות הנציג, השימוש מטרה ברזולוציה גבוהה כי יש מרחק 800 מיקרומטר עבודה ארוך מאפשר הדמיה של נוירונים אמינות כולו ברחבי העומק חלק במוח לחתוך ב 500 מיקרומטר. מחקר זה של חלקים במוח עבים יחסית מגדיל את ההסתברות כי נוירונים מוכתמים מכל סוג מוכלים במלואם בתוך הפרוסה, אשר חשובה במיוחד עבור עצב פירמידליים עם עצי דנדריט פסגה ארוכים ומסובכים. לדוגמא, בסעיפי עטרה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי דיסקברי גרנט כדי CDCB מן למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC), מענק התשתית המחקרית קרן מנהיגים ג'ון ר אוונס כדי CDCB מקנדה קרן חדשנות (מספר הפרוייקט CFI 30,381), ועל ידי דיסקברי גרנט כדי NJM מן NSERC. ELL נתמכה על ידי מלגת בוגר אונטריו ידי מלגות OVC מהמכללה וטרינרית אונטריו באוניברסיטת Guelph. CDS נתמכה על ידי משרת אסיסטנט מחקר סטודנט לתואר ראשון מ NSERC. ALM נתמכה על ידי מלגת אלכסנדר גרהם בל מ NSERC ועל ידי מלגות OVC מהמכללה וטרינרית אונטריו באוניברסיטת Guelph.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אשלגן דיכרומטפישר סיינטיפיקP188-100
אשלגן כרומטפישר סיינטיפיקP220-100
כלוריד כספיפישר סיינטיפיקS25423מסוכן
ווטמן דרגה 1 נייר סינוןפישר סיינטיפיק1001-185
איזופלורןשותפים פרמצבטיים של קנדה
CP0406V2 בקבוקון נצנוץ 20 מ"לפישר סיינטיפיק03-337-4
סוכרוזביושופ קנדהSUC700.1
נתרן פוספט מונו-בסיסיסיגמא אולדריץ'S5011-500G
נתרן פוספט דיבסיסיגמא אולדריץ'S9390-500G
50 מ"ל צינור חרוטיפישר סיינטיפיק12-565-271
איזופנטןפישר סיינטיפיקAC126470010הידוע גם בשם 2-מתילבוטן; אגר מסוכן
סיגמא אולדריץ'A1296-100G
צלחת משקל קטנהפישר סיינטיפיק02-202-100
ויברטוםLeicaVT1000 S
צלחות תרבית רקמות 6 בארותפישר סיינטיפיק08-772-1b
רשת תחתית תרבית רקמה מוסיפהפישר סיינטיפיק07-200-214
פרפורמאדלהייד (PFA), 16%מיקרוסקופ אלקטרונים מדעי15710-S
אמוניום הידרוקסידפישר סיינטיפיקA669S-500קודאק מסוכן
קיבוע Aסיגמא אולדריץ'P7542
סופרפרוסט פלוס שקופיותפישר סיינטיפיק12-550-15
סוכן ניקוי CitroSolvפישר סיינטיפיק22-143-975
אלכוהול אתילי נטול מיםאלכוהול מסחריN/A
סגול קרזילסיגמא אולדריץ'C1791
permountפישר סיינטיפיקSP15-100
מיקרוסקופ זקוףדגם
אולימפוס BX53מצלמה צבעונית, 12 סיביותMBF BiosciencesDV-47dQחלק מגמה 01-MBF-2000R-F-CLR-12
שלב מיקרוסקופ ממונע תלת מימדי, בקר ואנודריםMBF BiosciencesN/Aמסופק ומשולב עם מיקרוסקופ על ידי MBF Biosciences
4X מיקרוסקופ אובייקטיביאולימפוס4x 0.16 N.A. UplanSApo
10X מיקרוסקופ אובייקטיביאולימפוס10x 0.3 N.A. UPlan FL N 
מיקרוסקופ 30X אובייקטיביאולימפוס30x 1.05 N.A. UPlanSApo 
60X מיקרוסקופ אובייקטיביאולימפוס60x 1.42 N.A. PlanAPO N
שמן טבילה סיליקוןאולימפוסZ-81114
תוכנת NeurolucidaMBF Biosciencesגרסה 10
תוכנת ImageJהמכונים הלאומיים לבריאות בארה"גרסה נוכחיתעם התוסף OME Bio-Formats מותקנת
תוכנתפוטושופAdobeגרסה CS6
מסוכן מסוכן מסוכן ב

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Golgi, C. Sulla struttura della sostanza grigia del cervello. Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).
  2. Cox, W. H. Imprägnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen. Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).
  3. Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox Staining Step by Step. Front Neuroanat. 10, 38(2016).
  4. Levine, N. D., et al. Advances in thin tissue Golgi-Cox impregnation: fast, reliable methods for multi-assay analyses in rodent and non-human primate brain. J Neurosci Methods. 213 (2), 214-227 (2013).
  5. Ranjan, A., Mallick, B. N. A modified method for consistent and reliable Golgi-Cox staining in significantly reduced time. Front Neurosci. 1, 157(2010).
  6. Gibb, R., Kolb, B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. J Neurosci Methods. 79 (1), 1-4 (1998).
  7. Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
  8. Narayanan, S. N., et al. Appraisal of the effect of brain impregnation duration on neuronal staining and morphology in a modified Golgi-Cox method. J Neurosci Methods. 235, 193-207 (2014).
  9. Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
  10. Sutherland, R., Gibb, R., Kolb, B. The hippocampus makes a significant contribution to experience-dependent neocortical plasticity. Behav Brain Res. 214 (1), 121-124 (2010).
  11. Hamilton, G. F., Whitcher, L. T., Klintsova, A. Y. Postnatal binge-like alcohol exposure decreases dendritic complexity while increasing the density of mature spines in mPFC Layer II/III pyramidal neurons. Synapse. 64 (2), 127-135 (2010).
  12. Nashed, M. G., Seidlitz, E. P., Frey, B. N., Singh, G. Depressive-like behaviours and decreased dendritic branching in the medial prefrontal cortex of mice with tumors: A novel validated model of cancer-induced depression. Behav Brain Res. 294, 25-35 (2015).
  13. Frauenknecht, K., et al. Mice with experimental antiphospholipid syndrome display hippocampal dysfunction and a reduction of dendritic complexity in hippocampal CA1 neurones. Neuropathol Appl Neurobiol. 41 (5), 657-671 (2015).
  14. Camacho-Abrego, I., et al. Rearrangement of the dendritic morphology of the neurons from prefrontal cortex and hippocampus after subthalamic lesion in Sprague-Dawley rats. Synapse. 68 (3), 114-126 (2014).
  15. Redila, V. A., Christie, B. R. Exercise-induced changes in dendritic structure and complexity in the adult hippocampal dentate gyrus. Neuroscience. 137 (4), 1299-1307 (2006).
  16. Bailey, C. D., Alves, N. C., Nashmi, R., De Biasi, M., Lambe, E. K. Nicotinic alpha5 subunits drive developmental changes in the activation and morphology of prefrontal cortex layer VI neurons. Biol Psychiatry. 71 (2), 120-128 (2012).
  17. Lytton, W. W. From computer to brain : foundations of computational neuroscience. , Springer. (2002).
  18. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd, Academic. (2001).
  19. Ha, H. A modified Golgi-Cox method with counterstain for the study of synapses. Anat Rec. 155 (1), 59-64 (1966).
  20. Swanson, L. W. The locus coeruleus: a cytoarchitectonic, Golgi and immunohistochemical study in the albino rat. Brain Res. 110 (1), 39-56 (1976).
  21. Pilati, N., Barker, M., Panteleimonitis, S., Donga, R., Hamann, M. A rapid method combining Golgi and Nissl staining to study neuronal morphology and cytoarchitecture. J Histochem Cytochem. 56 (6), 539-550 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Golgi Cox MethodNeuron StainingThick Brain SectionsSilicone Oil ImmersionCresyl Violet StainBrain SectioningVibratome SectioningImage Stack AcquisitionDendritic Tree VisualizationSpine Density Analysis

מאמרים קשורים