מאמר שיטה

יעיל בידוד TCR תא בודד, דור של וקטורים Retroviral עבור במבחנה In Vivo הביטוי של האדם TCRs

DOI:

10.3791/55379

⸱

10 בספטמבר 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Section of Diabetes and Endocrinology, McNair Medical Institute, Baylor College of Medicine, Texas Children's Hospital, 2Benaroya Research Institute at Virginia Mason, 3Center for Human Immunobiology, Baylor College of Medicine, Texas Children's Hospital, 4Department of Pediatrics, Section of Diabetes and Endocrinology, Baylor College of Medicine, Texas Children's Hospital

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המשלב בפרוטוקול הנוכחי לתא בודד לזווג אדם TCR אלפא, ביתא שרשרת רצף עם אווירודינמית דור תואם במבחנה ויוו TCR והביטוי retroviral וקטורים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות זאת, פותחו מספר שיטות רצף של תא T מזווג קולטן (TCR) שרשראות אלפא, ביתא מתאי T יחיד, אף אחד עד כה להצטיינות במורד הזרם ויוו אנליזה פונקציונלית של TCR heterodimers. פיתחנו פרוטוקול משופר מבוסס על שני שלבים מולטיפלקס-מקונן PCR, כשהתוצאה היא מוצר ה-PCR המתפרס על כל משתנה מחוזות האדם TCR אלפא ביתא רשתות. על ידי זיהוי אתרים ייחודיים הגבלת שילוב אותם תחל ה-PCR, עשינו את המוצר PCR תואם ישירה תת שיבוט לתוך תבנית retroviral וקטור. הבונה retroviral וכתוצאה מכך מקודד chimeric האדם/TCR עם העכבר העכבר מחשבים תאיים, אשר מתפקד בתאי עכבר או במודלים העכבר ' ויוו . בסך הכל, הפרוטוקול המתואר כאן משלב האנושי תא בודד לזווג TCR אלפא, ביתא שרשרת הזדהות עם דור יעילה וישימה ברצון retroviral וקטורים לביטוי TCR במבחנה , ויוו . הוידאו והחומרים הנלווים מתוכננים לתת תיאור מפורט מאוד של התא הבודד PCR, כך לשלבים הקריטיים יכול להיות החסרונות שהופעלו ופוטנציאליים להימנע. בנוסף, אנו מספקים תיאור מפורט של השלבים שיבוט הדרושים ליצור ביטוי וקטור. לאחר mastered, כל התהליך מתא יחיד מיון לביטוי TCR יכול להתבצע תוך תקופה קצרה של שבועיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקולטן תא T (TCR) מכתיבה תא T ההחלטה לגורל במהלך הפיתוח, מצב יציב/הומאוסטזיס, גירוי antigenic לפריפריה1,2,3. הרחבת האחרונות עמוק רצף טכנולוגיות חשף מגוון TCR בעבר מעריכים בתוך אנטיגן ספציפי תא T תגובות. TCR גיוון מצביע על פוטנציאל תא T פונקציונלית רחבה של תגובות. על מנת לשלב את ניתוח רפרטואר של רצף TCR עם TCR מבחני פונקציונלי, הגישות רצף צריך להיות מתוכנן כך שיהיה תואם מערכות ניסויית ומודלים ויוו מנוצל לניתוח פונקציונלי עוקבות של בחירה TCRs. לנו יש פיתח גישה יעילה עבור האדם TCR רצף בידוד של תת שיבוט לתוך TCR אדם chimeric/עכבר תבנית וקטורית תואם TCR ביטוי עכברים humanized הלע4. בידוד של שרשראות אלפא, ביתא המתאים של heterodimeric TCRs דורש הגברה PCR של שתי שרשראות של תא בודד. למרות, יש TCR תא בודד מספר פרוטוקולים שיבוט פותחה, מנוצל, אף אחד עד כה בקלות תואם עם תפוקה גבוהה יעיל ישירה שכפול של TCRs Vα/Vβ לא ידוע לתוך הכרחי עבור הביטוי מחדש ויוו retroviral וקטורים 4,5,6,7. מחקרים קודמים נעזרו שתי גישות הגדולות, גם להגביר באופן סלקטיבי של חלק מוגבל TCR מספיקות כדי לנחש את הרצף או כדי להגביר את כולו TCR רצף4,5,6 , 7. אנליזה פונקציונלית במורד הזרם של רצפי TCR להשיג באמצעות הגישה הראשונה דורשת יקר סיליקו הרכבה דה נובו בנייה של TCR. בעוד הגישה השניה מספק את רצף TCR מלאה, באזור קבוע האנושית אינה תואמת ויוו ביטוי TCRs משובטים במודלים של העכבר. הגישה שלנו היא תוכננה במיוחד כדי שיהיה תואם ויוו אנליזה פונקציונלית של TCRs במודלים של העכבר. פיתחנו מפושטת ויעילה יחיד תא PCR פרוטוקול המאפשר ישירה תת שיבוט של PCR קטעים לתוך תבנית הביטוי וקטור.

הגישה שלנו מנצל רגישה מאוד מולטיפלקס-מקונן PCR תגובה מבוצעת בשני שלבים. התגובה הראשונה מולטיפלקס בשלב שלולית ספציפיות עבור כל הרשתות V-בטא 40 תחל ובריכה של 44 תחל ספציפיים עבור כל הרשתות V-אלפא משמשים כדי להגביר את TCR-אלפא או בטא TCR ללא ידיעת מוקדמת של הרצף (טבלה 1). פריימר לפנים יש רצף מתאם, שסופחה לתוך 5' של המוצר ה-PCR. ומהצמיגים הפוכה מבוססת על אזור קבוע TCR. זיהינו הגבלת ייחודי אתרים, נעדרו למשתנה האנושי או צומת TCR אזורים, ושילבו האלה לתוך תחל TCRα ו- TCRβ נייווי (איור 1). התגובה השניה מקוננים, פריימר ספציפיות עבור הרצף מתאם ו פריימר הפוכה מקוננים בתוך אזור קבוע משמשים כדי להגביר עוד יותר את השלשלאות TCR עם ירידה לפרטים מוגברת (טבלה 1, איור 1). לאחר בידוד תא בודד, 2 כדורים של ה-PCR (התגובה הראשונה עם מאגר של צבעי יסוד הן Vα והן Vβ, ועם השנייה תחל מתאם) במוצר ה-PCR זה יכול להיות ישירות תת משובטים לתוך תבנית retroviral וקטור. הבונה TCR הסופי לקודד, בתוך מסגרת קריאה פתוחה יחיד (ORF), אנושי אזורים משתנה בשילוב עם העכבר קבוע אזורים מחוברים על ידי הרצף חלבון 'שהפריד עצמית', P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. רצף P2A נעשה שימוש במערכות מרובות, נבדק באופן מקיף במיוחד עבור הביטוי TCRs8,9,10,11. למרות, אחרי תרגום מרבית השרידים רצף P2A קשור קצה קרבוקסילי שרשרת אלפא מחובר באמצעות מקשר גמיש, ואילו רצף אות שרשרת ביתא של פרולין נוספים, שינוי זה יש השפעה מזיקה על תפקוד TCR. אזור קבוע העכבר נמצא בשימוש הבונה במקום האדם להימנע פוטנציאליים שינו אינטראקציות עם רכיבים איתות במורד הזרם כאשר הביע מחדש בתאי עכבר. ORF יחיד תגרום בביטוי נפרדים stoichiometric של אלפא, בטא שרשראות9,11. בפרוטוקול הנוכחי מושתת על ריאגנטים, גישות זמינים באופן נרחב, והוא נועד להתבצע בצורה מפושטת ויעילה. למרות במיוחד השתמשנו בטכניקה זו כדי assay TCRs מתאי T self-reactive מעורבים סוכרת אוטואימונית, אנו צופים כי פרוטוקול זה יכול להיות החלים נרחב עבור זיהוי והערכה תפקודית של ספציפיות עבור האדם TCRs epitopes אוטואימונית, סרטן epitopes או התגובות פתוגנים וחיסונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. לזהות את האוכלוסייה תא T עניין.

הערה: אנטיגן ספציפי התפשטות בשילוב עם צבע חלוקת התא (כמו Carboxyfluorescein succinimidyl אסתר, CFSE) יכול לשמש כדי לבודד תאי T מבוסס על ההפצה שלהם בתגובה לגירוי antigenic. אם החל מ- PBMCs, הרחבה 7 ימים במבחנה צריך להספיק לזהות של אנטיגן ספציפי CFSE האוכלוסיה נמוכה 12.

  1. PBMCs מיקס 1:1 עם תאים מתאימים-MHC מזין, תווית עם 5 מיקרומטר CFSE חלוקת התא לצבוע.
  2. צלחת 2-2.5 x 10 5 תאים לכל טוב ב 96-ובכן עגול-תחתון תרבות צלחת בתקשורת 200 µL 10% FCS מלאה RPMI.
    הערה: RPMI מלאה כוללת 2 מ מגלוטמין, פירובט נתרן 1 מ מ, 100 מיקרומטר MEM שאינן חיוניות חומצות אמינו, 5 מ מ HEPES, 5.5 × 10 − 5 יחידות של מרקפטואתנול, 100 מ ל U − 1 פניצילין ו 100 מ ל µg − 1 סטרפטומיצין.
  3. לעורר תאים עם אנטיגן פפטיד מיקרומטר 25.
  4. ביום הרביעי של תרבות, בזהירות להסיר ולהחליף µL 100 של המדיה-
    הערה: גישה אופטימלית יותר לזיהוי תא T אנטיגן ספציפי הוא השימוש של פפטיד-הלע tetramers 13. Tetramer מכתים מאפשר הערכה בו זמנית של ירידה לפרטים אנטיגן, וכן הלע-הגבלה.

2. להגדיר את סוג תא בודד.

  1. ביצוע כל ההליכים ברדס או אזור ייעודי ללא תבנית מוגבר. Aliquot ריאגנטים כדי למנוע זיהום, לנקות כל משטחי עבודה, אם ריאלי, ציוד עם 10% אקונומיקה לפני התקנת ה-PCR. השתמש טיפים מסנן, ריאגנטים חינם RNAse ו- DNAse ופלסטיק כל PCR ו וקטור שיבוט צעדים. ריאגנטים מפתח ניתן למצוא טבלת חומרים.
    הערה: התגובה PCR מולטיפלקס היא רגישה מאוד, רמות נמוכות של זיהום יכול לגרום מוצר מוגבר.
  2. צור המיקס מאסטר שעתוק במהופך על ידי שילוב של 10 x RT התגובה מאגר, 25 X DNTPs, האנזים U RT 9, 0.01% טריטון-X, מעכב 0.7 U RNAse, ו- 383 nM של כל פריימר RT-TCR (המפורטים בטבלה 1) מאגר pipetting סטרילי. על כל צלחת 96-ובכן, להמציא מספיק מיקס מאסטר לתגובות נוספות 10 (סה כ 106), כדי לפצות על אובדן נוזלים במהלך pipetting. ראה בטבלה 2 עבור רכיבי התגובה וכמויות לכל טוב.
    3. צלחת
  3. הכן אוסף ה-PCR 96-ובכן עבור תא מיון לפי pipetting 6 µL של המיקס מאסטר שעתוק במהופך לכל באר עם פיפטה רב-ערוצי. לקחת את הצלחת על קרח או בבלוק קר.
  4. תווית תאים עם נוגדנים לתא סמני פני השטח (כגון CD4 ו- CD3, או CD8 CD3, כל אחד ב- 2 µg/mL, בשילוב עם חלוקת התא לצבוע או tetramer מכתים).
    5. תא
  5. תאי T מיון אחד לכל טוב, דילוג על השורה השתים עשרה, אשר ישמש פקד שלילי.
    הערה: היעילות של המיון יהיה תלוי אוסף מדויק היישור צלחת בתוך את לוחית, כמו גם שמירה על התאים ואת לוחות בטמפרטורה נמוכה לפני cDNA התגובה. אוסף צלחות יש לשמור על קרח בכל עת, למעט במהלך מיון, כאשר הם קבועים בתוך לוח הקירור. הממיינים לא כל מצויידים עם בעל צלחת מווסתת טמפרטורה; עם זאת, מומלץ מאוד לשימוש. כיוון המיון בדרך כלל לוקח בערך 10-15 דקות לכל צלחת, יש פוטנציאל מוגברת RNA השפלה אם הצלחת שלא נשמר בטמפרטורה נמוכה.
  6. כפקד חיובית, להוסיף מספר גדול יותר של תאים (תאים 100) באופן ידני עם פיפטה אחת הבארות בשלב זה. לחלופין, בעבר מבודד RNA מתאי במאגר יכול לשמש פקד חיובי ב-10 נג לכל טוב.
    הערה: פיפטה מטוהרים שליטה RNA עם דיוק ולדאוג למניעת זיהום צולב של אחרים בארות, תוצאות חיוביות שגויות.
  7. לאטום את הצלחת עם סרט דביק, ספין למטה ב- 1000 g x עבור 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
  8. לתמלל באופן מיידי RNA ל cDNA מאת המקננת את הצלחת ב 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות, ו- 85 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות
    הערה: כדי להבטיח תגובה PCR יעיל, מומלץ כי התגובה הראשונה של ה-PCR להתבצע באותו היום. לחלופין, הלוחות משועתקים ניתן לשמור ב- 80 ° C עד 2 חודשים-

3. לבצע PCR מולטיפלקס-מקונן

הערה: הכנת תערובות מאסטר כל באזור נקי ללא תבנית כדי למנוע זיהום.

פריימר
  1. לשקם כל אזור משתנה 100 מיקרומטר עם DNAse ו RNAse חינם H 2 O. לשלב הבא, 20 µL של כל אחד תחל 44 כדי ליצור מאגר פריימר V-אלפא. כדי להפיק את V-בטא פריימר בריכה לשלב 20 µL של כל אחד תחל V-בטא 40 פלוס µL 80 DNAse, RNAse חינם H 2 פריימר או רצפי המפורטים בטבלה 1. ברגע, איחדו הריכוז של כל פריימר בתערובת הוא 2.3 מיקרומטר.
  2. לשקם את אזור קבוע תחל 100 מיקרומטר פתרון מניות עם DNAse וללא RNAse H 2 O. Dilute את אזור קבוע תחל 10 מיקרומטר הפתרון עובד, aliquot לשימוש.
  3. להכין שתי תערובות מאסטר נפרד הגברה TCR-אלפא ו TCR בטא. ליצור את תערובות הראשי על-ידי שילוב 5 X מאגר, 80 מיקרומטר dNTPs, דימתיל סולפוקסיד 3%, 2 מיקרומטר פריימר בריכה (הריכוז הסופי של 46 ננומטר עבור כל פריימר), 200 ננומטר TCR-קבוע אזור פריימר הפוכה, 1 U DNA פולימראז ו DNAse ו RNAse חינם H 2 O (בטבלה 2 < / חזק >). על כל צלחת 96-ובכן, להמציא מספיק מיקס מאסטר לתגובות נוספות 10 (סה כ 106), כדי לפצות על אובדן נוזלים במהלך pipetting.
    הערה: החישובים מבוססים על נפח PCR הסופי של µL 25 לכל טוב, איפה 22.5 µL מאסטר PCR מיקס בשילוב עם 2.5 תבנית cDNA µL.
  4. לקחת את הצלחת עם cDNA על קרח או בבלוק קר. להשתמש רב-ערוצי פיפטה 22.5 µL של תגובה TCR בטא לתוך צלחת חדשה של ה-PCR 96-ובכן. ואז להשתמש רב-ערוצי להעביר µL 2.5 של cDNA המשקולת PCR.
  5. להשתמש רב-ערוצי פיפטה 22.5 µL של תגובה TCR-אלפא ישירות לתוך הבסיס המכיל את שארית cDNA.
  6. חותם הצלחות עם דבק בעדינות מערבולת, ספין למטה ב- 1000 g x עבור 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
  7. להפעיל את תגובת ה-PCR מולטיפלקס במחזורים הבאים: 5 דקות ב 95 ° C ואחריו 34 מחזורים של 20 s ב 95 ° C, 30 s ב 54 ° C, ו- 1 דקות ב-72 מעלות, ואחריו 7 דקות-72 מעלות צלזיוס
    8. µL
  8. לשאת את התגובה PCR מקוננים בתוך נפח סופי של 25, באמצעות µL 2.5 של תערובת PCR מולטיפלקס כתבנית.
    1. לשקם את תחל פנימי וגם מתאם 100 מיקרומטר עם DNAse, RNAse חינם H 2 O. להפוך 10 מיקרומטר aliquots המניות לעבוד.
    2. להכין שתי תערובות מאסטר נפרד ampl TCR-אלפא ו TCR בטאification. מיקס 5 X מאגר, 25 X DNTP, 3% דימתיל סולפוקסיד, 200 ננומטר מתאם קדמי פריימר, 200 ננומטר פריימר מקוננים הפוכה, U DNA פולימראז 1, ו DNA פולימראז ו נטול נוקלאז H 2 O עבור נפח סופי של 22.5 µL (טבלה 2). על כל צלחת 96-ובכן, להמציא מספיק מיקס מאסטר לתגובות נוספות 10 (סה כ 106), כדי לפצות על אובדן נוזלים במהלך pipetting.
      הערה: בשימוש התגובה השנייה PCR 5 X PCR מאגר המכיל צבע טעינה כדי להקל על ג'ל agarose טעינה.
    3. באמצעות רב-ערוצי pipette את תערובות TCR-אלפא TCR בטא התגובות ב 22.5 µL לכל טוב לתוך שתי צלחות PCR החדש של 96-ובכן האב.
    4. להוסיף את תבנית התגובה PCR מולטיפלקס µL 2.5 לכל טוב.
      הערה: התגובה PCR הנותרים הראשונה צריך להיות אטום, המאוחסנים ב-20 ° C כדי לשמש כמקור של תבנית נוספת, אם יש צורך (ראה צעד הערה 4.3).
    5. לאטום את הצלחות מערבולת ובעדינות ספין למטה ב- g 1000 x עבור 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס
    6. להפעיל את תגובת ה-PCR מקוננות במחזורים הבאים: 5 דקות ב 95 ° C ואחריו 34 מחזורים של 20 s ב 95 ° C, 30 s ב 56 ° C, ו- 1 דקות ב-72 מעלות, ואחריו 7 דקות-72 מעלות צלזיוס
    7. לרוץ 5 µL של התגובה האחרונה בחוץ על agarose 1% ג'ל המכיל אתידיום ברומיד (כולל הבארות שליטה שלילי וחיובי).
      הערה: הלהקה צפויה לפעול בגודל bp כ-500. לתגובה לדוגמה מוצג באיור 2.
    8. לטהר את שאר התגובה השנייה (20 µL) באמצעות תבנית 96-ובכן ערכת טיהור PCR, elute עם µL 15 של 70 מעלות צלזיוס H 2 O לכל טוב, ולבצע סנגר רצף. השתמש את המתאים TCR-אלפא או בטא TCR מתאם קדמי פריימר על רצף (טבלה 1).
      הערה: רצפים ניתן לנתח בעזרת תוכנת immunogenetics זמינים באינטרנט-

4. תת שיבוט רשתות ה-PCR אלפא ביתא.

הערה: הבריכה תחל קדימה מנוצל התגובה הראשונה, את צבעי יסוד הפוכה, בעקבות תגובות PCR השני משמשים לשילוב באתרים מגבלת. לכן, שהושג אלפא ביתא שרשרת PCR המוצרים מוכנים להיות ברצף תת משובטים לתוך תבנית retroviral וקטור ( איור 1).

מוצרי
  1. לעכל ה-PCR מטוהרים את גרסת הבטא מקונן התגובה עם BstbI ו- MfeI (טבלה 3).
    הערה: לא יעלה על 5 הוספה µg.
  2. במקביל, לעכל את תבנית הווקטור עם BstbI ו- MfeI (טבלה 3). השתמש µg 1-2 של וקטור תבנית לכל TCR. להפעיל את הווקטור מתעכל ג'ל agarose, לבודד את הלהקה גדול יותר (~ 7500 bp). לטהר את הווקטור עם ג'ל ערכת טיהור DNA-
    הערה: במהלך התקציר אנזים הגבלה, האזור תבנית משתנה TCR בטא מאתר מוסר, המאפשר התוספת של האזור משתנה האדם TCR-beta-
  3. לטהר את המוצרים PCR מתעכל באמצעות ערכת טיהור PCR.
    הערה: ודא את יכולת טיהור DNA של העמודות הכלולות בערכה; השתמש מספר עמודות במידת הצורך. כמות המינימום הוספה מטוהרים הכרחי לתגובה מצדו מוצלח הוא 50 ng-ריכוז מינימלי של 10 ng/µL. אם הסכום מטוהרים הוספה אינה מספקת עבור מצדו מוצלח, התגובה PCR השני שיכול לחזור.
  4. מתייחס המבוססת על תבנית עם אנזים 10 U CIP עבור 1 h ב 37 ° C כדי למנוע מצדו עצמית, ואחריו איון חום למשך 10 דקות ב-75 ° ג Purify ה-DNA עם ערכת טיהור PCR (טבלה 3).
  5. Ligate TCR בטא הכנס והפעל וקטוריות באמצעות DNA ליגאז הנפח הכולל 20 µL-6 טוחנת עודף של הקדמי למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: בסך הכל, התגובה מצדו צריך להכיל כ-150 ng של DNA (טבלה 3).
  6. להמרות, לערבב µL 8 התגובה מצדו עם 80 µL של e. coli DH5α כשיר מבחינה כימית תאים (טבלה של חומרים), דגירה על קרח במשך 30 דקות הלם חום ב 42 מעלות צלזיוס במשך 45 µL להוסיף 500 ש סופר מרק אופטימלית עם אמצעי דיכוי (S.O.C.) Catabolite ו- shake עבור 1.5 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
  7. צלחת החוצה 250 µL של התרבות חיידקי לוקחת אמפיצילין המכיל צלחת אגר Lysogeny מרק (ליברות). דגירה לצלחת בן לילה (~ 16 h) ב- 37 מעלות צלזיוס.
  8. למחרת לבחור מושבות חיידקים, גדלים להם 3 מ ל LB בינוני המכיל אמפיצילין בן לילה. לבודד את הדנ א פלסמיד באמצעות ערכת טיהור פלסמיד דנ א.
  9. לאשר את הכניסה המוצלחת של שרשרת ביתא על ידי מבחן בקנה מידה קטן-תקציר עם אנזימי הגבלה BstbI ו- MfeI. ב 12 µL התגובה הכולל אמצעי אחסון, לשלב 200-500 µg פלסמיד DNA µL 0.25 של כל אנזים, מאגר אנזים X 10 (טבלה 3). להפעיל את תגובת בחוץ על agarose 1% ג'ל המכיל אתידיום ברומיד כדי לאשר את הגודל של הלהקה הוספה (~ 500 bp).
  10. לאחר המאשרים את נוכחותם של הקדמי, רצף המקטע TCR בטא של הווקטור באמצעות פריימר הפוכה של IRES (טבלה 1).
  11. בעקבות אישור לרצף תותב TCR בטא, לבצע תהליך דומה עבור הכניסה של האזור משתנה אלפא. לעכל את המוצרים PCR מטוהרים התגובה מקוננים אלפא, והוספה של החדש שנוצר TCR בטא וקטורית, עם SnaBI, SacII.
    הערה: במהלך התקציר אנזים הגבלה, האזור תבנית משתנה TCR-אלפא מאתר מוסר, המאפשר התוספת של האזור משתנה האדם TCR-אלפא-
  12. Ligate אלפא מוסיף וקטורים TCR בקידוד המתאים בטא משתנה האזור באמצעות DNA ליגאז הנפח הכולל 20 µL-6 טוחנת עודף של הקדמי למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: בסך הכל, התגובה מצדו צריך להכיל כ-150 ng של DNA (טבלה 3).
  13. להמרות, לערבב µL 8 התגובה מצדו עם 80 µL של e. coli DH5α כשיר מבחינה כימית תאים (טבלה של חומרים), דגירה על קרח במשך 30 דקות הלם חום ב 42 מעלות צלזיוס במשך 45 ס' להוסיף 500 µL S.O.C. בינוני ו- shake עבור 1.5 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
  14. צלחת החוצה 250 µL של התרבות חיידקי לוקחת אמפיצילין המכיל צלחת אגר Lysogeny מרק (ליברות). דגירה לצלחת בן לילה (~ 16 h) ב- 37 מעלות צלזיוס.
  15. למחרת לבחור מושבות חיידקים, גדלים להם 3 מ ל LB בינוני המכיל אמפיצילין בן לילה. לבודד את הדנ א פלסמיד באמצעות ערכת טיהור פלסמיד דנ א.
  16. לאשר את הכניסה המוצלחת של שרשרת אלפא על ידי מבחן בקנה מידה קטן-תקציר עם אנזימי הגבלה SnaBI ו- SacII. באמצעי התגובה הכולל 12 µL לשלב 200-500 µg פלסמיד DNA µL 0.25 של כל אנזים, מאגר אנזים x 10 (טבלה 3). להפעיל את תגובת בחוץ על agarose 1% ג'ל המכיל אתידיום ברומיד כדי לאשר את הגודל של הלהקה הוספה (~ 500 bp).
  17. לאחר המאשרים את נוכחותם של הקדמי, רצף המקטע TCR-אלפא של הווקטור באמצעות ומהצמיגים MSCV2-קדימה (טבלה 1).
  18. , ברגע, הרצף שרשרת אלפא תוחזר לאמת את תותב TCR מלאה על ידי רצף עם פריימר TCR בטא-היפוך של IRES-הפוכה (טבלה 1).

5. ודא TCR תא השטח ביטוי וספציפיות.

הערה: HEK293T תאים משמשים כדי לבדוק מוצלחת TCR שרשרת פאריng ותא על פני השטח ביטוי ( איור 3 א) 8. פפטיד-MHC tetramer מכתים גם ניתן לבצע על תאים HEK293T transfected כדי לבדוק את השמירה של ירידה לפרטים antigenic פוסט TCR ג'ין בידוד ( איור 3B).

  1. צלחת את התאים HEK293T תרביות רקמה. ובכן 12 צלחות-עונה 1 פרק 10 5 תאים לכל באר 1 מ"ל מלאה DMEM מדיה המכילה 5% FCS והתרבות בין לילה-37 ° ג צלחת בחוץ מספיק תאים כדי ייעד את וולס נפרד עבור כל TCR חדש , פקד בתבנית TCR וקטור, CD3 וקטור בלבד, לשלוט וקטור TCR בלבד, ו שאינם transfected טוב.
    הערה: תרביות תאים עם העכבר תבנית לחלוטין TCR וקטור (mTCR-pMIA) בשילוב עם וקטור mCD3εγδζ-pMIG, וקטור mTCR-pMIA לבד, ו mCD3εγδζ-pMIG וקטור לבד משמשים פקדים חיוביים ושליליים.
    הערה: DMEM מלאה כוללת 2 מ מגלוטמין, 1 מ"מ נתרן פירובט, 100 מיקרומטר חומצות אמינו שאינן הכרחיות, 5 מ מ HEPES מאגר, 5.5 x 10 יחידות -5 מרקפטואתנול, פניצילין U/ml 100/סטרפטומיצין....
  2. למחרת, transfect את התאים עם וקטור h/mTCR-pMIA chimeric µg 1, 1 µg העכבר CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) וקטור ריאגנט ליפוזום מבוססי תקנים בעקבות הוראות יצרן-
  3. עבור כל TCR, הוספת ריאגנט 6 של תרביות תאים µL בטמפרטורת החדר µL 100, ללא סרום DMEM. בקצרה מערבולת, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות
  4. ב mL 1.5 נפרד צינורות לשלב 1 µg של וקטור TCR-pMIA עם העכבר µg 1, CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) וקטור, או µg 1 של כל וקטור נפרדים עבור פקדים.
  5. Dropwise, להוסיף את הפתרון ריאגנט/DMEM תקנים הצינורות המכילים המבוססת על ה-DNA. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות
  6. Dropwise, להוסיף את הפתרון ריאגנט/DMEM/ה-DNA של תרביות תאים לתאים HEK293T. טפח בעדינות את הצלחת לערבב. דגירה ב 37 ° C עבור ה 24
  7. לאחר 24 h להחליף את המדיה, ולשמור תאים בתרבות עבור ה 24 שעות נוספות
  8. להסיר תאים מהצלחת מאת pipetting נמרצת, מכתים את התאים עם העכבר אנטי CD3 נוגדנים (2.5 µg/mL) כדי לוודא משטח הבעת chimeric-TCR מאת cytometry זרימה.
  9. על מנת להשוות CD3 הביטוי בין התאים היו transfected לרמה דומה, שער הניתוח על תאים לבטא ברמה גבוהה דומה של מולקולות כתב פלורסנט (GFP עבור CD3 מורכבים, ו Ametrine עבור וקטור ביטוי TCR). בצורה אופטימלית, הניתוח צריך להיות פיקוח GFP + Ametrine + תאים בתוך 10 4 כדי 5 10 פלורסנט בעוצמה ( איור 3 א).
    הערה: הרמה של CD3 ביטוי בתאים transfected עם הבונה chimeric אמורים להיות דומים במהירותם הווקטור העכבר (התבנית המקורית) שליטה ( איור 3 א). הווקטורים retroviral TCR שנוצר תואמים לויוו ביטוי מערכות כמו שתואר לעיל 4.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היעילות של התגובה PCR מולטיפלקס-מקונן נבדקת בשלב 3.2.7 (איור 2) מאת פועלת 5µL התגובה השניה הג'ל agarose. בממוצע היעילות של הגברה TCR בטא צפוי להיות בסביבות 80%, בעוד היעילות של התגובה TCR-אלפא הוא בדרך כלל נמוך יותר, בסביבות 50%4. רק לזווג TCR-אלפא TCR בטא רשתות ניתן להשתמש להבעה TCR; עם זאת, כל מוצרי ה-PCR יכול להיות רציף כדי לקבל רצף TCR ומידע רפרטואר.

ג'ין להשתיק יאפשר רק ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מתארים שיטה יעילה עבור הגברה TCR תא בודד ו עוקבות תת שיבוט לזווג TCR אלפא ביתא רשתות לתוך תבנית הביטוי retroviral וקטור. למרות זאת, פותחו מספר פרוטוקולים PCR תא בודד, אף עד כה תואם מיידית תת שיבוט לתוך וקטור ביטוי. ברוב המקרים, רצף חלקי המקיף את האזורים CDR3 משתנה מאוד מוגבר, עם מספיק רצף להסיק האזור משתנה. זה גודל קטן יותר של מוצר ה-PCR תומך PCR יעילות גבוהה יותר, אך מחייבת דה נובו TCR ג'ין סינתזה ללימודי פונקציונלי. בפרוטוקול הנוכחי שומר על היעילות של תא בודד ממוקדות CDR3 שפורסמו בעבר TCR...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי האגודה לסוכרת נעורים 1-FAC-2014-243-A-N, עדה 7-14-JF-07, NIH 5 P30 DK079638-05 טייס פיג'יי, ואת רוברט ג'ניס מקנייר קרן.

אנו מודים Pena סנדרה ומקדונלד Andrene על גיוס החולה, סמואל בלום לקבלת סיוע טכני, ד ר ג'ורג Makedonas על המתנה של נוגדנים ושליטה DNA משמש PCR אופטימיזציה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
CFSE eBioscience 65-0850-845 מ"מ
אנטי אנושי CD4 (OKT4) BV421Biolegend 3174332 מ"ג/מ"ל
אנטי אנושי CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5Biolegend 3173362 מ"ג/מ"ל
נגד עכבר CD3 AF647Biolegend 1003222.5 מ"ג/מ"ל
מעכב RNAse רקומביננטי ביוטק grd 2.5KU   VWR97068-1580.7 U
Applied Biosystems ערכת cDNA RT בקיבולת גבוהה Invirtogen 43688149 U (אנזים RT) 
NF-H2O: מים נטולי נוקלאז 1000 מ"לInvirtogen AM9932
Gotaq DNA פולימראז 2500UVWRPAM30081 U
96 באר חצי חצאית PCR צלחתPhoenixMPX-96M2
מיקרו אמפר סרט דבק שקוף תרמו-פישר 
אגרוז UltraPure  Invirtogen 15510-027
SnaBIניו אינגלנד Biolabs R013015 U (הכנסה) 30 U (וקטור)
SacIIניו אינגלנד Biolabs R015740 U (הכנסה) 80 U (וקטור)
MfeIניו אינגלנד Biolabs R3589S40 U (הכנסה) 80 U (וקטור)
BstBIניו אינגלנד Biolabs R051940 U (הכנסה) 80 U (וקטור)
פוספטאז מעיים עגל (CIP)מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד M0290S10 U
ליגאז מהיר ניו אינגלנד ביולאבס M2200S
Wizard Plus מערכות לטיהור DNA מיני-הכנות פרומגה A1460
Wizard Plus מערכות טיהור DNA של midipreps פרומגה A7640
DNA נקי & רכז-ערכת 25Genesee Scientific 11-304C
ZR-96 DNA נקי & רכז-5 ערכתGenesee Scientific 11-306A
ערכת מיצוי ג'ל מהירהQIAGEN28704
ערכת טיהור PCR מהירהQIAGEN28104
יעילות תת-שיבוט DH5a תאים מוסמכים תרמו-פישר 
טרנזיט LT-1 ריאגנט 1 מ"ל (מגיב טרנספקציה)מירוס 
BD FACS Aria II (מיון)BD
BD Fortessa (ציטומטר זרימה)BD 
430631118265017MIR2300

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Germain, R. N. T-cell development and the CD4-CD8 lineage decision. Nat Rev Immunol. 2 (5), 309-322 (2002).
  2. Singer, A., Adoro, S., Park, J. H. Lineage fate and intense debate: myths, models and mechanisms of CD4- versus CD8-lineage choice. Nat Rev Immunol. 8 (10), 788-801 (2008).
  3. Tubo, N. J., et al. Single naive CD4+ T cells from a diverse repertoire produce different effector cell types during infection. Cell. 153 (4), 785-796 (2013).
  4. Sprouse, M. L., et al. Rapid identification and expression of human TCRs in retrogenic mice. J Immunol Methods. , (2016).
  5. Lennon, G. P., et al. T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event. Immunity. 31 (4), 643-653 (2009).
  6. Dash, P., et al. Paired analysis of TCRalpha and TCRbeta chains at the single-cell level in mice. J Clin Invest. 121 (1), 288-295 (2011).
  7. Kobayashi, E., et al. A new cloning and expression system yields and validates TCRs from blood lymphocytes of patients with cancer within 10 days. Nat Med. 19 (11), 1542-1546 (2013).
  8. Szymczak, A. L., et al. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector. Nat Biotechnol. 22 (5), 589-594 (2004).
  9. Szymczak, A. L., Vignali, D. A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).
  10. Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. T-cell receptor retrogenic mice: a rapid, flexible alternative to T-cell receptor transgenic mice. Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).
  11. Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice. Nat Methods. 3 (3), 191-197 (2006).
  12. Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. J Immunol Methods. 283 (1-2), 173-183 (2003).
  13. James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers. J Vis Exp. (25), (2009).
  14. Corthay, A., Nandakumar, K. S., Holmdahl, R. Evaluation of the percentage of peripheral T cells with two different T cell receptor alpha-chains and of their potential role in autoimmunity. J Autoimmun. 16 (4), 423-429 (2001).
  15. Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. J Vis Exp. (113), (2016).
  16. Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer. Nat Protoc. 8 (10), 1837-1840 (2013).
  17. Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability. Cancer Res. 66 (17), 8878-8886 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

TCRPCRTCRin vitro in vivoHEK293TTCR

מאמרים קשורים