מאמר שיטה

איתור והעשרה של נדיר- אנטיגן ספציפי בתאי B עבור ניתוח של הפנוטיפ ותפקוד

11.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55382

⸱

16 בפברואר 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado School of Medicine, 2Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Colorado State University, 3Barbara Davis Center for Childhood Diabetes, University of Colorado School of Medicine, 4Department of Biomedical Research, National Jewish Health

במאמר זה

סיכום

שיטה פשוטה אך יעילה המעסיקה חלקיקים מגנטיים כדי לזהות ולהעשיר תאי B-reactive אנטיגן לניתוח פונקציונלי פנוטיפי מתואר.

תקציר

B תאי B המגיבים עם אנטיגן ספציפי מופיעים בדרך כלל בתדירות של <0.05% מהלימפוציטים. במשך עשרות שנים חוקרים חיפשו שיטות לבודד ולהעשיר את התאים הנדירים הללו לצורך מחקר על הפנוטיפ והביולוגיה שלהם. הגישות מבוססות באופן בלתי נמנע על העיקרון שתאי B מזהים אנטיגן טבעי בזכות קולטנים על פני התא המייצגים ספציפיות של נוגדנים שבסופו של דבר יופרשו על ידי בנותיהם המובחנות. אולי הגישה הברורה ביותר לבעיה כוללת שימוש באנטיגנים מצומדים פלואורוכרום בשילוב עם מיון תאים המופעל על ידי פלואורוכרום (FACS). עם זאת, התועלת של שיטות אלה מוגבלת על ידי תדר התאים וקצב הניתוח והבידוד הניתן להשגה על ידי מיון אלקטרוני. מתוארת שיטה חדשנית להעשרת תאי B נדירים ספציפיים לאנטיגן באמצעות ננו-חלקיקים מגנטיים המביאה להעשרה בתפוקה גבוהה של תאי B מגיבים לאנטיגן מאוכלוסיות תאי התחלה גדולות. שיטה זו מאפשרת ניטור משופר של הפנוטיפ והביולוגיה של תאים מגיבים לאנטיגן לפני ואחרי מפגש אנטיגן in vivo, כגון לאחר חיסון או במהלך התפתחות אוטואימוניות.

מבוא

הגבלת דילול המנתח של תדר מבשר תאי מפרישי נוגדן הציע B תאים תגובתי אנטיגן מסוים מתרחשים בדרך כלל בתדר של 0.05 ל 0.005% ברפרטואר הרגיל, בהתאם למצב החיסון והגודל / מספר אפיטופים הנוכחי על אנטיגן. התדירות הנמוכה של תאים אלה מקשה ללמוד שינויים במעמדם במהלך פיתוח של מערכת חיסונית, כגון החיסון הבא או חשיפת אנטיגן זר, או במהלך ההתפתחות של אוטואימוניות. בעבר, חוקרים התחייבו בידוד של תאי B-reactive אנטיגן באמצעות טכניקות החל צלחות או adsorbents טור מצופה אנטיגן, כדי איפוס תאי דם אדום מצופה אנטיגן, קרינה המופעל מיון תא 1, 2, 3, 4, 5, 6. though טכניקות אלו היו מוצלחות בזיהוי ובידוד תאי B תגובתי-אנטיגן, התוצאות השתנו במונחי תשואה, טוהר ויכולת רחב. לאחרונה פיתחנו שיטה חדשה לשני לזהות ולהעשיר תת-אוכלוסיות לימפוציטים B נדירים באמצעות חלקיקים מגנטיים. השיטה מאפשרת העשרה עם תשואה גבוהה יחסית וטוהר מאוכלוסיות מוצא גדולים, והוא תואם עם ניתוח של תגובות אנטיגן. על ידי העשרה מאוכלוסיות של תאים בתרחיף, השיטה מבטלת אילוצים הקשורים בגיאומטריה של צלחות מצופות אנטיגן או עמודות, ותפוקת גבול. לבסוף, מאז תאים מועשרים נשארים הקשורים אנטיגן כתב ניאון, הם יכולים להיות מטוהרים עוד יותר על ידי מיון FACS. כפי שתואר במסמך זה השתמשנו גישה זו ללימוד של תאי B toxoid-reactive טטנוס הדם ההיקפיים לפני וחיסון הבאים בבני אדם, כמו גם תאי B autoantigen-reactive מן הנבדקים עם autoi שוניםפרעות mmune, כולל סוכרת מסוג 1, מחלת גרייבס, ומחלת השימוטו 7. השיטה עובדת באותה מידה אדם לעכבר, והוא תואם עם ניתוח של תאי B-reactive אנטיגן ממגוון רקמות (כתב היד בהכנה).

בשנת הפורמט הבסיסי שלה, תאי דם היקפיים mononuclear מודגרת הראשון עם אנטיגן biotinylated יחד עם נוגדנים לתא אנטיגנים השטח הנדרש לניתוח פנוטיפי. צעד תיוג זה ואחריו כביסה קיבעון, והוספת streptavidin מצמידים את צבע מרחיקות אדום ניאון לגילוי של אנטיגן biotinylated מחייב תאים (איור 1). מחקרים קודמים זיהו תאי B אנטיגן ספציפי באופן דומה אך אנטיגנים באמצעות מצומדות ישירות fluorochrome 8, 9, 10, 11. למרות זאת הוא ראויגישה, שימוש אנטיגנים biotinylated בשיתוף עם streptavidin מאפשרת הגברת אות יותר (ומכאן בידול טוב יותר של כריכה, תאים בלתי מחייבים), במיוחד כאשר אנטיגנים הם קטנים 12, 13, 14. שיקול נוסף הוא השימוש streptavidin במקום avidin כי streptavidin הוא deglycosylated, ומקטין את הלא ספציפית מחייב. יתר על כן, אנו משתמשים צבען מרחיקות אדום ניאון כמו fluorochrome בשל photostability שלה, תשואה קוונטית (בהירות), ואת גודלו הקטן (~ 1.3 KD). Fluorochromes חלבון כגון Phycoerythrin (~ 250 KD) ו allophycocyanin (~ 105 KD) 15 אינם אופטימליים כי הם פוטנציאל להכיל אפיטופים אנטיגני רבים. שימוש פלורסנט לצבוע אורגני קטן מורכב epitope יחיד, כגון צבע מרחיקות אדום ניאון, ומפחית את המורכבות של אוכלוסיית התא המבודדת.

לאחר התאים הם biotinylated-antigen ו adsorbed צבען streptavidin מרחיקה ניאון האדום, הם מועשרים באמצעות חלקיקים מגנטיים אנטי מרחיקות אדום ניאון צבען מצומדות. חלקיקים אחת אינם מזוהים על ידי cytometers הזרימה ביותר ולכן אין צורך להסיר לפני טיהור ידי FACS מיון מבחנים במורד זרם 16. מבחר מגנטי עבור תאי B אנטיגן ספציפי מעשיר את האוכלוסייה של עניין, ומבטל את הזמן והעלות של מיון אירועים נדירים באמצעות cytometer זרימה.

להלן אנו מציגים תוצאות נציג מהעשרה של תאי B טטנוס-toxoid ספציפי של נושא לפני ושבעה ימים לאחר חיסון מגבר toxoid טטנוס. בחרנו היישום המסוים הזה כדוגמה כדי להדגים את היכולת של שיטה זו להעשיר תאי B אנטיגן ספציפי הבאים חריפה גירוי vivo. כאשר מצמידים עם תזרים cytometry, שיטה זו היא מסוגלת מעשירה ומבדל אנטיגן ספציפי נאיבי, זיכרון,plasmablast B תאים מאפשרים לחוקר לעקוב שינויים בתדירות שלהם לאורך זמן. בנוסף, אנו כוללים אחר assay במורד אפשרי, למשל ב assay ELISPOT, אשר מראה כי תאים לשמור על היכולת להפריש נוגדנים הבאים עשרה. יישום נוסף של שיטה זו עשויה להיות כרוך העברת מאמצת של תאים מועשרים לתוך שורה. הראינו בעבר תאים לשמר את היכולת לפעול כפי אנטיגן הצגת תאים לתאי T אנטיגן ספציפי הבאים בידוד והעברה (מידע לא מוצג). לפיכך, יש מספר המבחנים במורד זרם האפשריים שיכול להיות מצמידים את השיטה, אשר יחד מודיע ההבנה של התגובה החיסונית אנטיגן ספציפי. תארנו את השיטה הבאה, לרבות בקרות כדי לקבוע תשואה כוללת, טוהר, תא סגולי, ומקפלים-העשרה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. ניתוק של PBMCs אנוש

  1. אסוף 30-50 מ"ל של דם באמצעות צינורות איסוף דם heparinized.
    הערה: כמות הדם המשמשים תלוי בשאלה ותדירות הניסוי בפרט בדם של תאי B אנטיגן ספציפי של עניין. דם heparinized ניתן לעבד מיד או התנדנדה קלות הלילה בטמפרטורת החדר לעיבוד למחרת. העיכוב עיבוד יש השפעה מועטה מאוד על יעילות של העשרה והיא קשורה עם הפסד מינימלי של כדאיות.
  2. מערבבים כל הדם 1: 1 עם מגנזיום הטמפרטורה סטרילי, חדר בופר פוספט חינם סידן (PBS).
  3. בתוך צינור חרוטי 50 מ"ל סטרילי, להוסיף 10 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות בטמפרטורת החדר. אחסן את בקבוקי שיפוע צפיפות פתח בחושך ב 4 ° C, אבל חם לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
  4. אם אפשר להגדיר את האקדח פיפטה להגדרה האיטית ו / או ליישם מעט מאוד, ובכל זאת עולה בקנה אחד, לחץ על הדק לאטשכבת 30-35 מ"ל של דם מדולל על גבי שיפוע צפיפות, נזהרים שלא לערבב בין השניים.
    הערה: הצבת הקצה פיפטה כנגד הקצה של 50 מיליליטר חרוטים תוך הוספת הדם המדולל תעזור להבטיח זרימה קבועה ועקבית.
  5. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 30 דקות ב 20 מעלות צלזיוס עם הבלם כבוי.
  6. הסר את השכבה העליונה, אשר מכיל פלסמה וטסיות, נזהר שלא להפריע את שכבת התאים mononuclear להלן.
  7. בעזרת פיפטה סטרילית, לאסוף את שכבת התאים mononuclear (באפי מעיל) ומקום לתוך צינור 50 מ"ל חרוטי סטרילי נפרד.
  8. להוסיף PBS על השעיית התא לנפח של 50 מ"ל. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 10 דקות ב 20 מעלות צלזיוס עם הבלם.
  9. הסר supernatant ו resuspend התאים pelleted ב 10 מ"ל של PBS. ספירת תאים ולקבוע כדאיות באמצעות hemocytometer או נגד תא אוטומטי.
  10. תאים Resuspend ב 10 7 תאים / מ"ל ומניחים על קרח עד מוכן לעיבוד נוסף.

מכתים 2. של תאים

  1. הסר 1-2 x 10 6 תאים עבור כל פיצוי קרינה / שליטת FMO צורך, אם זה אפשרי. שארית צנטריפוגה של תאים ב 400 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C עם הבלם.
  2. Resuspend תאים מסוננים סטרילית, חיץ FACS קר (PBS + 1% אלבומין בסרום שור (BSA) + 0.01% אזיד הנתרן) בשעה 3-6 x 10 7 תאים / מ"ל (להסיר צינור 1.5 מ"ל צנטריפוגות). ודא כי למאגר FACS קר ולשמור אותו על קרח לאורך כל ההליך מכתים.
    1. מחלק את אוכלוסיית התא לרבעים (AD) בעת ביצוע אופטימיזציה של assay. השתמש חלק א 'עד להעשיר תאי B אנטיגן ספציפי של שברים עניין, שימוש B ו- C כדי לקבוע את הספציפיות של העשרה / מכתים (ראה 2.5 ו 2.6 להלן), ושימוש חלק D כדי לקבוע את התדירות ואת מספר התאים אנטיגן ספציפי ב אוכלוסיית unenriched לאפשר חישוב התשואה ומקפלת-העשרה.
  3. להוסיף מחדש חסימת FcγR אדםסוכן שברים לספירה על הקרח כדי למנוע מחייב של נוגדנים לקולטנים Fc.
    הערה: בצע את ההוראות של היצרן עבור תנאים מתאימים.
  4. הוסף fluorochrome- מצומדות נוגדנים לתא אנטיגנים פני השטח של עניין שברים לספירה למשך 30 דקות על הקרח בחושך, נזהרים שלא לכלול fluorochromes שעשויים לחצות להגיב עם נוגדנים לצבוע אנטי מרחיקות אדום ניאון מצמידים חלקיקים מגנטיים.
    הערה: אלה כוללים conjugates נוגדנים צבע פלואורסצנטי ליד-IR, Cy5, Cy5.5, ו Cy7. כל כתמי כדאיות שנוספים צריכים להיות תואמים את השימוש מקבע. אם אחד אינו מתכוון לנתח את התאים באמצעות FACS, אבל לקבוע את תדירות מפרישי נוגדן, למשל, על ידי ELISPOT, מכתים משטח עם נוגדנים הוא מיותר.
  5. כדי לבדוק את הספציפיות של assay, דגירה הפרקציה B עם כמות מספקת של אנטיגן ללא תווית עבור 30 דקות על הקרח, כך שרוב קולטנים בעלי זיקה של לפחות10 -6 M חסומים.
    הערה: בדרך כלל, ריכוז התחלה טובה היא עודף לקפל 50-100 מסכום אנטיגן שדי ב 2.6 להלן (למשל 50-100 מיקרומטר). זה אמור לחסום כל תאי B עם זיקה גבוהה עבור אנטיגן ללא התווית להיקשר האנטיגן biotinylated, אשר מתווסף בשלב 2.6 להלן, ובכך מאפשרים אישור של הספציפיות של התאים המועשרים. שלב זה יכול להסתיים בשיתוף עם צעד 2.4 לעיל.
  6. הוסף אנטיגן biotinylated ל שברים A, B ו- D. דגירה על קרח למשך 30 דקות.
    הערה: ריכוז של אנטיגן biotinylated צריכה להיות טיטרציה לקבוע את הכמות האופטימלית הדרושה כדי להבטיח זיהוי נאות הפרדת מחייב תאי מתאי עוברים אורח שאינו ספציפיים. בדרך כלל ריכוז התחלה טובה המבחן הוא 1-5 מיקרומטר.
    הערה: לקבלת שברים A ו- D, שלב זה יכול להיעשות במקביל צעד 2.4 לעיל. לשבריר B, שלב זה צריך להיעשות לאחר שלב 2.5 (כביסה betwצעדים een הוא מיותר).
  7. השמט אנטיגן biotinylated מ שבר C כדי לקבוע כל עקדת תאי B כדי ריאגנטים אחרים בפרוטוקול, כגון לצבוע streptavidin- מרחיקות אדום ניאון ואת חרוזים מגנטיים.
  8. שטפו תאים פעמיים על ידי השעיה של תאים ב 1 מ"ל של חיץ קר FACS לכל 5 x 10 7 תאים צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  9. לאחר השטיפה של הדבר, לדלל השעית תא מרוכזת בפורמלין% 1 מיליליטר 2 לכל 5 x 10 7 תאים ולתת לשבת בחושך על קרח למשך 5 דקות.
    הערה: קיבוע של התאים בשלב זה מבטיח כי אנטיגן biotinylated נשאר קשור אל BCR עבור הנותרים של ההליך. עבור תאי קיימא - לניתוח במורד זרם, כגון ELISPOTs או עברות מאמצות, להשמיט את צעד הקיבעון.
  10. שטפו תאים פעמיים עם 1 מ"ל של חיץ קר FACS לכל 5 x 10 7 תאים צנטריפוגות ב 400 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.. Resuspend ב 1 מ"ל FACS קר חיץ לכל 5 x 107 תאים.
  11. להוסיף 1-2 מיקרוגרם streptavidin-מרחיקות אדום ניאון לצבוע / מ"ל ​​ו דגירה על קרח למשך 20 דקות בחושך. לכייל את כמות streptavidin עבור כל יישום.
  12. שטפו תאים פעמיים עם חיץ קר 1 מ"ל FACS לכל 5 x 10 7 תאים צנטריפוגות ב 400 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C. הכנת שהבר D הושלמה בשלב זה כפי שהוא לא יעבור העשרה באמצעות החרוזים המגנטיים.
    הערה: מדגם זה ישמש כדי לקבוע את התדירות ואת מספר תאי B אנטיגן ספציפי במדגם. זה ישמש כדי לקבוע את התשואה ומקפלת-העשרת מושגת על ידי העשרה.

עשרת Nanoparticle מבוסס 3. מגנטים

  1. תאים Resuspend ממדגמים AC ב 1 מ"ל של חיץ ההפרדה קר (PBS + 0.5% BSA + 2 מ"מ EDTA) לכל 5 x 10 7 תאים ולהעביר דרך פילטר 40 מיקרומטר לחסל כל גושים שיכול להדביק את הטור.
  2. הוסף חלקיקים לצבוע אנטי-Cy5 / Anti-מרחיקות אדום ניאון. For תוצאות אופטימליות, ריכוז חלקיקים יש טיטרציה עבור כל שימוש, אבל נקודת התחלה טובה היא 50 ההשעיה μl לכל 5 x 10 7 תאים / מ"ל. סובב בחושך ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
  3. שטפו פעמיים עם חיץ ההפרדה קר 1 מ"ל ב 400 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C. תאים Resuspend ב 1 מ"ל של חיץ ההפרדה קר לכל 5 x 10 7 תאים.

4. העשרה מגנטיים באמצעות LS או עמודות LD

  1. מניחים שלוש LS או עמודות LD בשדה המגנטי של מפריד מגנטי ולהוסיף 3 מ"ל של חיץ ההפרדה להרטיב את עמודות (ראה תיאור המוצר כדי לקבוע איזה סוג של העמודה המתאימה ביותר). אפשר את כל 3 מ"ל לעבור דרך העמודה וזורקים לאחר איסוף.
    הערה: למרות הפרדת התאים שכותרתו מגנטיים nanoparticle ניתן להשיג באמצעות כל אחד מהתקני הפרדה המגנטיים כי הם זמינים מסחריים, במעבדה צופה את ההצלחה הרבה ביותר עם השימוש בעמודי LS, ב terms של תשואה, טוהר, ויעילות של העשרה.
  2. מניחים שלושה צינורות חרוטי 15 מ"ל שכותרתו "הפרקציה A / (B) / (C) שלילי", עבור התאים שנבחרו באופן שלילי, תחת העמודה. מוסיפים את התאים המגנטי החלקיקים שכותרתו לעמודה שלהם ולאפשר את הכרך כולו לעבור.
  3. הוסף 3 מ"ל של חיץ ההפרדה קר פונה כלפי מעלה, להניח לזה לקרות דרך עמוד וחזור עם 2 מ"ל. איסוף התאים שנבחרו באופן שלילי ומניחים בצד על הקרח.
  4. הסר את העמודה מהשדה המגנטי ומניחים על גבי צינור חרוטי 15 מ"ל שכותרתו "הפרקציה A / (B) / (C) חיובי" עבור התאים שנבחרו באופן חיובי.
  5. מלאו את העמודה לפסגה עם כ -6 מ"ל של חיץ ההפרדה ומיד לצלול בכרך זה דרך העמודה לאסוף תאים שקשרו לשדה המגנטי באמצעות הבוכנה מסופק.
  6. כדי להגדיל טוהר, התאים שנבחרו באופן חיובי ניתן להעשיר עוד יותר באמצעות טור נקי שני, חזרה על proceפרוצדורה.
  7. ספין הן שברים שנבחרו באופן שלילי חיובי ב 400 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C ו להשעות בנפח הסופי הרצוי. המשך עם ניתוח במורד הזרם, כגון FACS, ELISPOT או העברת המאמצת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניתוח של טוהר, תשואה, ומקפלים-העשרה באמצעות cytometry זרימה

אוכלוסיות מועשר כמתואר לעיל בהכרח מכילים תאים זיהום שלא כבול streptavidin- לצבוע מרחיקות אדום ניאון אבל כלואים בתוך מטריקס. זיהומים אלו ניתן להסיר מאוכלוסיות מועשרות על ידי מיון FACS. כדי להעריך טוהר אוכלוסיות מועשרות, שער על תאים חיים המבוסס על קדימה וצד פיזור ו / או חי / כתם מת ולנתח מרחיקו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן אנו מתארים שיטה חדשה להשיג בידוד והעשרה של תאי B מחייב אנטיגן מדם היקפי אנושי. השיטה ישימה בקלות עכברים לרקמות אחרות, כגון בלוטות הטחול הלימפה, והוא תואם עם ניתוח שלאחר העשרת פנוטיפ תא והתפקוד (כתב יד בהכנה).

המשתמש צריך להיות מודע של מספר משתנים שיכולים להשפיע על ההצלחה של הליך זה. מניסיון תאים מתים נוטים להיצמד חרוזים המגנטיים "תופס" צבעי ניאון, כגון streptavidin-מרחיקות אדום הניאון לצבוע, מוביל ר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מה-JDRF (1-2008-994, 27-2012-450) והמכונים הלאומיים לבריאות (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201 ו-F30OD021477).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
משתנה משתנה אנטיגן מענייןלפחות 100 μ g לביוטינילט בקלות; אם אתה משתמש בחלבון, נסה להשתמש בחלבון שאומת על ידי ELISA. זה חייב להיות נשא  ללא חלבון.
ביוטין לתיוג; e. EZ link Sulfo-NHS-LC-BiotinThermo Scientific21335ביוטין זמין בתכשירים שונים, כגון אלה המכילים מרווחים באורכים שונים, כך שהסוג המשמש צריך להיקבע על ידי החוקר
Streptavidin-Alexa Fluor 647InvitrogenS21374יכול להשיג מספקים אחרים.
Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 MicrobeadsMiltenyi Biotech130-091-395
עמודות LSMiltenyi Biotech130-042-401
מפרידים ידנייםשל MACS Miltenyi Biotechמשתנה
פורמלדהידמדולל ל-2% עם PBS; אופציונלי אם בדיקה במורד הזרם דורשת תאים חיים
PBS ללא סידן ומגנזיום
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17-1440-02
דם מלא בשפופרות
מאגר FACS (PBS + 1% BSA + 0.01% נתרן אזיד)
מאגר הפרדה (PBS + 0.5% BSA + 2 מ"מ EDTA)
50 מ"ל צינורות חרוטיים
15 מ"ל צינורות חרוטיים
1.5 מ"ל שפופרות
נוגדנים תגובתיים לסמן פני השטח, Fc Block, כתם חי/מת, במידת הצורך
אספקת ELISPOT, במידת הצורך
איסוף הפריניותEppendorf

מקורות

  1. de Wildt, R. M., et al. A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells. J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).
  2. Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces. Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).
  3. Haas, W., Schrader, J. W., Szenberg, A. A new, simple method for the preparation of lymphocytes bearing specific receptors. Eur J Immunol. 4 (8), 565-570 (1974).
  4. Kenny, J. J., Merrill, J. E., Ashman, R. F. A two-step centrifugation procedure for the purification of sheep erythrocyte antigen-binding cells. J Immunol. 120 (4), 1233-1239 (1978).
  5. Snow, E. C., Vitetta, E. S., Uhr, J. W. Activation of antigen-enriched b cells. I. Purification and response to thymus-independent antigens. J Immunol. 130 (2), 607-613 (1983).
  6. Egeland, T., Hovdenes, A., Lea, T. Positive selection of antigen-specific B lymphocytes by means of immunomagnetic particles. Scand J Immunol. 27 (4), 439-444 (1988).
  7. Smith, M. J., et al. Loss of anergic B cells in prediabetic and new-onset type 1 diabetic patients. Diabetes. 64 (5), 1703-1712 (2015).
  8. Hulbert, C., Riseili, B., Rojas, M., Thomas, J. W. B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice. J Immunol. 167 (10), 5535-5538 (2001).
  9. Woda, M., Mathew, A. Fluorescently labeled dengue viruses as probes to identify antigen-specific memory B cells by multiparametric flow cytometry. J Immunol Methods. 416, 167-177 (2015).
  10. Nair, N., et al. Optimized fluorescent labeling to identify memory B cells specific for Neisseria meningitidis serogroup B vaccine antigens ex vivo. Immun Inflamm Dis. 1 (1), 3-13 (2013).
  11. Amanna, I. J., Slifka, M. K. Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches. Journal of immunological methods. 317 (1-2), 175-185 (2006).
  12. Scheid, J. F., et al. A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood. Journal of immunological methods. 343 (2), 65-67 (2009).
  13. Doucett, V. P., et al. Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry. Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).
  14. Malkiel, S., et al. Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry. Arthritis Rheumatol. , (2016).
  15. Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
  16. Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

FACSFcgamma

מאמרים קשורים