מתואר כאן היא שיטה לייצור ציטוקינים אקסוגניים בעכברים xenograft (PDX) נגזר החולה באמצעות הזרקה intraperitoneal שבועי של צינוקין transduced transromal שורה התא. שיטה זו מרחיבה את התועלת של PDX ומספקת את האפשרות עבור משלוח ציטוקינים אקסוגני חולף או מתמשכת במספר רב של מודלים PDX.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ביטוי של ציטוקינים אקסוגניים ב- Xenografts שמקורם בחולה באמצעות הזרקה באמצעות קו תאים סטרומל ציטוקינים
במאמר זה
סיכום
תקציר
עכברים שמקורם בחולה (PDX) שמקורם בחולה מיוצרים על ידי השתלת תאים אנושיים לעכברים חסרי מערכת החיסון. מודלים אלה הם כלי חשוב לחקר המנגנונים של hematopoiesis נורמלי וממאיר והם תקן הזהב לזיהוי chemotherapies יעיל עבור ממאירות רבות. מודלים PDX אפשריים כי רבים של ציטוקינים העכבר גם לפעול על תאים אנושיים. עם זאת, זה לא המקרה עבור כל ציטוקינים, כולל רבים כי הם קריטיים לחקר hematopoiesis נורמלי וממאיר בתאים אנושיים. טכניקות כי מהנדסים עכברים לייצר ציטוקינים אנושיים (מהונדס ודפיקות- in מודלים) דורשים הוצאה משמעותית לפני התועלת של המודל הוכח. טכניקות אחרות הן עבודה אינטנסיבית (הזרקה של ציטוקינים רקומביננטי או lentivirus) ובמקרים מסוימים דורשים רמות גבוהות של מומחיות טכנית (הזרקת הידרודינמית של דנ"א). דוח זה מתאר שיטה פשוטה ליצירת עכברים PDX כי יש אקסוגני האדם cyTokine (TSLP, thymic stromal lymphopoietin) באמצעות הזרקה intraperitoneal שבועי של stroma כי כבר transduced כדי overexpress זה ציטוקינים. השימוש בשיטה זו מספק מקור vivo של ייצור ציטוקינים רציפה כי משיגה רמות פיזיולוגיות של ציטוקינים האדם במחזור העכבר. רמות פלזמה של ציטוקינים אנושיים יכולים להיות מגוונים על סמך מספר התאים סטרומה מוזרק, ייצור ציטוקינים יכול להיות יזם בכל נקודה בניסוי. שיטה זו כוללת גם עכברים שליטה שלילית ציטוקינים המיוצרים באופן דומה, אבל באמצעות הזרקה intraperitoneal של stroma transduced עם וקטור שליטה. יש לנו הוכיחו בעבר כי תאים לוקמיה שנקטפו TSLP- להביע PDX, לעומת שליטה PDX, התערוכה ביטוי ביטוי הגן יותר כמו המדגם המטופל המקורי. יחד ציטוקינים בייצור ו- cytokine שלילי עכברים PDX המיוצרים על ידי שיטה זו מספקים מודל המערכת שבה השתמשנו בהצלחה ללמוד אתתפקיד TSLP ב hematopoiesis רגיל וממאיר.
מבוא
המטופל נגזר xenografts (PDX) הם חזקים מודל vivo לחקר הייצור של תאים hematopoietic הממאירים נורמלי בסביבה יונקים "יליד". לרוב, PDX מיוצרים על ידי הזרקת או השתלת תאים אנושיים לעכברים חסרי מערכת החיסון. הייצור של PDX באמצעות תאי גזע האדם hematopoietic רגיל מאפשר במחקרים vivo של דם אדם נורמלי ופיתוח תאים החיסון. PDX המיוצר מלוקמיה או תאי סרטן אחרים מאפשרים ללמוד מנגנונים oncogenic ולזהות טיפולים יעילים בהקשר של מגוון של נופים גנטיים ומוטציות הנוכחי באוכלוסייה האנושית. 1 כתוצאה מכך, PDX הם תקן הזהב הנוכחי עבור מחקר ביו-רפואי translational כדי לזהות טיפולים יעילים וכלי חשוב להבנת מנגנוני התקד....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מחקרים שנערכו בהתאם ל - Loma Linda University של טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדת (IACUC) ו מוסדיים סקירה מועצת המנהלים (IRB) אושרה פרוטוקולים ועל פי כל הנחיות הפדרלי.
זהירות: PDX ורקמות אנושיות יש לטפל בהתאם לנהלי בטיחות כדי למנוע העברת פתוגנים הנגרמים על ידי הדם.
1. תרבות והרחבה של תאים סטרומקליים ציטוקינים transduced
הערה: בכל פעם stroma הם passaged, למסוק supernatant תרבות (aliquot 1 מ"ל) ולאחסן ב -80 מעלות צלזיו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
סקירה של המודל מוצג באיור 1 . לאחר ציטוקינים בייצור (TSLP + stroma) ושליטה stroma הושגו הם מורחבים בתרבות. לפני הזרקת stroma לתוך עכברים, supernatant תא סטרומה מוערכת על ידי ELISA כדי לאמת את ייצור ציטוקינים ( איור 2 ) ו cyphometry זרימת phospho (פרוטוקול # 3) משמש כדי לאמת את הפעילות של ציטוקינים המיוצר על ידי stroma. Supernatant נאסף מתרביות תאים stromal confluent (stroma שליטה TSROP + stroma) כאשר תאים passaged........
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כתב היד מתאר שיטה פשוטה, מהירה, וחסכונית יחסית עבור הנדסת PDX להביע ציטוקינים אנושיים אקסוגניים. האסטרטגיה המתוארת כאן מבוססת על זריקות intraperitoneal שבועי של קו התא stromal transduced להביע את הציטוקין האנושי, TSLP. לפני ביצוע השיטות המתוארות כאן, stroma מהונדסים להביע רמות גבוהות של ציטוקינים של עניין (TSLP) ו סטרומה שליטה מהונדסים דומה נוצרו. בפרוטוקולים המוצגים כאן, stroma מורחבות התרבות והוקרן על היכולת לספק יציבה, ייצור ציטוקינים ברמה גבוהה לאורך זמן (או על היעדר ייצור ציט.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי NIH R21CA162259, NIH R01CA209829, NIH P20 MD006988, NIH 2R25 GM060507, מענק תקווה של יונדאי תקווה על גלגלים, המחלקה לפתולוגיה ואנטומיה אנושית, המחלקה למדעים בסיסיים, והמרכז לפערי בריאות ורפואה מולקולרית בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת לומה לינדה ועל ידי מענק לקידום מחקר שיתופי ותרגומי מאוניברסיטת לומה לינדה (KJP). התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של ה-NIH.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <ריאגנטים חזקים>רטובים במעבדה | |||
| T-75 בקבוק מטופל בתרבית רקמות פלקון, קיבולת 250 מ"ל, 75 ס"מ&2; שטח תרבית וכובע מאוורר | Corning Inc. / Fisher | 353136 | |
| בקבוק מטופל בתרבית רקמות בז T-150, קיבולת 600 מ"ל, 150 ס"מ&2; אזור תרבות & פקק מאוורר | Corning Inc. / Fisher | 355001 | |
| 10 מ"ל פיפטות סרולוגיות | Falcon | 357551 | |
| 15 מ"ל צינורות חרוטיים מפוליפרופילן | פישר | 05-539-12 | |
| 5 מ"ל צינורות פוליסטירן תחתונים עגולים | פלקון | 352054 | |
| 50 מ"ל צינורות חרוטיים מפוליפרופילן | 352098 | ||
| 2.0 מ"ל בקבוקונים קריוגנייםהברגה חיצונית | Corning Inc. / Fisher | 4230659 | |
| 1 מ"ל קצות פיפטה | פישר | 2707509 | |
| 200 μ, קצות פיפטה L | דנוויל סיינטיפיק | P3020-CPS | |
| 10 μ קצות פיפטה L | Denville Scientific | P-1096-CP | |
| יחידות סינון חד פעמיות סטריליות עם קרום SFCA, Nalgene Rapid-Flow | Fisher | 09-740-28D | |
| 2 NH2SO4 | BioLegend | 423001 | |
| Dulbecco' s תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) ללא קליציום ומגנזיום, 1& פעמים; | קורנינג סלגרו / מדיטק | 21-031-CV | |
| אנושי TSLP ELISA מקס דלוקס סט | BioLegend | 434204 | |
| 3% חומצה אצטית עם טכנולוגיות תאי גזע כחולים מתילן | 7060 | ||
| טריפן כחול | קורנינג | 25-900-Cl | |
| "טריפסין" 1x 0.25% טריפסין 2.21 מ"מ EDTA ב-HBSS | ThermoFisher | 25-053 | |
| TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P-7949< | |
| חזק>" R10" מדיום תרבית תאים, % מהנפח הכולל (יוצר 565 מ"ל) | - | <חזק>- | <חזק>מתכון מעבדה |
| RPMI, 88.5% (500 מ"ל) | מדיטק | 10-040-CV | |
| FBS, 9.9% (56 מ"ל) | Mediatech | 35-011-CV | |
| L-גלוטמין, 0.99% (5.6 מ"ל) | מדיאטק | 25-005-Cl | |
| פניצילין-סטרפטומיצין, 0.50% (2.8 מ"ל) | Mediatech | 30-002-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol, 0.10% (560 & מיקרו; L) | חבר פרלמנט | 190242 | |
| <חזק>" R20" מדיום תרבית תאים, % מהנפח הכולל (עושה 195 מ"ל) | - | -< | חזק>מתכון מעבדה |
| RPMI, 76.84% (150 מ"ל) | ראה לעיל | ראה לעיל | |
| FBS, 20.49% (40 מ"ל) | ראה לעיל | ראה לעיל | |
| 2 מ"מ L-גלוטמין, 1.02% (2 מ"ל) | ראה לעיל | ראה לעיל | |
| 1 מ"מ Na pyruvate, 1.02% (2 מ"ל) | ראה לעיל | ראה לעיל | |
| פניצילין-סטרפטומיצין, 0.51% (1 מ"ל) | ראה לעיל | ראה לעיל | |
| 2-מרקפטואתנול, 0.10% (0.1 מ'), 0.10% (200 ומיקרו; L) | ראה לעיל | ראה לעיל | |
| <חזק>" מדיום הקפאה", % מהנפח הכולל | - | <חזק>- | <חזק>מתכון מעבדה |
| >" R10" בינוני, 45% | ראה מתכון "R10" | - | |
| FBS, 20% | ראה לעיל | 35-011-CV | |
| DMSO, 10% | קורנינג | 25-950-CQC | |
| D(-)(+)-טרהלוז דיהידרט, 5% | פישר סיינטיפיק | BP2687-100 | |
| <חזק>שם | <חזק>חברה | <חזק>מספר קטולוג | תגובות |
| Biologics < / חזק > | |||
| "HS-27" HS-27A קו סטרומה אנושי | ATCC | CRL-2496 | |
| "CALL-4" MHH-CALL-4 קו תאים, לוקמיה מבשר תאי B אנושיים | DSMZ | ACC 337 | |
| " עכברי NSG" הנהון. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, זכר או נקבה, גיל 6 – 8 שבועות | עכברי JAX | # 005557 | |
| קו תאי MUTZ-5, לוקמיה קודמת של תאי B אנושיים | DSMZ | ACC 490 | |
| רקומביננטי חלבון TSLP אנושי | R& D Systems | 1398-TS-010 | |
| Name | Company | >>Quet Number | |
| >Flow cytomery נוגדנים (שיבוט)* | |||
| נגד עכבר CD45 FITC (30F11) | Miltenyi Biotec | 130-102-778 | |
| CD127 PE (MB15-18C9) (השם החלופי הוא IL-7Rα) | Miltenyi Biotec | 130-098-094 | |
| CD34 APC (8G12) | BD Biosciences | 340667 | |
| CD45 PE-Cy7 (HI30) | eBioscience | 25-0459 | |
| "FVD" צבע כדאיות ניתן לתיקון eFluor 780 | eBioscience | 65-0865 | |
| Ig κ שרשרת קלה FITC (G20-193) | BD Pharmingen | 555791 | |
| Ig λ שרשרת קלה FITC (JDC-12) | BD Pharmingen | 561379 | |
| IgD PE (IA6-2) | BioLegend | 348203 | |
| IgM PE-Cy5 (G20-127) | BD Biosciences | 551079 | |
| pSTAT5 PE, עכבר אנטי-STAT5 (pY694) | BD PhosphoFlow | 612567 | |
| <חזק>שם | <חזק>חברה | <חזק>קטולוג מספר | <חזק>תגובות |
| ><חזק>חומרים וציוד אחרים משדר ננו מושתל | |||
| בעלי חיים עם צינורית | טרובן | ID-100B(1.25) | |
| קרם הרדמה לידוקאין EMLA (הושג על ידי פרשיפציה דרך מתקן לטיפול בבעלי חיים) | מרשם | ||
| BD ½ סמ"ק LO-DOSE U-100 מזרק אינסולין 28G½ | צינורות BD | #329461 | |
| BD Microtainer עם K2EDTA | BD | #365974 | |
| צנטריפוגה | בקמן קולטר | אלגרה X-15R | |
| צינורות נימיים של FisherBrand (Heparinized) | Fisher Scientific | 22-260-950 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| כלוב פאי עכבר | Braintree Scientific, Inc. | MPC-1 | |
| Mouse Tail Illuminator Restrainer | Braintree Scientific, Inc. | MTI STD | |
| אחיזת אקדח משתיל | Trovan | IM-300 (1.25) | |
| ומיקרו; כמות | ביו-טק אינסטרומנטס בע"מ | MQX200 | |
| FlowJo תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה | FlowJo, LLC | גרסה 10 | |
| *כל הנוגדנים הם אנטי אנושיים אלא אם כן צוין אחרת. |
מקורות
- Francis, O. L., Milford, T. A., Beldiman, C., Payne, K. J. Fine-tuning patient-derived xenograft models for precision medicine approaches in leukemia. J Investig Med. 64 (3), 740-744 (2016).
- Parrish, Y. K., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
