הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ביטוי של ציטוקינים אקסוגניים ב- Xenografts שמקורם בחולה באמצעות הזרקה באמצעות קו תאים סטרומל ציטוקינים

8.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55384

⸱

10 במאי 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Human Anatomy, Loma Linda University, 2Department of Basic Sciences, Loma Linda University, 3Department of Medicine, Loma Linda University

במאמר זה

סיכום

מתואר כאן היא שיטה לייצור ציטוקינים אקסוגניים בעכברים xenograft (PDX) נגזר החולה באמצעות הזרקה intraperitoneal שבועי של צינוקין transduced transromal שורה התא. שיטה זו מרחיבה את התועלת של PDX ומספקת את האפשרות עבור משלוח ציטוקינים אקסוגני חולף או מתמשכת במספר רב של מודלים PDX.

תקציר

עכברים שמקורם בחולה (PDX) שמקורם בחולה מיוצרים על ידי השתלת תאים אנושיים לעכברים חסרי מערכת החיסון. מודלים אלה הם כלי חשוב לחקר המנגנונים של hematopoiesis נורמלי וממאיר והם תקן הזהב לזיהוי chemotherapies יעיל עבור ממאירות רבות. מודלים PDX אפשריים כי רבים של ציטוקינים העכבר גם לפעול על תאים אנושיים. עם זאת, זה לא המקרה עבור כל ציטוקינים, כולל רבים כי הם קריטיים לחקר hematopoiesis נורמלי וממאיר בתאים אנושיים. טכניקות כי מהנדסים עכברים לייצר ציטוקינים אנושיים (מהונדס ודפיקות- in מודלים) דורשים הוצאה משמעותית לפני התועלת של המודל הוכח. טכניקות אחרות הן עבודה אינטנסיבית (הזרקה של ציטוקינים רקומביננטי או lentivirus) ובמקרים מסוימים דורשים רמות גבוהות של מומחיות טכנית (הזרקת הידרודינמית של דנ"א). דוח זה מתאר שיטה פשוטה ליצירת עכברים PDX כי יש אקסוגני האדם cyTokine (TSLP, thymic stromal lymphopoietin) באמצעות הזרקה intraperitoneal שבועי של stroma כי כבר transduced כדי overexpress זה ציטוקינים. השימוש בשיטה זו מספק מקור vivo של ייצור ציטוקינים רציפה כי משיגה רמות פיזיולוגיות של ציטוקינים האדם במחזור העכבר. רמות פלזמה של ציטוקינים אנושיים יכולים להיות מגוונים על סמך מספר התאים סטרומה מוזרק, ייצור ציטוקינים יכול להיות יזם בכל נקודה בניסוי. שיטה זו כוללת גם עכברים שליטה שלילית ציטוקינים המיוצרים באופן דומה, אבל באמצעות הזרקה intraperitoneal של stroma transduced עם וקטור שליטה. יש לנו הוכיחו בעבר כי תאים לוקמיה שנקטפו TSLP- להביע PDX, לעומת שליטה PDX, התערוכה ביטוי ביטוי הגן יותר כמו המדגם המטופל המקורי. יחד ציטוקינים בייצור ו- cytokine שלילי עכברים PDX המיוצרים על ידי שיטה זו מספקים מודל המערכת שבה השתמשנו בהצלחה ללמוד אתתפקיד TSLP ב hematopoiesis רגיל וממאיר.

מבוא

המטופל נגזר xenografts (PDX) הם חזקים מודל vivo לחקר הייצור של תאים hematopoietic הממאירים נורמלי בסביבה יונקים "יליד". לרוב, PDX מיוצרים על ידי הזרקת או השתלת תאים אנושיים לעכברים חסרי מערכת החיסון. הייצור של PDX באמצעות תאי גזע האדם hematopoietic רגיל מאפשר במחקרים vivo של דם אדם נורמלי ופיתוח תאים החיסון. PDX המיוצר מלוקמיה או תאי סרטן אחרים מאפשרים ללמוד מנגנונים oncogenic ולזהות טיפולים יעילים בהקשר של מגוון של נופים גנטיים ומוטציות הנוכחי באוכלוסייה האנושית. 1 כתוצאה מכך, PDX הם תקן הזהב הנוכחי עבור מחקר ביו-רפואי translational כדי לזהות טיפולים יעילים וכלי חשוב להבנת מנגנוני התקדמות סרטן. מודלים PDX הם כלי חיוני כדי לסייע במחקר לתוך מחלות פערים בריאותיים עקב ספציפיות נגעים גנטיים, או כל מחלה שבה הווריאציות של הנוף הגנטי של המטופל יכולות לתרום באופן משמעותי לאונקוגנזה ולתוצאות הטיפול.

עכבר האדם מודלים PDX אפשריים בגלל ציטוקינים רבים העכבר כראוי לחקות האנלוגים האנושיים שלהם הפעלת קולטנים ציטוקינים של תאים אנושיים בזמן שהם בתוך העכבר. לדוגמה, אינטרליוקין -7 (IL-7) מספק אות קריטי לפיתוח תאי B. 2 במקרה זה, עכבר IL-7 יש מספיק הומולוגיה עם IL-7 האנושי כי ציטוקין העכבר מגרה נתיבי איתות בבשר מבשר התא האנושי. 5 , 6 , אשר בין ציטוקינים אחרים (IL-3, גרנולוציטים-מקרופאג מושבה גורם מגרה (GM-CSF), גורם תא גזע (SCF) ,Ref 7 "חשוב לייצור תאים הומאופויטים נורמליים וממאירים, כאשר ציטוקינים של עכברים ושל בני אדם מציגים הומולוגיה נמוכה, הציטוקינים של העכבר אינם מפעילים את הקולטנים שלהם על תאים אנושיים.כדי להתגבר על מכשול זה, נעשה שימוש במספר אסטרטגיות כדי להביע את הביטוי של ציטוקינים אנושיים בעכברים PDX.זה כולל הזרקה של ציטוקינים אנושיים רקומביננטי, הזרקת הידרודינמית של דנ"א, ביטוי lentiviral, ביטוי מהונדס תחליף הגן knockin 7. דוח זה מתאר שיטה להנדסה PDX לייצר ציטוקינים אנושיים באמצעות stromal בתיווך משלוח ציטוקינים ( איור 1 ).

בשיטה הפגינו כאן, עכברים PDX מתוכננים להביע את הציטוקין האנושי, TSLP, או לשמש שולטת ציטוקינים שלילי. TSLP- להביע PDX מושגות על ידי זריקות intraperitoneal שבועי של תאים stromal כי כבר transduced להביע רמות גבוהות של TSLP האדם.ציטוקינים שלילי PDX "שליטה" עכברים הם מהונדסים באופן דומה; אם כי stroma שליטה transduced עם וקטור שליטה. שיטה זו משיגה רמות פיזיולוגיות נורמלי של TSLP האדם בעכברים PDX מוזרק עם stroma TSLP. לא TSLP לזיהוי הוא ציין בעכברים PDX קבלת stroma ציטוקינים שלילי. בחרנו את קו התא האנושי stromal HS-27A עבור המחקר שלנו כי הוא גדל בחוזקה בתרבות מראה רמה נמוכה מאוד של ייצור ציטוקינים כי אינו תומך התפשטות של תאים אב מבודד cocultures. 8 עבור הביטוי TSLP האנושי, stroma היו transduced עם הדור מתקדם עצמית- inactivating וקטור lentiviral נגזר עמוד שדרה שתואר בעבר, 9 וכולל את האלמנט cPPT / CTS ואת הפטיטיס וודצוק שלאחר אלמנט תמלילי שלאחר (WPRE) כדי להגדיל את הביטוי transgene. הגן TSLP האנושי נבנה לתוך וקטור זה תחת שליטה של ​​גורם הארכה -1(EF-1) מקדם אלפא כדי להשיג ביטוי חזק, מכונן, לטווח ארוך.

ההנדסה של אדם זה ציטוקינים משופרת PDX מודל מורכב של 4 שלבים עיקריים. ראשית, transduced stransa מורחבות במבחנה ולהעריך על ידי אנזים מקושרים immunayorbent assay (ELISA) לייצור יציב, ברמה גבוהה ציטוקינים. שנית, פעילות של ציטוקינים אנושיים המיוצרים על ידי תאים סטרומה transduced (וחוסר פעילות ציטוקינים מ stroma שליטה) מאומת באמצעות cytometry זרימת phospho. תאים תאים ידועים להגיב לציטוקינים של עניין (במקרה זה, TSLP) מודגרת עם supernatant תא סטרומה assayed עבור זירזום המושרה ציטוקינים. שלישית, עכברים מוזרקים עם stroma האדם transduced ולאחר מכן פלזמה העכבר מוערך על ידי ELISA עבור רמות של ציטוקינים האדם על בסיס שבועי. הרביעי, תאים hematopoietic האדם מושתלים ואת ההשפעות תפקודית vivo של הציטוקין האנושי מוערכת על יעד ידוע ( לדוגמה. אוכלוסיית תאים).

figure-introduction-1
איור 1: PDX דגם מתוכנן לייצר ציטוקינים אנושיים אקסוגניים בעכברים. ( 1A ) ניסוי עיצוב ולהשיג transduced תאים סטרומה האדם ( 1B ) השגת תאים אנושיים (תאי גזע hematopoietic, תאי לוקמיה, וכו ' ) כדי לייצר עכברים PDX (שנבע מטופל xenograft) עכברים. ( 2A ) להזריק סטרומה מהונדסים ( 2B ) להשתלות תאים אנושיים לתוך עכברים לקוי החיסון לפי לוח הזמנים הניסויי. ( 3A-B ) צג ריכוזי ציטוקינים ב supernatant stroma ואת פלזמה העכבר על ידי ELISA. ( 4 ) קציר תאים אנושיים ולהעריך את ההשפעות תפקודית vivo של ההווה ציטוקינים האדם PDX. בבקשה לחץ כאןכדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

משלוח של ציטוקינים אנושיים באמצעות תאים סטרומה מציע גם יתרונות וחסרונות בהשוואה לשיטות אחרות של אספקת / ייצור ציטוקינים אנושיים בעכברי PDX. לעומת הזרקה של ציטוקין אנושי רקומביננטי, מתן סטרומה מתווכת הוא בדרך כלל פחות יקר (העלות של תרבות התא סטרומה הוא פחות מאשר העלות של ציטוקין רקומביננטי) ופחות עבודה אינטנסיבי (הזרקת אחת בשבוע לעומת הזרקות מרובות בשבוע). הנושא של מחצית החיים ציטוקינים קצר הוא גם להקל מאז stroma לייצר ללא הרף את הציטוקינים אקסוגני. משלוח של ציטוקינים באמצעות הזרקה הידרודינמית של דנ"א עשוי להיות זול יותר מאשר משלוח באמצעות stroma. עם זאת, הוא חולף באופן דומה עשוי לדרוש יותר מיומנות טכנית מאשר הזרקת intraperitoneal שבועי פשוט נדרש עבור משלוח stroma בתיווך. ביטוי גנטי lentiviral העכבר עשוי לספק פחות traהשיטה המקובלת של משלוח ציטוקינים; עם זאת, בידינו רמות TSLP פיזי לא הושגו. בנוסף, שיטה זו היא עבודה אינטנסיבית, הדורשת ייצור רציף של וקטור lentiviral. עכברים מהונדס או לדפוק ב להציע יציבה לטווח ארוך ביטוי של ציטוקינים והוא יכול להיות מהונדסים עבור ביטוי רקמות ספציפיות, אשר יכול להיות יתרון. מצד שני, הביטוי הטרנסגני של הגן ציטוקינים האדם על רקע עכבר לקוי החיסונית הנדרשת עכברים PDX, מחייב השקעה עצומה של משאבים לפני הערך של המודל הוקם. יתר על כן, מודלים מהונדס אינם מאפשרים בדרך כלל את האפשרות של שינוי העיתוי של חניכה ציטוקינים או רמת הייצור ציטוקינים vivo . אלה יכולים להיות מושגת עם משלוח stroma בתיווך פשוט על ידי שינוי נקודת הזמן ליזום הזרקת תא סטרומה או מינון של תאים סטרומה מוזרק.

התאים סטרומה בתיווך ציטוקין בתיווךOd מפורט כאן שימש לפתח PDX להערכת התפקיד של TSLP ב נורמלי התא האנושי B התפתחות 4 , 6 ו בסיכון גבוה B- תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה. שיטה זו מספקת שיטת חלופה לציטוקינים חלופיים לשימוש בהפקת מודלים דומים עם ציטוקינים אנושיים שאינם TSLP. מודל זה יכול גם להיות שימושי עבור יצירת נתונים ראשוניים שיכולים לעזור לקבוע אם הערך של ציטוקינים מהונדס ציטוקינים או ציטוקין לדפוק ב- PDX המודל יהיה ראוי להשקעה זמן וכסף משמעותי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקרים שנערכו בהתאם ל - Loma Linda University של טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדת (IACUC) ו מוסדיים סקירה מועצת המנהלים (IRB) אושרה פרוטוקולים ועל פי כל הנחיות הפדרלי.

זהירות: PDX ורקמות אנושיות יש לטפל בהתאם לנהלי בטיחות כדי למנוע העברת פתוגנים הנגרמים על ידי הדם.

1. תרבות והרחבה של תאים סטרומקליים ציטוקינים transduced

הערה: בכל פעם stroma הם passaged, למסוק supernatant תרבות (aliquot 1 מ"ל) ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס לכימות בעתיד של רמת ציטוקינים באמצעות assay ELISA.

  1. הכן בינוני R10 תרבות בינוני מקפיא כמתואר בלוח של חומרים.
  2. ליצור 10 , 11 או להשיג שליטה stroma (transduced עם וקטור ריק) ו ציטוקינים בייצור (TSLP +) stroma."6 חנות בחנקן נוזלי (LN 2 ) עד לשימוש.הפסק תאים סטרומה כמתואר 12 וצלחת אותם 5 מ"ל של המדיום R10 בצנרת נפרדת T-25 תרבות תאים.תרבות תאים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. זהו שלאחר ההפשרה "מעבר # 1".
  3. לאחר stroma הם confluent (24-48 h), תאים המעבר על ידי trypsinizing באמצעות 1 × טריפסין EDTA (0.25%) ו ציפוי מחדש של בקבוק T-150 תרבות. זה לאחר הפשרה "מעבר # 2".
  4. כאשר stroma להשיג confluency של T-150 צלוחיות (3-4 ימים מאוחר יותר), מעבר התאים על ידי trypsinizing. השתמש ההשעיה תא לצרכים ניסיוניים.
    1. הרחבת תאים למספר צלוחיות
      1. פיצול התאים שנקטפו בין שלוש T-150 צלוחיות ותרבות עד confluent. חזור על שלב זה אם יש צורך בהרחבת סטרומה. טיפוסית סטרומה אנושית (HS-27A) לספור תאים בבית המפגש בקבוק T-150 הוא ~ 5 x 10 6 .
    2. תא sלזעום
      1. מעבירים את ההשעיה תא שנקטפו צינור חרוטי צנטריפוגות ב XG 500 במשך 5 דקות, decant supernatant ו resuspend התאים במדיום מקפיא. להקפיא ולאחסן LN 2 ~ 1.5 x 10 6 תאים לכל בקבוקון.
    3. עבור intra periototoneal זריקות stroma לתוך עכברים, המשך לשלב 4.1.

2. מבחני ELISA לפקח על ייצור ציטוקינים במבחנה מ Transduced Stroma

  1. רכישה מסחרית זמין ELIA assay Kit לזהות את ציטוקינים של עניין.
  2. להפשיר supernatant תא סטרומה מן השליטה ציטוקינים בייצור (TSLP +) stroma שנקטפו בתחילת, באמצע ו מעברים מאוחר ( איור 2 ).
  3. קביעת ריכוז TSLP בדגימות supernatant באמצעות ערכת ELISA על פי הוראות היצרן. 13 לקמפל נתונים טורי אלה כדי לפקח על יציבות הייצור ציטוקינים במהלך cultur התא E ( איור 2A-B ).
    1. לזהות ולבטל stroma לייצר ציטוקינים עם ביטוי ציטוקינים מופחת או תת אופטימלי, כמו גם כל בקבוקונים המקביל האחסון ( איור 2A-B ).
    2. לזהות ולתחזק ציטוקינים בייצור ציטוקינים המפגינים ריכוז ציטוקינים ברמה יציבה. השתמש אלה המפשיר עבור ניסויים.
  4. השתמש בערכת ELISA כדי לפקח באופן שגרתי על stroma לאורך כל תקופת התרבות התא (לפחות פעם אחת במהלך מוקדם, באמצע ומאוחר שלאחר הפשרה מעברים) כדי להבטיח ייצור ציטוקינים יציב או, במקרה של stroma שליטה, היעדר ייצור ציטוקינים .

3. Phospho זרימת cytometry מבחני להעריך את הפעילות של ציטוקינים המיוצר על ידי Stroma

הערה: להעריך את supernatant מהסטרומה מהונדסים לפני הניסוי הראשון כדי לאמת את הפעילות הביולוגית הרלוונטית של ציטוקינים שנוצר stroma לניסוי הפרט.Ef "> 6 לאחר אישור הסטרומה המהונדסת, בדיקה נוספת אינה הכרחית אלא אם כן יוצגו סטרומה שיוצרו עם וקטור חדש.

  1. רכישת MUTZ5 ו / או MHH-CALL4 תאים לוקמיה תאים (תגובה TSLP), 14 ציטוקינים אנושיים רקומביננטי, ונוגדנים שאושרו לשימוש מבחני cytometry זרימת phospho לזהות מטרות זירזונה במורד המתאים.
  2. ההפשרה שנקטפו supernatant מ שליטה ציטוקינים להביע stroma.
  3. פלייט שורות תאים לוקמיה במדיום R20 (ראה טבלה של חומרים ) בריכוז של 0.2 x 10 6 תאים לכל היטב צלחת 96 רקמה תרבות טובה. צלחת 3 בארות לכל תנאי כדי לאפשר מבחני trilicate. לדגור על 2 שעות ב 37 ° C. הפעם מאפשר אובדן של זרחון כלשהו שהתרחש במהלך תנאי התרבות הקודמת.
    הערה: 12 בארות לכל שורה התא מספק מבחני trilicate עבור כל תנאי הניסוי שמוצג בשלב 3.4.
  4. לאחר 2 שעות בתרבות, להעביר את התאים מכל היטב להפריד צינורות 4 מ"ל ו צנטריפוגות ב XG 500 במשך 5 דקות, ב 4 ° C. למזוג את supernatant.
    1. Re- להשעות את התאים μL 200 עבור כל אחד התנאים הניסוייים הבאים (ביצוע מבחני בשלושה עותקים): 1) שליטה שלילי התקשורת בלבד, 2) שליטה חיובית התקשורת עם ציטוקין רקומביננטי ב ריכוז ריכוז (ים) (TSLP ב 15 ng / ML, וכו ' ), 3) שליטה stroma supernatant מ stroma שליטה, ו 4) ציטוקינים- stroma- supernatant מ stroma ציטוקינים בייצור.
  5. דגירה התאים למשך שצוין על ידי ספציפי ספציפי phospho assay ( למשל 30 דקות עבור phospho-STAT5 ב MUTZ5 או MHH-CALL4 בתגובה TSLP).
  6. צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C ו decant supernatant.
  7. בצע phospho זרימת cytometry מכתים לכל פרוטוקול של היצרן ולאסוף נתונים cytometry זרימה. 15
  8. ניתוח זרימת נתונים cytometry. 15
    1. שער על תאים שלמים המבוססים על קדימה (FSC, מציין גודל התא) ואת הצד (SSC, מציין את רמת התאיות) פיזור האור.
    2. לקבוע את עוצמת פלורסנט חציון (MFI) של תאים שלמים במדגם זה. השווה את ממוצע MFI שהושג מן הערכים trilicate של supernatant תא stromal לזה של שולטת מדיה חיובית ושלילית.

4. הזרקה של ציטוקינים- Transduced Stroma לתוך עכברים

הערה: תרבות HS-27A stroma עבור מינימום של 3 שלאחר הפסק מעברים לפני הזרקתם לתוך עכברים כדי להבטיח תאים בריאים ייצור ציטוקינים נאותה.

  1. הכנת סטרומה
    1. מעבירים את ההשעיה תא stromal שנקטפו צינור חרוטי aliquot 10 μL לספירת hemocytometer; להשיג ספירת תאים חיים באמצעות כחול Trypan. 16 צנטריפוגה הנותרים CELl ההשעיה ב 500 xg במשך 5 דקות.
    2. לשאוב supernatant מן תאים גלולה בעדינות resuspend התאים בנפח הצורך של מלוחים סטרילי פוספט שנאגרו (PBS) עבור הזרקת העכבר (בהתאם למספר עכברים להזריק).
      הערה ריכוז תאי סטרומה טיפוסי הזרקת העכבר: 0.5 x 10 6 -5 x 10 6 תאים לכל עכבר 200 μL PBS.
    3. שמור על ההשעיה תא stromal ב 4 ° C (או על קרח) עד מיד לפני ההזרקה. ודא ההשעיה התא הוא לפחות בטמפרטורת החדר (RT) (~ 25 מעלות צלזיוס) עבור הזרקת עכברים.
  2. הזרקת תא סטרומה
    1. לחטא את מכסה המנוע ביו בטיחות, להרכיב חומרים עבור זריקות ולאחר מכן למקם את כלוב העכבר בפנים.
    2. בעדינות לערבב את ההשעיה התא על ידי היפוך לפני ציור 200 μL לתוך מזרק tuberculin.
    3. שימוש בטכניקות הזרקה סטנדרטיות תוך-פריטיות, 17לרסן את העכבר ולנהל את ההשעיה 200 תאים μL לתוך חלל הצפק. פרטים הוכיחו בעבר על ידי Machholz et al. 18

5. סידורי דם אוסף פלזמה ניטור עבור ציטוקינים האדם אקסוגני בעכברים

  1. איסוף דם דרך זנב זנב
    1. לחטא את מכסה המנוע biosafety ולהרכיב עכבר מסגר, מספריים וכלים אחרים / ציוד עבור ההליך.
    2. מניחים את העכבר מסננת ולאבטח את הצינור כדי למזער את תנועת העכבר.
    3. לחטא את הזנב ומספריים כירורגית עם אלכוהול איזופרופיל. החל קרם הרדמה מקומית על הזנב.
    4. באמצעות מספריים כירורגי חד מאוד לגזור על 0.5 - 1 מ"מ של קצה הזנב של העכבר. איסוף כ 80 μL של דם היקפי באמצעות צינורות נימי heparinized.
      הערה: אם הדם ייאסף בשיטה זו יותר משישה tiMes, הסרת זנב צריך להיות שמרני ביחס לכמות הזנב הוסר. כפי snips התקדמות הזנב את הקוטר עולה, זה דימום מהר יותר, ריפוי לוקח יותר.
  2. הפרדת פלזמה
    1. מעבירים את הדם באמצעות מזרק נורה (לגרש אותו צינורות נימי) לתוך צינור מסומן K2 EDTA צינור; הפוך 20 פעמים כדי למנוע קרישה.
      הערה: בדרך כלל קרישת דם מן הזנב הוא מהיר. עם זאת, אם דימום נמשכת יותר מ ~ 2 דקות להשתמש בעיפרון / אבקה סטפטי כדי לסייע בקרישה.
    2. צנטריפוגה צינורות איסוף דם על פי הוראה של היצרן aliquot פלזמה לאחסון (-20 מעלות צלזיוס) עד מוכן assay ELISA.
    3. אם הנתונים עכבר האדם תאים chimerism יש צורך מן הדם העכבר, ולאחר מכן לטפל גלולה הנותרים כמתואר בשלב 6.3.1. אחרת, להשליך את הכדור גלולה התא.
  3. השתנה ELISA עבור micro-volאדים של פלזמה העכבר
    הערה: ההליך ELISA של היצרן השתנה מ 100 נפח מדגם μL מומלץ ל 40 נפח μL כדי להתאים את הכרכים מיקרו שנאספו עכברים. זה לא ניתן להפעיל את in vivo העכבר דגימות פלזמה בשלושה עותקים עם אלה כרכים מוגבל. בסוף הניסוי ~ 500 μL של דם לאחר המוות הוא נאסף באמצעות לנקב לב. ריכוז ציטוקינים מוערך μL 100 של פלזמה המתת חסד משמשים כדי לאמת את μL 40 בנתונים vivo עבור כל עכבר.
    1. להפשיר קפוא דגימות פלסמה העכבר.
    2. סדרתי לדלל את הסטנדרטים ELISA וצלחת אותם בשלושה עותקים μL 40 לכל טוב.
    3. הוסף 40 μL של כל מדגם פלזמה העכבר לצלחת ELISA.
      הערה: אם מדגם העכבר הוא פחות מ 40 μL, ואז להביא את עוצמת הקול עד 40 μL עם חיץ ELISA. שיא זה נפח diluent ולהשתמש בו כדי לחשב גורם דילול עבור כל מדגם מדולל. מתיניתוח נתוני ELISA להכפיל את ריכוז מדגם מדולל על ידי גורם הדילול של המדגם כדי לקבוע את ריכוז ציטוקינים בפועל במדגם המקורי.
    4. Assay להשלים ELISA על פי הוראות היצרן.

6. השתלת תאים המטופויטים לתוך עכברים

  1. הקרנה תת-קרקעית למח עצם מוח עצם להשתלה
    הערה: אוניברסיטת לומה לינדה (LLU) משתמשת במקור קרינה Cobalt-60. בעלי חיים ממוקמים בתוך מאפרת פאי אשר ממוקם 80 ס"מ ממקור הקרינה בתחום 20 x 20 ס"מ עם 0.5 ס"מ שכבת לקסאן על גבי האיזון. זמן חשיפה מחושב כדי להשיג 225 cGy מינון מבוסס על הכיול האחרון של המקור (כרגע 2-3 דקות עבור מקור זה).
    1. תת עכבר להקרין עכברים (סך קרינה הגוף מינון של 225 cGy מקסימלית עבור עכברים לקוי החיסון).
    2. השתלת תאים hematopoietic ~ 24 שעות מאוחר יותר באמצעות </ Em> הזרקת וריד הזנב תוך ורידי.
  2. השתלת תאים ההמטופויטים תוך ורידי
    1. הכנת מתלים התא האנושי להשתלה בנפח של 200 μL סטרילי PBS לכל עכבר: CD34 + תאי גזע hematopoietic (HSC): 1 x 10 5 עד 5 x 10 5 תאים לכל עכבר שורות תאים לוקמיה / דגימות המטופל: 1 x 10 6 5 x 10 6 תאים לכל עכבר.
    2. שמור תאים 4 ° C (הובלה על הקרח) עד מיד לפני ההשתלה. ודא התאים לפחות ב RT לפני ההשתלה.
    3. לחטא את מכסה המנוע ביו בטיחות ולהכין את מכסה המנוע עבור זריקות להשתלות.
    4. מניחים את העכבר בכלוב התחממות לפחות 5 דקות כדי לאפשר התרחבות של הוורידים הזנב.
    5. בעדינות לערבב את ההשעיה התא לצייר 200 μL לתוך מזרק tuberculin. בבטחה להגדיר את המחט בצד איפה זה יישאר סטרילי.
    6. מניחים את העכבר באיפוק ומחטאים את הזנב עם אלכוהול איזופרופיל/ Li>
    7. באמצעות טכניקות הזרקת תוך ורידי רגיל, 17 להזריק את ההשעיה התא האנושי לתוך וריד זנב העכבר.
      הערה: הזרקת זנב זנב עשוי להימשך מספר ניסיונות, במיוחד עבור המטפל החיה טירון. Kovacscics ו Raper של JoVE וידאו 19 מספק הדגמה מפורטת של טכניקה זו חיה.
    8. מעקב אחר התאוששות העכבר במשך 5 דקות ~. הקלט כל תופעות לוואי במהלך ההזרקה ( למשל תאים שנשפכו, דימום מרכזי, טראומה זנב מופרז).
  3. ניתוח של חיידקים התא האנושי בדם היקפי העכבר
    1. השג את הכדור גלולה התא שנותר צינור microtainer לאחר ההפרדה פלזמה (שלב 5.2.3).
    2. עבור תא דם אדום (RBC) תמוגה, resuspend את גלולה הדם הנותר בהיקף של PBS שווה פלזמה הוסר (כדי להחליף נפח פלזמה) ומערבבים היטב (מערבולת / פיפטה).
    3. העברת כל מדגם דם מושעה מחדש לצינור שכותרתו 4 מ"לולאחר מכן להוסיף חיץ תמוגה RBC לכל צינור ב 1: 9 יחס (900 חיץ μL RSC תמוגה עבור 100 μL מחדש מושעה דם). דגירה של 5 דקות ב RT. צנטריפוגה (5 דקות, 500 xg) ו decant.
    4. לבצע השני RBC תמוגה חיץ הדגירה (5 דקות ב RT). צנטריפוגה ו decant כמו קודם.
    5. לשטוף את התאים הנותרים ~ 1 מ"ל PBS. צנטריפוגה ו decant כמו קודם.
    6. Resuspend גלולה בנפח של PBS מתאים מכתים cytometry הזרימה הסטנדרטי (זה משתנה בהתאם ליצרן פרוטוקולי מעבדה בודדים). 20 השתמש נוגדנים immunophenotyping מאומת עבור זרימת- cyotmetery לזהות תאי עכבר (CD45 העכבר +) ותאי אדם (CD45 + + האנושי) 6 , 21 כמו גם סמנים נוספים ליקוציט אדם ספציפי לשושלת התא עניין.
      הערה: מומלץ לקחת נפח קטן (5 μL -20 μL) מכל מדגם העכבר כדי ליצור "דגימות נקווה"; להשתמש עבור unstained, כדאיות, ו isotype דגימות שליטה. זה הכי טוב בפועל יש unstained ו isotype שולטת עבור כל תנאי הניסוי.

7. הערכה תפקודית של פעילות ציטוקינים Vivo

  1. עכבר המתת חסד ואת הקציר רקמות
    1. להרדים עכברים באמצעות CO 2 asphyxiation בנקודת זמן ניסיוני המיועד.
    2. קציר דם באמצעות לנקב לב ולאסוף פלזמה כמו צעדים 5.2.1-5.2.2.
      הערה: לאסוף את הדם לפני רקמות אחרות כי זה מתחיל קרישה מיד לאחר המוות.
    3. לעבד את הדם העכבר, aliquot פלזמה החנות כמו בשלב 5.2.2.
      1. בשלב מאוחר יותר, להעריך ריכוז ציטוקינים אקסוגניים בפלסמה המתקבל על המתת חסד באמצעות ELISA על פי פרוטוקול של היצרן. להעריך ולהשוות ריכוז ציטוקינים אקסוגניים פלזמה העכבר מן סדרתי in vivoאיסוף דם ודגימות פלסמה המתת חסד (המתואר בסעיף 5.3).
    4. הוסף PBS כדי הנותרים דגימת דם להחליף נפח פלזמה תהליך כמתואר השלבים 6.3.1 ו 6.3.2. בצע מבחני cytometry זרימה מיד תאים resuspend במדיום מקפיא לאחסון LN 2 .
  2. קציר מוח העצם (BM) ו הטחול מן העכברים PDX ולהכין השעיות תא בודד כפי שתואר לעיל. 22
  3. השגת ספירת תאים עבור כל מדגם רקמה העכבר PDX באמצעות חומצה אצטית 3% עם מתילן כחול (lyses תא קרום RBCs עוזב גרעינים שלמים של תאים חיים) ב 1: 1 דילול תאים לספור באמצעות hemocytometer. טבולה סה כ ספירת תאים עבור מוח העצם דגימות הטחול עבור כל בעל חיים.
  4. צנטריפוגה (500 xg, 15 דקות) השעיות תא ו decant supernatant. בצע בדיקות cytometery זרימה של מוח העצם ו / או טחול תאים מיד או resuspend במדיום מקפיא עבור LN <תת> 2 אחסון.
    הערה: להקפיא 10 aliquots BM (עבור מבחני ביוכימיים עתידיים) ו 5 aliquots spleen (עבור השתלות PDX בעתיד) לכל עכבר.
  5. Immunophenotyping לזהות אפקטים תפקודית vivo
    1. הכן אחד לערבב (MM) של נוגדנים cytometry זרימה לאוכלוסייה hematopoietic hemopopoietic אימונופוטיפ להגיב לציטוקין של עניין שנייה MM של נוגדנים לשלוט isotype ( איור 5 ו טבלה של חומרים).
    2. ההפשרה PDX רקמות aliquots (37 ° C חרוז אמבטיה) מוכן בשלב 7.4.
    3. שטפו את התאים מופשר על ידי העברתם צינור חרוטי והוסיף נפח 3x לפחות 3 של PBS. צנטריפוגה (500 xg, 5 דקות) ו decant supernatant.
    4. חזור על שלב הרחצה (7.5.3).
    5. יצירת aliquots מאוגדים על ידי לקיחת ~ 10 μL-20 תאים μL מדגם PDX כל שליטה, שליטה הכדאיות, ואת בקרות isotype (ראה שלב 6.4.6 הערה). הכתם כל דגימות, למעט uשליטה nstained, עם צבע הכדאיות fixable (סמן תאים מתים), דגירה לשטוף לפי פרוטוקול של היצרן.
    6. כתם כל מדגם תא PDX עם פנוטיפינג MM על פי פרוטוקול cytometry הזרימה סטנדרטי; כתם דומה הדגימה איסוטיפ משולב שליטה (ים) עם isotype- MM. לדגור את כל הדגימות, לשטוף עם PBS, ולתקן דגימות מחדש על ידי השעיית paraformaldehyde 1%.
    7. איסוף נתונים cytometry הזרימה ולנתח נתונים באמצעות אסטרטגיה gating המתאים האוכלוסייה התא (ים) של עניין ( איור 5 ). דוגמה טיפוסית היא כדלקמן:
      1. הגדרת תאים שלמים על ידי ציור FSC ו שער SSC כי אינו כולל פסולת.
      2. זיהוי האוכלוסייה החיים תאים על ידי gating על תאים שליליים עבור סמן התא המת (זה "תאים חיים סה"כ").
      3. השתמש תת השערים בתוך "תאים חיים סה"כ" כדי להגדיר את popultions התא עם אימונופוטיפ הרצוי (ראה איור 5).
      4. השג אתתדירות של אוכלוסיות תאים תת בתוך המספר הכולל של תא חי מניתוח cytometry זרימה. 6 , 21
    8. חישוב מספר התאים היעד בכל רקמה על ידי הכפלת התדירות של תת התא B, בתוך תאים חיים סה"כ (שהושגו בשלב 7.5.6.4) על ידי ספירת תאים החיים הכל לכל רקמה שהושגו בשלב 7.3 (תת% B תת משנה x " ספירת תאי המיאוציטומטר ", ראה טבלה 1 )
    9. השווה את ספירת תאים של אוכלוסיות תאים היעד בין שליטה PDX עכברים הבעת ציטוקינים (TSLP +) PDX עכברים כדי לקבוע ב vivo תפקודים אפקטיביים של הציטוקין האנושי אקסוגני ( טבלה 1 ).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

סקירה של המודל מוצג באיור 1 . לאחר ציטוקינים בייצור (TSLP + stroma) ושליטה stroma הושגו הם מורחבים בתרבות. לפני הזרקת stroma לתוך עכברים, supernatant תא סטרומה מוערכת על ידי ELISA כדי לאמת את ייצור ציטוקינים ( איור 2 ) ו cyphometry זרימת phospho (פרוטוקול # 3) משמש כדי לאמת את הפעילות של ציטוקינים המיוצר על ידי stroma. Supernatant נאסף מתרביות תאים stromal confluent (stroma שליטה TSROP + stroma) כאשר תאים passaged....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כתב היד מתאר שיטה פשוטה, מהירה, וחסכונית יחסית עבור הנדסת PDX להביע ציטוקינים אנושיים אקסוגניים. האסטרטגיה המתוארת כאן מבוססת על זריקות intraperitoneal שבועי של קו התא stromal transduced להביע את הציטוקין האנושי, TSLP. לפני ביצוע השיטות המתוארות כאן, stroma מהונדסים להביע רמות גבוהות של ציטוקינים של עניין (TSLP) ו סטרומה שליטה מהונדסים דומה נוצרו. בפרוטוקולים המוצגים כאן, stroma מורחבות התרבות והוקרן על היכולת לספק יציבה, ייצור ציטוקינים ברמה גבוהה לאורך זמן (או על היעדר ייצור ציט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי NIH R21CA162259, NIH R01CA209829, NIH P20 MD006988, NIH 2R25 GM060507, מענק תקווה של יונדאי תקווה על גלגלים, המחלקה לפתולוגיה ואנטומיה אנושית, המחלקה למדעים בסיסיים, והמרכז לפערי בריאות ורפואה מולקולרית בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת לומה לינדה ועל ידי מענק לקידום מחקר שיתופי ותרגומי מאוניברסיטת לומה לינדה (KJP). התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של ה-NIH.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<ריאגנטים חזקים>רטובים במעבדה 
T-75 בקבוק מטופל בתרבית רקמות פלקון, קיבולת 250 מ"ל, 75 ס"מ&2; שטח תרבית וכובע מאווררCorning Inc. / Fisher353136
בקבוק מטופל בתרבית רקמות בז T-150, קיבולת 600 מ"ל, 150 ס"מ&2; אזור תרבות & פקק מאווררCorning Inc. / Fisher355001
10 מ"ל פיפטות סרולוגיותFalcon357551
15 מ"ל  צינורות חרוטיים מפוליפרופילןפישר05-539-12
5 מ"ל צינורות פוליסטירן תחתונים עגוליםפלקון352054
50 מ"ל צינורות חרוטיים מפוליפרופילן352098
2.0 מ"ל בקבוקונים קריוגנייםהברגה חיצוניתCorning Inc. / Fisher4230659
1 מ"ל קצות פיפטהפישר2707509
200 μ, קצות פיפטה L דנוויל סיינטיפיקP3020-CPS
10 μ קצות פיפטה LDenville ScientificP-1096-CP
יחידות סינון חד פעמיות סטריליות עם קרום SFCA, Nalgene Rapid-FlowFisher09-740-28D
2 NH2SO4  BioLegend423001
Dulbecco' s תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) ללא קליציום ומגנזיום, 1& פעמים;קורנינג סלגרו / מדיטק21-031-CV
אנושי TSLP ELISA מקס דלוקס סטBioLegend434204
3% חומצה אצטית עם טכנולוגיות תאי גזע כחולים מתילן7060
טריפן כחול קורנינג25-900-Cl
"טריפסין" 1x 0.25% טריפסין 2.21 מ"מ EDTA ב-HBSSThermoFisher25-053
TWEEN 20 BioXtraSigma-AldrichP-7949<
חזק>" R10" מדיום תרבית תאים, % מהנפח הכולל (יוצר 565 מ"ל)-<חזק>-<חזק>מתכון מעבדה
RPMI, 88.5% (500 מ"ל) מדיטק10-040-CV   
FBS, 9.9% (56 מ"ל) Mediatech35-011-CV
L-גלוטמין, 0.99% (5.6 מ"ל) מדיאטק25-005-Cl
פניצילין-סטרפטומיצין, 0.50% (2.8 מ"ל) Mediatech30-002-Cl
2-Mercaptoethanol, 0.10% (560 & מיקרו; L) חבר פרלמנט190242
<חזק>" R20" מדיום תרבית תאים, % מהנפח הכולל (עושה 195 מ"ל)--<חזק>מתכון מעבדה
        RPMI, 76.84% (150  מ"ל)ראה לעילראה לעיל
        FBS, 20.49% (40 מ"ל)ראה לעילראה לעיל
        2 מ"מ L-גלוטמין, 1.02% (2 מ"ל)ראה לעילראה לעיל
        1 מ"מ Na pyruvate, 1.02% (2 מ"ל)ראה לעילראה לעיל
        פניצילין-סטרפטומיצין,  0.51% (1 מ"ל)ראה לעילראה לעיל
        2-מרקפטואתנול, 0.10% (0.1 מ'),  0.10% (200 ומיקרו; L)ראה לעילראה לעיל
<חזק>" מדיום הקפאה", % מהנפח הכולל-<חזק>-<חזק>מתכון מעבדה
>" R10" בינוני, 45%ראה מתכון "R10"-
FBS, 20%ראה לעיל35-011-CV
DMSO, 10%קורנינג25-950-CQC
D(-)(+)-טרהלוז דיהידרט, 5%פישר סיינטיפיקBP2687-100
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטולוג תגובות
Biologics  < / חזק >
"HS-27" HS-27A קו סטרומה אנושיATCCCRL-2496
"CALL-4" MHH-CALL-4 קו תאים, לוקמיה מבשר תאי B אנושייםDSMZACC 337
" עכברי NSG" הנהון. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, זכר או נקבה, גיל 6 – 8 שבועותעכברי JAX # 005557
קו תאי MUTZ-5, לוקמיה קודמת של תאי B אנושייםDSMZACC 490
רקומביננטי חלבון TSLP אנושיR& D Systems1398-TS-010
NameCompany>>Quet Number
>Flow cytomery נוגדנים (שיבוט)*
נגד עכבר CD45 FITC (30F11)Miltenyi Biotec130-102-778
CD127 PE (MB15-18C9) (השם החלופי הוא IL-7Rα)Miltenyi Biotec130-098-094
CD34 APC (8G12)BD Biosciences340667
CD45 PE-Cy7  (HI30)eBioscience25-0459
"FVD" צבע כדאיות ניתן לתיקון  eFluor 780 eBioscience65-0865
Ig κ שרשרת קלה FITC  (G20-193)BD Pharmingen555791
Ig λ שרשרת קלה FITC (JDC-12)BD Pharmingen561379
IgD PE (IA6-2)BioLegend348203
IgM PE-Cy5 (G20-127)BD Biosciences551079
pSTAT5 PE,  עכבר אנטי-STAT5 (pY694)BD PhosphoFlow612567
<חזק>שם <חזק>חברה<חזק>קטולוג מספר<חזק>תגובות
><חזק>חומרים וציוד אחרים  משדר ננו מושתל
בעלי חיים עם צינוריתטרובן ID-100B(1.25)
קרם הרדמה לידוקאין EMLA (הושג על ידי פרשיפציה דרך מתקן לטיפול בבעלי חיים)מרשם
BD ½ סמ"ק LO-DOSE U-100 מזרק אינסולין 28G½  צינורות BD#329461
BD Microtainer עם K2EDTABD #365974
צנטריפוגהבקמן קולטראלגרה X-15R 
צינורות נימיים של FisherBrand (Heparinized)Fisher Scientific22-260-950
HemocytometerFisher02-671-6
MACSQuant Analyzer 10Miltenyi Biotec130-096-343
כלוב פאי עכברBraintree Scientific, Inc.MPC-1
Mouse Tail Illuminator RestrainerBraintree Scientific, Inc.MTI STD
אחיזת אקדח משתילTrovan IM-300 (1.25)
ומיקרו; כמות ביו-טק אינסטרומנטס בע"מMQX200
FlowJo תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימהFlowJo, LLCגרסה 10
*כל הנוגדנים הם אנטי אנושיים אלא אם כן צוין אחרת.
T-25 תרבית תאים Nunc מטופלת EasYFlasks, קיבולת 7 מ"ל,   25 ס"מ&2; שטח תרבית Thermo Scientific / Fisher 156367 פלקון

מקורות

  1. Francis, O. L., Milford, T. A., Beldiman, C., Payne, K. J. Fine-tuning patient-derived xenograft models for precision medicine approaches in leukemia. J Investig Med. 64 (3), 740-744 (2016).
  2. Parrish, Y. K., et al. IL-7 Dependence in human B lymphopoiesis increases during progression of ontogeny from cord blood to bone marrow. J Immunol. 182 (7), 4255-4266 (2009).
  3. Johnson, S. E., Shah, N., Panoskaltsis-Mortari, A., LeBien, T. W. Murine and human IL-7 activate STAT5 and induce proliferation of normal human pro-B cells. J Immunol. 175 (11), 7325-7331 (2005).
  4. Milford, T. A., et al. TSLP or IL-7 provide an IL-7Ralpha signal that is critical for human B lymphopoiesis. Eur J Immunol. 46 (9), 2155-2161 (2016).
  5. Reche, P. A., et al. Human thymic stromal lymphopoietin preferentially stimulates myeloid cells. J Immunol. 167 (1), 336-343 (2001).
  6. Francis, O. L., et al. A novel xenograft model to study the role of TSLP-induced CRLF2 signals in normal and malignant human B lymphopoiesis. Haematologica. 101 (4), 417-426 (2016).
  7. Willinger, T., Rongvaux, A., Strowig, T., Manz, M. G., Flavell, R. A. Improving human hemato-lymphoid-system mice by cytokine knock-in gene replacement. Trends Immunol. 32 (7), 321-327 (2011).
  8. Graf, L., Iwata, M., Torok-Storb, B. Gene expression profiling of the functionally distinct human bone marrow stromal cell lines HS-5 and HS-27a. Blood. 100 (4), 1509-1511 (2002).
  9. Follenzi, A., Ailles, L. E., Bakovic, S., Geuna, M., Naldini, L. Gene transfer by lentiviral vectors is limited by nuclear translocation and rescued by HIV-1 pol sequences. Nat Genet. 25 (2), 217-222 (2000).
  10. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031(2012).
  11. Cockrell, A. S., Kafri, T. Gene delivery by lentivirus vectors. Mol Biotechnol. 36 (3), 184-204 (2007).
  12. Ricardo, R., Phelan, K. Freezing, thawing, and packaging cells for transport. J Vis Exp. (17), (2008).
  13. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The ELISA Method. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5061 (2016).
  14. Tasian, S. K., et al. Aberrant STAT5 and PI3K/mTOR pathway signaling occurs in human CRLF2-rearranged B-precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 120 (4), 833-842 (2012).
  15. Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), (2008).
  16. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5048 (2016).
  17. JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Introducing Experimental Agents into the Mouse. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5161 (2016).
  18. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
  19. Kovacsics, D., Raper, J. Transient expression of proteins by hydrodynamic gene delivery in mice. J Vis Exp. (87), (2014).
  20. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
  21. Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Chapter 15, Creation of "humanized" mice to study human immunity. Curr Protoc Immunol. , (2008).
  22. Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. J Vis Exp. (17), (2008).
  23. Scheeren, F. A., et al. Thymic stromal lymphopoietin induces early human B-cell proliferation and differentiation. Eur J Immunol. 40 (4), 955-965 (2010).
  24. Lee, E. B., et al. Increased serum thymic stromal lymphopoietin in children with atopic dermatitis. Pediatr Allergy Immunol. 21 (2 Pt 2), e457-e460 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ביטוי ציטוקיניםהזרקת תאי סטרומהטרנסדוקציית TSLPהזרקה פריטוניאליתציטומטריה זרימתיתאנליזת ELISAהשתלת תאי הלואיזסרמות ציטוקינים בפלזמהתרבית תאי סטרומה
ביטוי של ציטוקינים אקסוגניים ב- Xenografts שמקורם בחולה באמצעות הזרקה באמצעות קו תאים סטרומל ציטוקינים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.