כימות מוחלט של Aβ 1-42 ב CSF באמצעות הליך מדידת הפניה ההמוני spectrometric

Summary

מתואר הליך מדידת ייחוס לכימות מוחלט של Aβ_1-42 ב-CSF אנושי המבוסס על מיצוי פאזה מוצקה וספקטרומטריית מסה טנדם של כרומטוגרפיה נוזלית.

Abstract

מחלת אלצהיימר (AD) היא המחלה הנוירודגנרטיבית השכיחה ביותר בקרב קשישים ומהווה 60-80% מכלל מקרי הדמנציה. נכון לעכשיו, האבחנה של אלצהיימר מבוססת על מבחנים קוגניטיביים ובדיקות מצב נפשי, אך הפפטיד עמילואיד-בטא (Aβ) בנוזל המוח השדרתי (CSF) נמצא בשימוש יותר ויותר בניסויים קליניים ובמסגרות. באשר לרוב הסמנים הביולוגיים של חלבונים ופפטידים, הכימות מתבצע באמצעות טכניקות מבוססות נוגדנים, כגון בדיקת אימונוסורבנט מקושר לאנזים (ELISA). עם זאת, שונות תוך-מעבדתית ובין-מעבדתית במבחנים אלה פוגעת בשימוש בו כסמן אבחנתי בשגרה הקלינית.

נוהל מדידת ייחוס בלתי תלוי בנוגדנים (RMP) פותח על בסיס מיצוי פאזה מוצקה (SPE) וכרומטוגרפיה נוזלית (LC)-ספקטרומטריית מסה טנדם (MS/MS), כאשר פפטידי Aβ יציבים ומסומנים באיזוטופים שימשו כתקנים פנימיים, המאפשרים כימות מוחלט. מכשיר היברידי מרובע ברזולוציה גבוהה שימש למדידות. השיטה מאפשרת כימות של CSF Aβ_1-42 בין 150-4,000 pg/mL.

Introduction

מחלת אלצהיימר (AD) היא הצורה הנפוצה ביותר של דמנציה משפיעה על 35 מיליון בני אדם ברחבי העולם ^1. סימני ההיכר נוירו של מחל אמין נרחב לשקר בליבה של בפתוגנזה לספירה הם סבכי neurofibrillary תאיים של טאו hyperphosphorylated חלבון ² ושלטי תאיים מורכבים בטא עמילואיד מצטבר (Aβ) פפטידים ^3. בקנה אחד עם זה, ההערכה של פתולוגיה פלאק in vivo על ידי סמנים ביולוגיים נכללה לאחרונה הקריטריונים לאבחון מחקר למחלת אלצהיימר ^4. עבור מדידות CSF של Aβ _1-42, כמה immunoassays זמין ומשמשים במעבדות קליניות רבות ^5. ריכוז Aβ _1-42 ב CSF הוא כ 50% נמוך יותר בחולי אלצהיימר מאשר אצל הקשישים קוגניטיבית נורמלים, המשקף את בתצהיר של פפטיד הפלאק br^{6 עין, 7.}

סמנים אלה מנותחים בעיקר באמצעות immunoassays (כלומר, טכניקות מבוססות נוגדנים), אבל אלה מבחנים עשויים להיות מושפעים השפעות מטריקס ^8. שימוש immunoassays על פלטפורמות טכנולוגיות שונות ואת חוסר סטנדרטיזציה assay ^{9, 10} הופך את כניסתה של ריכוזי העולמי חתוך ^{11 קשה, 12.} RMP תוקפת אנליטית תתיר הכיול האחיד של פלטפורמות assay שונות, באופן אידיאלי וכתוצאה מכך השוואתית טובים יותר על פני פלטפורמות אנליטיים שליטה טובה יותר של הגורמים תורמי השתנות המדידה הכוללת.

כימות המוחלטת של Aβ _1-42 באמצעות השיטה שפותחה LC-MS / MS מתגברת רבה של בעיות הקשורות techn נוגדן מבוססiques. השיטה, מופיעה בתור RMP ע"י הוועדה המשותפת עבור עקיבות ברפואת מעבדה (C11RMP9 מספר זיהוי מסד JCTLM), תשמש כדי לקבוע את הריכוז המוחלט של Aβ _1-42 ב בחומרי ייחוס (CRM) ליצור הרמונית CSF Aβ ₁ מדידות _-42 פני טכניקות ופלטפורמות אנליטי. זרימת העבודה המתוארת צריכה להיות רלוונטית לפיתוח שיטות התייחסות מועמד פפטידים וחלבונים בתוך האזורים השונים של רפואה.

Protocol

הערה: פרוטוקול זה דורש aliquots של לפחות 50 μL, עם ריכוז של 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​עבור כל הפפטיד Aβ, כמו חומר המוצא. פפטידים Aβ צריך להיות מומס אצטוניטריל 20% (ACN) ו -4% פתרון אמוניה מרוכזים מים ללא יונים (v / v) המאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס.

זהירות: ראה טבלה 1 עבור מידע בטיחות.

1. הכנה של פתרונות

1. הכן 100 מ"ל של 20% ACN ו -4% פתרון אמוניה מרוכזים מים ללא יונים (v / v) על ידי דילול 20 מ"ל של ACN ו -4 מ"ל של אמוניה מרוכזת (~ 25%) במים deionized. התאם את נפח סופי 100 מ"ל עם מים ללא יונים. הפוך טרי מדי יום.
2. הכן 50 מ"ל של 5 M-hydrochloride guanidine ידי המסת 26.08 גרם של hydrochloride guanidine במים deionized לנפח סופי של 50 מ"ל. חנות ב 20 ° C ולעשות חודשים טריים.
3. הכן 200 מ"ל של חומצה זרחתית 4% במים deionized (נ /v) על ידי דילול 9.4 מ"ל של חומצה זרחתית מרוכזת (~ 85%) במים deionized. התאם את נפח סופי 200 מ"ל עם מים ללא יונים. לאחסן במקרר ולעשות שבועי טרי.
4. הכן 50 מ"ל של 75% ACN ו -10% פתרון אמוניה מרוכזת (V / V) במים deionized ידי דילול 37.5 מ"ל של ACN ו -5 מ"ל של אמוניה מרוכזת (~ 25%) במים deionized. התאם את נפח סופי 50 מ"ל עם מים ללא יונים. הפוך טרי מדי יום.
5. להפשיר לפחות 2.5 מ"ל של CSF אדם עבור כיילי, המתקבל דגימות שאריות-מזוהה דה מניתוח קליני שגרתי.
6. הכן CSF מלאכותי המכיל 150 מ"מ Na, 3.0 מ"מ K, 1.4 מ"מ Ca, 0.8 מ"מ Mg, 1.0 מ"מ P, ו -155 מ"מ Cl במים deionized ולהוסיף אלבומין בסרום שור לריכוז סופי של 4 מ"ג / מ"ל. רק 1 המ"ל נדרש לכל ניתוח, אבל להכין כמות גדולה, aliquot אותו, ולאחסן לשימוש עתידי.

2. הכנת כיילים

1. הכן 0.5 מ"ל של 4 מיקרוגרם / מ"ל ¹5 NAβ _1-42 פפטיד על ידי הוספת 40 μL של 50 מיקרוגרם / מ"ל ¹⁵ NAβ ₁₄₂ כדי 0.46 מ"ל של 20 ACN% ו -4% אמוניה מרוכזת בתוך שפופרת 0.5 מ"ל microcentrifuge. מערבבים על מערבל מערבולת דקות 1.
2. הכן 2 מ"ל של 100 ng / mL ¹⁵ NAβ _1-42 פפטיד על ידי הוספת 50 μL של 4 מיקרוגרם / מ"ל ¹⁵ NAβ ₁₄₂ כדי 1.95 מ"ל של ACN 20% ואמוניה מרוכזת 4% בצינור microcentrifuge 2 מ"ל. מערבבים על מערבל מערבולת דקות 1.
3. הכן שישה פתרונות כיל (AF) על ידי ערבוב הכרכים של כל פתרון המצוין בטבלה 2. השתמש 0.5, 1.5, ו -2 צינורות מ"ל microcentrifuge. מערבבים על מערבל מערבולת דקות 1.
4. הכן את כיילי הסופי (בשני עותקים) ב 0.5 מ"ל צינורות microcentrifuge ידי הוספת הפתרונות כיול המקביל ו CSF האדם לפי טבלה 3. מערבבים על מערבל מערבולת דקות 1.

3. הכנת ההתקן הפנימי

1. הכן 2 מ"ל של 0.8 מיקרוגרם / מ"ל ¹³ CAβ _1-42 פפטיד על ידי הוספת 32 μL של 50 מיקרוגרם / מ"ל ¹³ CAβ ₁₄₂ כדי 1,968 מ"ל של ACN 20% ו -4% אמוניה מרוכזת בתוך שפופרת 2-מ"ל microcentrifuge. מערבבים על מערבל מערבולת דקות 1.
2. הכן 5 מ"ל של 16 ng / mL ¹³ CAβ _1-42 פפטיד על ידי הוספת 0.1 מ"ל של 0.8 מיקרוגרם / מ"ל ל -4.9 מ"ל של 20 ACN% ואמוניה מרוכזת 4% בתוך שפופרת 5 מ"ל microcentrifuge. מערבבים על מערבל מערבולת דקות 1.

4. הכנת מדגם פקטור התגובה

הערה: גורם התגובה (RF) נחישות מתבצעת על מנת לקבוע את הריכוז של פפטיד שכותרתו המשמש לכיול ⁽¹⁵ NAβ _1-42). זה דורש ריכוז הפפטיד Aβ _1-42 יליד נקבע באמצעות ניתוח של חומצות אמיניות (AAA). לפיכך, היקף וריכוז aliquots פפטיד יליד Aβ _1-42צריך למלא את הדרישות של AAA.

1. הכן 0.5 מ"ל של 4 מיקרוגרם / מ"ל הילידים (ללא תווית) ^Aβ _1-42 על ידי הוספת 40 μL של 50 מיקרוגרם / מ"ל יליד Aβ _1-42 כדי 0.46 מ"ל של 20 ACN% ו -4% אמוניה מרוכזת בתוך שפופרת 0.5 מ"ל microcentrifuge. מערבבים על מערבל מערבולת דקות 1.
2. להכין תערובת של 2 מ"ל 40 ng / mL של יליד ¹⁵ NAβ _1-42 על ידי הוספת 20 μL של 4 מיקרוגרם / מ"ל יליד Aβ _1-42 ו -20 μL של 4μg / מ"ל ¹⁵ NAβ _1-42 1.96 מ"ל של 20% ACN ו -4% מרוכזים אמוניה בצינור microcentrifuge 2 מ"ל. מערבבים על מערבל מערבולת דקות 1.
3. הוסף 20 μL של תמהיל 40 ng / mL 0.38 מ"ל של CSF מלאכותי צינור 0.5 מ"ל microcentrifuge. הכן כפילויות ומערבבים על מערבל מערבולת דקות 1.

לדוגמא כנה 5.

הערה: להפשיר את דגימות כדי להימדד בטמפרטורת החדר על רולר.

1. להוסיף 0.18 מ"ל של כל כיל, גורם תגובה, מדגם לא ידוע (כולל בקרת איכות [QC] דגימות, אם משתמשים בו) לחלבון מ"ל 1 צלחת 96-עמוק היטב, על פי איור 1 (בהנחה צלחת מלאה משמש). הקפד להוסיף את הדגימות, או קרוב, חלק התחתון של הבארות.
2. הוסף 20 μL של תקן פנימי זה טוב (כלומר, כיילי, גורם בתגובה QCs, ואת נעלמים); חשוב לשחרר את הירידה בצד של באר קרובה לפני השטח של המדגם בלי לצלול קצה פיפטה.
3. להוסיף 0.2 מ"ל של 5 M guanidine-hydrochloride היטב כל אחד.
4. מניחים את הצלחת המדגם על שייקר microplate ומערבבים את הדגימות למשך 45 דקות ב -1,100 סל"ד. התדירות האופטימלית עשויה להשתנות בהתאם מכשור. הגדר את תדירות אמפליטודה של המערבל כך הפתרונים מעורבבים היטב ושום טיפות של תקן פנימי או CSF נותרות צרופות בצד של הבארות.
5. להוסיף 0.2 מ"ל של חומצה זרחתית 4%זה טוב. וורטקס לערבב בקצרה.

6. מיצוי שלב מוצק

הערה: בכל כביסה, טעינה, וצעדים elution, להחיל את הוואקום הנמוך ביותר האפשרי לאחר הוספת הפתרון ובהדרגה להגדיל לפי הצורך כדי לטעון או elute הפתרון. השבת את הוואקום בין כל טעינת צעד elution.

1. שים מגש מאגר לפסולת תחת מצב מעורב, קטיון חליפין, 96-גם מיצוי שלב מוצק (SPE) צלחת בתא סעפת צלחת חילוץ.
2. להתנות את הסופג SPE על ידי הוספת 0.2 מ"ל של מתנול היטב כל אחד.
3. לאזן את הסופג על ידי הוספת 0.2 מ"ל של חומצה זרחתית 4% זה טוב.
4. להעביר את כל הדגימות (כ 0.62 מיליליטר בכל טוב) מהצלחת העמוקה היטב לצלחת SPE. השתמש פיפטה שמונה ערוצים בעת העברת הדגימות מהצלחת העמוקה היטב לצלחת SPE; זה לא חיוני כדי להעביר את הכרכים השלמים או שווים של כל הדגימות, מאז הדגימות מכילות כמתמחהאל תקן שיפצה עבור וריאציות.
5. שטוף את הסופג לאחר הדגימות עברו על ידי הוספת 0.2 מיליליטר של חומצה זרחתית 4% זה טוב.
6. לאחר ממס הכביסה eluted מן sorbent, להחליף את מגש המאגר עם צלחת אוסף או צינורות.
7. Elute המדגם מן sorbent ידי פעמיים הוספת 50 μL של 75% ACN / 10% אמוניה מרוכזת, ושים לב כי פתרון זה דורש ואקום נמוך מאוד לעבור דרך הסופג. זכור להשבית את החלל בין כל הוספה.
   1. אופציונלי: חותם את הצלחת אוסף או צינורות ולהקפיא אותם ב -80 ° C. הסר את החותם מצלחת האוסף או הצינורות לפני שתמשיך לשלב 6.8.2.
   2. יבש את eluates באמצעות צנטריפוגה ואקום (ללא הפעלת חום); זה יכול להימשך בין שנה עד מספר שעות, תלוי צנטריפוגות ואקום.
   3. חותם את המכל ולהקפיא אותם ב -80 ° C.

7. נוזלי Chromatography

1. הכן שלב נייד A (ACN 5% ו -0.3% אמוניה מרוכזת מים ללא יונים [v / v]), B (4% מים ללא יונים ואמוניה מרוכזת ב -0.1% ACN [v / v]), וכן לשטוף מחט (50% ACN ו -4% מרוכזים אמוניה במים deionized [v / v]).
   1. עבור 500 מיליליטר של שלב נייד, להוסיף 25 מיליליטר של ACN ו -1.5 מיליליטר של אמוניה מרוכזת מים ללא יונים. התאם את נפח סופי 500 מ"ל עם מים ללא יונים.
   2. עבור 500 מיליליטר של B שלב הנייד, להוסיף 500 μL של אמוניה מרוכזת 25 מיליליטר של מים ללא יונים כדי ACN. התאם את נפח סופי 500 מ"ל עם ACN.
   3. כן 250 מיליליטר של מחט לשטוף ידי הוספת 120 מיליליטר של ACN ו -10 מיליליטר של אמוניה מרוכזת מים ללא יונים. התאם את נפח סופי 250 מ"ל עם מים ללא יונים.
   4. שים א השלבים הנייד ובקבוקי B ו- מחט לשטוף הפתוח באמבט sonication במשך 20 דקות לפני חיבורו למערכת LC
2. ממיסים כל דגימה עם 25 μL של 20% ACN ו -4% Concentraפתרון אמוניה טד ומניחים אותם על שייקר במשך 20 דקות. צנטריפוגה את הדגימות ולמקם אותם autosampler (לשמור ב -7 מעלות צלזיוס).
3. להזריק 20 μL של המדגם על 1 x 250 מ"מ ^{2-divinylbenzene} קלקר טור מונוליטי (התהפכה פאזי) שמרו על 50 מעלות צלזיוס.
   1. השתמש שיפוע LC שניתן לראות בטבלה 4 עם קצב זרימה של 0.3 mL / min. להסיט את שני הראשונים וחמש הדקות האחרונות לבזבז (פוסט-טור) באמצעות שסתום הפניית להפחית את הזיהום של ספקטרומטר המסה.

8. ניתוח ספקטרומטריה

הערה: פרמטרים אלה שימשו ספקטרומטר מסה היברידית quadrupole-orbitrap מצויד מקור יינון electrospray aheated.

1. הגדר את הפרמטרים עבור מקור יון לפי טבלה 5.
2. כווננו את המכשיר MS לבודד 4+ המדינות אחראי יליד Aβ _1-42 (1,129.48 ההמוניתכדי תשלום [m / z] יחס), ¹⁵ NAβ _1-42 (1,143.00 מ '/ z), ו ^-13 CAβ _1-42 (1,179.50 m / z) ב מסת Analyzer quadrupole עם רוחב הבידוד של 2.5 מ' / z.
3. שבר פפטידים המבודד בתא ההתנגשות עם אנרגית התנגשות מנורמלת (NCE) של 17.0. זה אולי צריך להיות מכוון עבור כל מכשיר, אפילו מאותו הסוג (ובמיוחד אם להשתמש בסוגים אחרים של מכשירים, כגון quadrupole משולשת MS).
4. רשום את הספקטרום שהבר עם רזולוציה של 17.500, עם מטרת שליטה אוטומטית של 2 x 10 ⁵ אישומים זמן הזרקת מקסימלית של 250 מילישניות.

9. עיבוד נתונים

1. השתמש הסכום של יוני המוצר (עם סובלנות המונית של יחידות מסת מילי ± 250 [MMU]) בלוח 6 לחשב אזורי chromatographic עבור כל הפפטיד. ראוי לציין, כי סוגים ומספרי יון מוצגים רק עבור Aβ הילידים _{1-42 יוני מוצר, שכן הם זהים עבור שני ¹⁵ NAβ 1-42 ו ^-13 CAβ 1-42.}
2. לקבוע את גורם התגובה הממוצע של דגימות גורם שני תגובה על ידי חלוקת השטח מתחת לעקומה (שיא chromatographic) של ¹⁵ NAβ _1-42 עם השטח מתחת לעקומה של Aβ _1-42 ילידים.
3. התאם את הריכוז של ¹⁵ NAβ _1-42 המשמש כיול ידי הכפלתו עם הגורם בתגובה מחושב בשלב 9.2.
4. לבנות עקומת כיול על ידי התוויית יחסי שטח של ¹⁵ NAβ _1-42 ל ^-13 CAβ _1-42 משני סטים של כיילי נגד ריכוז.
5. חשב את המדרון ליירט של עקומת הכיול באמצעות רגרסיה ליניארית.
6. חשב את יחס שטח של המקומיים Aβ _1-42 התקן פנימי ⁽¹³ CAβ _1-42) עבור האו"םדגימות ידועות.
7. לחיץ הריכוז של דגימות ידועות מעקום הכיול באמצעות המדרון ליירט שהושג בשלב 9.5.

Results

התקנת הצלחת באיור 1 משמשת צלחת מלאה של דגימות. אם דגימות ידועות פחות הם להיות מנותחים, את כיל השני, RF, ו- QC סטים צריכים להיות ממוקם שרק שופט לסיום המחצית הראשונה של הדגימות הידועות.

כפי שניתן לראות באיור 2, כייל קרובים הקו הרגרסיה, עם סטיות תקן נמוכות. שיטה זו יש רמה נמוכה יותר של כימות של 150 pg / mL ו ברמה העלי...

Discussion

לקבלת השיטה המתוארת, במקום להשתמש מטריצה פונדקאית, השתמשנו בגישה אנליטי הפונדקאית ^{13, 14, 15, 16,} אשר מאפשרת כיול CSF אדם. הגישה אנליטי הפונדקאית כרוכה שני סטנדרטים שונים isotopically שכותרתו. אחת ⁽¹⁵ NAβ ₁₄₂₎ משמש כדי ליצור את עקומת הכיול ב CSF אדם, ואילו אחר ⁽¹³ CAβ ₁₄₂₎ משמש כסטנדרט הפנימי. ריכוזי אנדוגני Aβ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
צינורות מיקרוצנטריפוגה חלבון Eppendorf LoBind, צינורות מיקרוצנטריפוגה	Eppendorf	022431081
Eppendorf LoBind, צינורות מיקרוצנטריפוגה של חלבון	Eppendorf	022431081
Eppendorf LoBind, 2 מ"ל		Eppendorf
Eppendorf LoBind, 5 מ"ל	Eppendorf	0030 108.310
חלבון אפנדורף LoBind Deepwell Plates 96		Eppendorf
Micronic 0.75 מ"ל,	MPW32071BC3 מיקרוניים		המשמשים לאיסוף SPE משפרים, אך ניתן להשתמש במכשירי איסוף אחרים כגון צלחות 96 בארות.
Micronic Split TPE Capcluster עבור 96 ind. צינורות	מיקרוניים	MP53026	כובעים לצינורות מיקרוניים.
Micronic Loborack-96 לבן עם כיסוי גבוה מקודד	מחזיק MPW51015BC3 מיקרוני		לצינורות מיקרוניים.
טיפים של Biohit Optifit 1.2 מ"ל	Sartorius	791210	משמש כדי להגיע עד לתחתית לוחות הבאר העמוקים של LoBind (96 בארות). טיפים צרים אחרים עשויים לעבוד גם כן.
ווטרס אואזיס MCX 96-באר ומיקרו; מי צלחת אלוטיון		186001830BA
מגש מאגר סעפת צלחת מים		WAT058942
סעפת צלחת מיצוי מים לנווה מדבר 96 בארות צלחות	מים	186001831
תמיסת אמוניום הידרוקסיד, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~ 25% בסיס NH3	Sigma-Aldrich	30501-1L-D
אצטוניטריל, דרגת שיפוע UV HPLC רחוקה, 2.5 ליטר	פישר סיינטיפיק	A/0627/17X
חומצה אורתו-זרחתית 85%, ACS, ISO, Reag. Ph Eur	Merck Millipore	1005731000
גואנידין הידרוכלוריד, 500 גרם	Thermo Scientific	24110
Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap ספקטרומטר מסה	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFALGMAZR	עם Dionex Ultimate 3000 LC ודגימה אוטומטית.
Dionex ProSwift RP-4H עמודת מונוליט (1.0 x 250 מ"מ)	Dionex	066640
אלבומין סרום בקר, אבקה ליופילית, מתאימה (לביולוגיה מולקולרית),	סיגמא-אולדריץ'	B6917
(1-42), טהור במיוחד, TFA	rPeptide	A-1002-2
15N בטא-עמילואיד (1-42), תווית אחידה	rPeptide	A-1102-2
13C בטא-עמילואיד (1-42),	rPeptide	A-1106-2
, TiMix 2	Edmund Bü HLER	6110 000