מאמר שיטה

הכנה של רקמת מוח הפרימאטים לא-אנושית עבור טרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה ו מיקרוסקופי אלקטרונים

DOI:

10.3791/55397

⸱

3 באפריל 2017

 , 
1Centre de recherche de l'Institut universitaire en santé mentale de Québec, Department of Psychiatry and Neuroscience, Université Laval, 2Centre de recherche du CHU Sainte-Justine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מספקים קלה, בעלות נמוכה, וזמן חסכוני פרוטוקול לתקן כימי רקמת מוח הפרימטים עם מקבע אקרולאין, המאפשר שימור לטווח ארוך התואמת טרום הטבעה אימונוהיסטוכימיה עבור במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות כל ההתקדמות הטכנולוגית ברמה המיקרוסקופית האור, מיקרוסקופ אלקטרונים נשאר הכלי היחיד במדעי המוח לבחון ולאפיין פרטי ultrastructural ו מורפולוגי של נוירונים, כגון קשרים סינפטיים. שימור טוב של רקמת המוח עבור במיקרוסקופ אלקטרונים ניתן להשיג על ידי שיטות קריו-קיבוע קפדני, אך הטכניקות הללו הם די יקרים ולהגביל את השימוש immunolabeling, שהוא חיוני כדי להבין את הקישוריות של מערכות עצביות מזוהה. שיטות Freeze-החלפה פותחו כדי לאפשר שילוב של קיבעון קריו עם immunolabeling. עם זאת, השחזור של גישות מתודולוגיות אלה בדרך כלל מסתמך על מכשירי קירור יקרים. יתר על כן, השיג תוצאות אמינות עם טכניקה זו הוא גוזל זמן מאוד ומיומן-מאתגר. לפיכך, המוח הקבוע המסורתי כימי, במיוחד עם מקבע אקרולאין, נשאר זמן-יעיל שיטה זולה לשלב אלקטרוניםמיקרוסקופ עם אימונוהיסטוכימיה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול ניסוי אמין באמצעות קיבוע acrolein כימי שמוביל לשימור רקמות מוח הפרימטים והוא תואם מראש הטבעת בדיקה מיקרוסקופית אלקטרונים אימונוהיסטוכימיה והעביר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במיקרוסקופ אור, כולל confocal מיקרוסקופיה שני פוטונים, הוכיחה להיות כלי יעיל לחקר בתהליכים עצביים vivo, בין היתר 1, 2. למרות הרזולוציה המרחבית הטיפוסית ברמת האור המיקרוסקופית (LM) היא כ 200 ננומטר, התקדמות טכנולוגית אחרונה באמצעות מקורות אור שונים, כגון אולטרה סגול קיצוני וכן במיקרוסקופ רנטגן הרכה, גדל בעיקר החלטה זו החלטה מרחבית 10 ננומטר כמעט 3 , 4, 5. התקדמות טכנולוגית אחרת הדמיה כוללת בשילוב הדמיה בתהודה מגנטית עם היסטולוגיה ולספק שיטה חדשה למדידת העובי של מעטפת המיאלין in vivo, פרמטר זה היה למדידה באופן מסורתי רק על מיקרוסקופית אלקטרונים (EM) הרמה 6, 7. AlthouGH התקדמויות אלה ברמת LM לספק כלי מצוין ללימוד תהליכי חיים, נוף ואפיון מפורט של מבנים, כגון קשרים סינפטיים, יכול להיות מושגת רק עם EM, המציע רזולוציה שיכול להגיע 0.5 ננומטר. עם זאת, תצפית ברמת EM מחייבת דגימות להיות מת ושינה במובנים מסוימים, עם fixatives כימי ותהליכי התייבשות, על מנת לשמר את cytoarchitecture. לפיכך, בחינת דגימות ביולוגיות ברזולוציה גבוהה יכול להיות מאתגרת בשל נזקי קרינה מקרן האלקטרונים, ניגודיות נמוכה, סטיות מבניות של ממברנות, או אפילו נוכחות של חפצים שיכולים להתרחש התייבשות אפוקסי הבאים הטבעה 8, 9, 10.

שימור דגימות בצורתם המקורית לניתוח מבני יכול להיות מושגת על ידי שימוש "Cryo EM סעיפים מזוגגים" או CEMOVIS, גישת חתך כיכרוך מקפיא והטבעה המדגם במהירות קרח זגוגי בחינת הסעיפים תחת EM בטמפרטורה קריוגני 11, 12. הליך זה מאפשר בחינת דגימות בזמן שהם עדיין מוצקים hydrated מלא, ובכך לחסל חפצים הנגרמים על ידי התייבשות מעבד 13. עם זאת, שיטה זו כרוכה מכשירים נוספים קריו-ultramicrotomy, כמו גם מכשירים נוספים על EM הרגיל, על מנת לאפשר תצפית זו בטמפרטורות מאוד נמוכות, אשר יוצרות עלויות משמעותיות נוספות. בנוסף, הגישה CEMOVIS מונע את השימוש של immunolabeling טכניקות, מאז נוגדנים בדרך כלל צריך להיות וטופחו על RT. לחלופין, אפשר לשלב ניתוח ultrastructural עם נהלים אימונוהיסטוכימיים ידי שימוש בגישה הקפאת-החלפה, שבמהלכה דגימות קבוע קריו הם הפשירו לאט תוך immerged ב כימיקלים קריו-מגן והם הen מוטבע שרפים מיוחדים, כגון Lowicryls. פוסט-הטבעת immunolabeling יכול להתבצע אז על חומר כזה 12. עם זאת, הקפאה-החלפה וטכניקות קריו-קיבוע הן זמן רב. הם דורשים התקנה של ציוד נוסף ועדיין דורשים דגימות להיחשף ממס אורגני ו מקבעים כימי שיכול לשנות את cytoarchitecture, למרות השימוש בטמפרטורה נמוכה 14, 15. לפיכך, למרות כל ההתקדמות הטכנולוגית הן בבית LM ורמת EM, קיבוע כימי של רקמת המוח, במיוחד עם acrolein, נשאר שיטה בעלות נמוכה זמן יעיל לשלב אימונוהיסטוכימיה עם EM 16.

בעשורים האחרונים, נעשו ניסיונות רבים למצוא תערובת של אלדהידים המספקים לשימור רקמות הטוב. לפני 1960, מקבע כימי רק כי נתן תוצאות מקובל EM היה tetroxide אוסמיום. עם זאת, tetroxide אוסמיום הוא רעיל ביותר ויקר, מניעת השימוש בו דרך מערכת כלי דם כדי לתקן איברים כמו המוח. Acrolein הוצג בשנת 1950 מאוחר כשיטה אמינה לשימור רקמות בעלי החיים מתאים תצפית EM של מבנים הסלולר 17. זה חודר לרקמה עמוקה יותר ומגיב מהר יותר מאשר אלדהידים אחרים כאשר נעשה שימוש עבור קיבוע על ידי טבילה ומאפשר שימור טוב של רכיבים ציטופלסמית, עם הצטמקות מינימאלית של הרקמה 17. תכונה כזו נותנת קיבוע acrolein יתרון ברור על פני אלדהידים אחרים בעת שימוש ברקמה טריה, על ידי מתן אפשרות לוקליזציה מדויקת יותר של חי תרכובות מולקולריות, כגון אנזימים וחלבונים אחרים 18. ואכן, שיטה זו הוכחה לאורך השנים כשיטה יעילה ונוחה בעלות נמוכה של קיבוע עבור להדמיה ברמה EM במינים רבים, כולל דו חיים מכרסמים, כפי שהוא יעיל stabiliפפטידים וחלבוני zes, שומרים antigenicity ומספקים יחסית ללא פגע ultrastructure כאשר נעשו שימוש בשילוב עם אלדהיד אחר קוֹבֵעַ 16, 18, 19, 20, 21. הפרוטוקולים לקיבוע acrolein במכרסמים יש ומאז כבר טופל ו שימוש נרחב, בעיקר על ידי קבוצת פיקל, ליישם immunolabeling כפול עבור 16 EM, 22. כמה קבוצות שהשתמשו קיבוע acrolein ברקמת המוח הפרימטים הלא-אנושי 23. עם זאת, למיטב ידיעתנו, יש רק פרוטוקול אחד שפורסם ביעילות המתאר קיבוע כימי עם acrolein ב פרימטים לא אנושיים התואמת EM immunolabeling 24.

במאמר זה, אנו מספקים שיטה קלה ואמינה כימיים יעיל לתקן אי-לזמזםמוח הפרימטים עם acrolein, המאפשר שימור לטווח ארוך בפוטנציה יחד עם טרום הטבעת EM immunolabeling והעביר בדיקה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

משפט ואתיקה: כל הפרוטוקולים מעורבים בעלי חיים אושרו על ידי Laval Comité דה להגנת des animaux de l'אוניברסיטת ונעשו על פי המועצה הקנדית על מדריך Animal Care אל לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (אד 2.). הפרוטוקול המתואר כאן היה מותאם לבעלי חיים בוגרים של כ 800 גרם. הנפחים של מקבע צריכים להיות מותאמים בהתאם לגודל החיה.

1. הכנת פתרונות עבור Transcardiac זלוף

  1. הכן 1 ליטר של נתרן 50 מ"מ פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) פתרון על פי השלבים הבאים. הכן את הפתרון לכל היותר 24 שעות לפני זלוף ולשמור על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
    1. מדוד 800 מ"ל של מים מזוקקים בכוס L 1. מוסיפים 5.87 גרם של סודיום פוספט נטול dibasic (Na 2 HPO 4), 1.20 גרם של סודיום פוספט מונוהידראט monobasic (לאא 2 PO 4 · H 2 O), ו 9 גרםשל נתרן כלורי (NaCl). מערבבים לפזר.
    2. התאם את ה- pH 7.4 ידי הוספת בהדרגה 5 N NaOH. מוסיפים מים מזוקקים כדי להגיע בנפח כולל של 1 ל
      זהירות: NaOH הוא תרכובת כימית מאכל. תלבש את אישי מגן ציוד מתאים (PPE;. מעיל מעבדה, כפפות, משקפי מגן, וכו ').
  2. כן 2 L של 4% paraformaldehyde (PFA) על פי השלבים הבאים. פתרון זה אמור להיות מוכן לכל היותר 24 שעות לפני הניתוח והמשיך ב 4 ° C עד השימוש.
    1. מדדו 1.5 ליטר של מים מזוקקים בכוס 2-L. להוסיף 23.48 גרם של נתרן פוספט נטול dibasic (Na 2 HPO 4) ו 4.80 גרם של סודיום פוספט מונוהידראט monobasic (לאא 2 PO 4 · H 2 O). מערבבים לפזר. מוסיפים מים מזוקקים כדי להגיע בנפח כולל של 2 ל
    2. מחממים את הפתרון מתחת למכסה המנוע אוורור עד שהטמפרטורה מגיעה לכ 45 - 55 מעלות צלזיוס. אין לחמם מעל 60 מעלות צלזיוס.
    3. מוסיפים בהדרגה 80 גרם של PFA לפתרון ומערבבים עד שהיא נמסה לחלוטין (כ 30 - 60 דקות). שמור ניטור הטמפרטורה כדי לשמור אותו מתחת 60 מעלות צלזיוס.
      זהירות: PFA תנודתי מאוד, בצורת אבקה שלה. זה מאוד רעיל אם במגע עם עיניים או עור הוא מסוכן במקרה של שאיפה או בליעה. תלבש PPE ולהשתמש בזהירות מתחת למכסה המנוע אוורור.
    4. מצננים את הפתרון עד 4 מעלות צלזיוס ולסנן. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
  3. כן 1 ליטר של acrolein 3% ב 0.1 חיץ פוספט M (PB) על פי השלבים הבאים. פתרון PB צריך להיות מוכן לכל היותר 24 שעות לפני זלוף.
    זהירות: Acrolein היא רעילה אם נשאף ויכולים לייצר נזק מיידי. זה גם מאכל רעיל מאוד אם נספג דרך העור. זה מסרטן ו מוטגנים. תלבש את PPE המתאים ולהשתמש מתחת למכסה המנוע אוורור.
    1. מדוד 800 מ"ל של מים מזוקקים. מוסיפים 8.66 גרם של סודיום פוספט נטול dibasic (Na 2 HPO 4) ו 5.38 גרם של סודיום פוספט מונוהידראט monobasic (לאא 2 PO 4 · H 2 O). מערבבים עד שכל מלחים להתמוסס. מוסיפים מים מזוקקים כדי להגיע בנפח כולל של 1 ל שמור את הפתרון ב- C 4 °.
    2. לפני הניתוח, להעביר 900 מ"ל של הפתרון PB למיכל 1 L זכוכית ולהוסיף 30.94 מ"ל של תמיסת acrolein 97% מתחת למכסה המנוע אוורור. הוספת פתרון PB כדי להגיע בנפח כולל של 1 ליטר ומערבבים. סנן הפתרון ולשמור אותו 4 ° C.

2. Transcardiac זלוף המוח Dissection

  1. שמור פתרונות על הקרח במהלך ההליך הכירורגי כולו. הכן את המשאבה על ידי הנחת הצינור בפתרון הראשון לשמש (PBS; 50 מ"מ) וסיבוב המשאבה עד אין האוויר נשאר בצינור. עבור זלוף transcardiac של קוף מקוק, להשתמש במחט G 21 ולהגדיר את יצוא בכ 80 מ"ל / דקה.
  2. להרדים את החיה עם זריקה תוך שרירית של תמהילטבעה של קטמין (20 מ"ג / ק"ג), xylazine (4 מ"ג / ק"ג), ו acepromazine (0.5 מ"ג / ק"ג). שמרו את החיה תחת isoflurane (3%) סדציה.
  3. צרף את איברי גופו של בעל חי שולחן אוורור.
  4. עם אזמל, להסיר את העור לבתי השחי. חותכים את שרירי הבטן. השתמש במספריים כירורגית ההכבדות לחתוך את הצלעות רוחביות על ידי הימנעות האיברים החיוניים בזהירות.
  5. חותכים את הסרעפת עם מספריים כירורגיים ולהעלות את בית החזה כדי לחשוף את הלב. לאחר הסרעפת נחתכה, להמשיך במהירות, שכן בלב יפסיק לפעום בתוך דקות.
  6. הסר את קרום הלב עם להב סקלפל להכניס את המחט לתוך החדר השמאלי. עם אזמל, בזהירות לבצע כריתה קטנה העלייה הימנית. להתחיל את המשאבה במהירות 72 מ"ל / דקה והחזק את המחט במקום. במידת האפשר, להטות את החיה על מנת שיהיה ראשו ברמה נמוכה יותר מאשר הלב.
    הערה: היזהר שלא לנקב מחצה interventricular כאשר החדרת המחט.
    1. Rinsדואר בדם עם כ 300 מ"ל של PBS עד הריאות הם לבן ושום דם יוצא העלייה הימנית.
  7. עצור את המשאבה, במהירות להעביר את הצינור / צינור לפתרון acrolein 3%, ולהתחיל את המשאבה שוב. בהדרגה להגדיל את מהירות השאיבה כדי 80 מ"ל / דקה אחת בלב הפסיק לפעום. Perfuse כ 500 מ"ל של הפתרון acrolein.
  8. עצור את המשאבה, במהירות להעביר את הצינור פתרון 4% PFA, ולהתחיל את המשאבה שוב. צעד זה דורש כ 1 ליטר של PFA.
    הערה: הקיבוע יושלם כאשר forelimbs הם נוקשים ואת הצוואר נוקשה.
  9. חותכים את הראש בזהירות לנתח את המוח מתוך הגולגולת. תשמור על עצמך כדי לא להזיק למוח עם מכשירי הניתוח. זלוף הוא אופטימלי כאשר המוח הוא חיוור (ללא שמץ של דם) וקשיח (איור 1A).
  10. לטבול את המוח ללא פגע ב 4% PFA עבור 1 ש 'ב 4 מעלות צלזיוס.
  11. סדרתי לחתוך את המוח עם (C 4 °) קירור vibratomeבמישור הרצוי לתוך 50 חלקים עבים מיקרומטר ולאסוף אותם PBS (0.1 M) (איור 1B).
    הערה: שלב זה יכול להתבצע בדרכים רבות על פי הפרוטוקול הרצוי. חצי כדור ניתן להפריד לפני vibratome חיתוך, או כל זמן. אם המוח הוא גדול מדי עבור פלטפורמת vibratome, אותו ניתן לחתוך לקוביות קטנות. לאחר שלב זה, ניתן לאחסן חלקים לתקופה ארוכה של זמן -30 ° C בתמיסה לרדיאטור עשוי 40% PB (50 מ"מ), 30% גליצרול, ו אתילן גליקול 30%.

3. טרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה (איור 1C)

  1. הכן פתרון המניות 4 L של טריס שנאגרו מלוחים (TBS, 50 מ"מ, 7.6 pH) כדלקמן.
    1. מדוד 2L של מים מזוקקים בכוס 4 L, להוסיף 24.23 גרם של aminomethane trihydroxymethyl (Tham; C 4 H 11 NO 3), ומערבבים לפזר.
    2. התאם את ה- pH 7.6 עם כ 148 מ"ל של 1 N HCl. החומצה יש להוסיף עם cautiעל מנת למנוע הגעת pH מתחת 7.6. הנפח הכולל צריך להיות 4 ל
      זהירות: HCl היא מאכל מאוד. תלבש את PPE המתאים.
  2. בחרו מקטעים (משלב 2.11) המכילים את האזור של עניין להיות מעובד על אימונוהיסטוכימיה EM.
  3. לשטוף את הסעיפים "פנויות" 3x ב PBS (0.1 M, pH 7.4) עבור 5 דקות ב RT לשטוף את הפתרון למניעת קפיאה.
  4. כן פתרון 0.5% של NaBH 4 מדולל PBS.
    1. לשקול 0.05 גרם של NaBH 4 ו לדלל אותו 10 מ"ל של PBS. אל תכסה. הכן את הפתרון הזה ממש לפני השימוש.
  5. דגירה סעיפים בפתרון NaBH 4 וטרי עבור 30 דקות ב RT. רוק בעדינות. אל תכסה.
  6. 3x Wash ב PBS עבור 10 דקות ב RT, נדנדה במרץ עד שאף אחד גז התגובה נשאר.
  7. כן פתרון לחסימה עבור EM עם 2% בסרום נורמלי המתאים ג'לטין דגים קרים 0.5% בדילול מלא PBS.
    הערה: שאול הכמותd יחושב על מנת שיהיה מספיק את שלושת השלבים הבאים. השתמש בסרום עשוי מאותו המין חי אירוח הנוגדנים משני. הימנע משימוש בשיטות אחזור אנטיגן או תוספת של כמויות קטנות של טריטון (כדי להגביר את החדירה של נוגדנים), כמו שיטות אלה באופן משמעותי להתפשר על איכות הרקמה.
  8. דגירת הסעיפים בפתרון החסימה עבור 1 ש 'ב RT. רוק בעדינות.
  9. כן פתרון נוגדן ראשוני מדולל הפתרון החוסם.
    הערה: ריכוז של הנוגדן הראשוני הוא בדרך כלל זהה אימונוהיסטוכימיה LM, אבל לשקול בדיקות ניצוח עם ריכוזי נוגדנים שונים מראש, כפי שכמה נוגדנים ראשוניים עשויים שלא לפעול עם acrolein. אם כך, אפשר להשתמש בשילוב של glutaraldehyde (0.1 - 2%) ו 4% PFA זלוף transcardiac ולקבל תוצאות דומות. ייעל את הזמן ואת טמפרטורת דגירה גם כן.
  10. דגירת מקטעי פתרון נוגדן ראשוניהלילה ב RT עם נדנדה עדינה. השתמש זמן דגירה נבדק בעבר וטמפרטורה.
  11. לשטוף את הסעיפים 3x ב PBS עבור 5 דקות ב RT עם נדנדה עדינה.
  12. כן 1: פתרון 1000 של נוגדנים משני biotinylated מדולל הפתרון החוסם.
    הערה: הנוגדנים משני חייבים להישאל נגד מיני המארח השתמשו כדי ליצור את הנוגדן הראשוני.
  13. דגירת מקטעי פתרון נוגדנים משני עבור 1.5 שעות ב RT. רוק בעדינות.
  14. כן פתרון avidin ביוטין-peroxidase (ABC) לפחות 60 דקות לפני סוף דגירת הנוגדנים משני.
    1. השתמש פיפטה מכויל למדוד 8.80 μL / מ"ל ​​של פתרונות A ו- B ו- לדלל אותם PBS.
    2. רוק בעדינות במשך לפחות 60 דקות ב RT כדי לאפשר להשלים מחייב בין מולקולות avidin ו ביוטין.
  15. לאחר הדגירה בתמיסת נוגדן משנית, לשטוף 3x ב PBS עבור 10 דקות ב RT.
  16. דגירת סעיפי ABC כךlution עבור 1 ש 'ב RT. רוק בעדינות.
  17. שטפי פעם ב PBS פעמים ב TBS עבור 10 דקות ב RT עם נדנדה עדינה.
  18. כן פתרון חדש של 0.05% 3,3'-diaminobenzidine (DAB) עם 0.005% H 2 O 2 מדולל TBS.
    1. לשקול 12.5 מ"ג של DAB ו לדלל אותו 25 מ"ל של TBS קר. להגן מפני אור.
      זהירות: אבקת DAB היא מאוד תנודתי מזיקים אם נשאף. זה הרסני טרטוגניות. לכן, נשים הרות או מיניקות לא צריכות לתפעל את המוצר הזה, גם כאשר מדולל. השתמש מסכת N95 כאשר מניפולציה וללבוש PPE.
    2. סנן הפתרון ולהוסיף 4.5 μL של 30% H 2 O 2 רק לפני השימוש.
  19. סעיפי דגירה בתמיסת DAB עבור 3 עד 7 דקות ב RT. רוק בעדינות.
    הערה: המשקע החום לא צריך להיות כהה מדי כדי למנוע רמה גבוהה של מכתים רקע. זמן הדגירה צריך להיות מותאם בהתאם.
  20. עצור את התגובה על ידי שטיפה פעמיים במהירותב קר TBS, אז פעמים עבור 10 דק 'ב TBS הקר ב RT, ואחריו פעמים על ידי עבור 10 דק' ב PB, עם נדנדה עדינה.
    הערה: השימוש PB (ולא PBS) הוא קריטי כדי לחסל כל זכר של NaCl, כפי שהוא יגיב עם קריסטלים אוסמיום וצורה.

4. Osmification והטבעה עבור אלקטרונים מיקרוסקופים תצפית

  1. הכן תמיסה של tetroxide אוסמיום 1% (OSO 4) מדולל PB. להגן מפני אור.
    זהירות: אוסמיום היא רעילה ביותר ויש לא לבוא במגע עם העור, העיניים, או הפה לא צריך להיות בשאיפה. זה יכול לגרום למוות במקרה של בליעה. זה אמור לשמש רק מתחת למכסה המנוע אוורור ועם PPE המתאים.
  2. דגירת מקטעי פתרון 4 OSO עבור 30 דקות ב RT ובמנוע האוורור (ללא תסיסה) ומכסה אותם בנייר אלומיניום כדי להגן עליהם מפני אור. לחלוטין לשטח את הסעיפים לפני הוספת הפתרון 4 OSO.
    הערה: הסעיפים להיות מאוד חשוכים RIGID וצריך לטפל בהם בזהירות, לאחר שלב זה.
  3. כן שרף אפוקסי דוחה המים במהלך osmification.
    1. להוסיף כמויות מתאימות של כל רכיב של תערובת אפוקסי שרף (20 גרם של שרף אפוקסי, 20 גרם של המקשה, 0.6 גרם של מאיץ ו 0.4 גרם של plasticizer) כדי כוס פלסטיק גדולה. מערבבים עם מקל עץ או טפטפת פלסטיק עד לצבע חום הומוגני מתקבל.
      הערה: חשוב מאוד להשתמש הפרופורציה המדויקת של כל רכיב.
    2. העבירו כמויות שוות כוסות אלומיניום בגדלים מתאימים, בהתאם למספר סעיפים כדי להיות מעובד. אפשר אותו לנוח.
  4. לשטוף את הסעיפים osmificated 3x ב PB עבור 10 דקות ב RT עם נדנדה במהירות נמוכה.
  5. מייבש את הסעיפים הבאים בסדרה של אתנול מדורג עבור 2 דקות כל אחד: 2 פעמים באתנול 35%; 1 זמן כל אחד 50, 70, 80, 90, ו 95% אתנול; ו 3x ב 100% אתנול.
  6. העברת חלקים ל מבחנות זכוכית להשלמת dehydratiעל התהליך על ידי דוגרים בסעיפים 3 פעמים במשך 2 דקות ב פרופילן אוקסיד.
    זהירות: פרופילן אוקסיד הוא ממיס אורגני נדיף ורעילים מאוד. זה יכול לגרום לנזק רציני בעיניים ובעור במקרה של מגע או אם נשאף או בליעה. זה סווג חומר מסרטן 2 כיתה. זה אמור לשמש רק מתחת למכסה המנוע אוורור ועם PPE. זהו גם דליקים מאוד וצריכים להישמר הרחק מכל מקור חום.
    הערה: לפני שלב זה, סעיפים יועברו בזהירות צלוחיות זכוכית, מאז פרופילן אוקסיד הוא ממיס אורגני אינו עולה בקנה אחד עם פלסטיק. בשלב זה, חלקים מאוד שביר וצריך לטפל בהם בזהירות. סעיפים ניתן להעביר לחילופין צלוחיות זכוכית לפני צעד 4.5.
  7. העברת חלקים בזהירות, אחד אחד, בתוך כוסות אלומיניום ולהימנע ממגע עם אוויר ככל האפשר. שטוח להטביע את הסעיפים שרף אפוקסי דוחה מים מעורב בעבר דגירה אותם בן לילה תחת ventinברדס גרם ב RT.
    הערה: בשלב זה, את הסעיפים הם לגמרי מיובש מאוד שביר וצריך לטפל בהם בזהירות.
  8. באמצעות שמן מינרלים, להכין שקופיות זכוכית מצופי גריז יחד עם coverslips פלסטיק משומן.
  9. לרכך את השרף על ידי דוגרי כוסות אלומיניום ב 60 מעלות צלזיוס למשך 12-15 דקות לכל היותר. בזהירות לשטח את הסעיפים בצד המשומן של שקופית הזכוכית. מניח את coverslip משומנת ובזהירות לדחוף את כל אוויר נותר.
  10. דגירת השקופיות ב 60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
    הערה: חשוב מאוד לא יעלו על 48 h זמן דגירה, כמו השרף יהפוך קשה מדי.
  11. הסר את coverslip פלסטיק.

לדוגמא כנה 5. עבור Ultrathin חתך תצפית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים

  1. להשתמש במשקפת כדי למצוא באזור של העניין לחתוך חתיכה מרובעת קטנה של כ 1 מ"מ 2 עם אזמל.
  2. קובץ קצה גוש שרף ודבק quחתיכת adrangular גבי זה (איור 1C). אפשר הדבק להתייבש לפחות 1 h או לילה לפני חתך.
  3. שימוש ultramicrotome, לחתוך את פיסת מרובע לתוך 80 חלקים מיקרומטר בעובי (איור 1D).
    1. מניח את גוש השרף ב סיפון ultramicrotome במצב האנכי, באמצעות סכין גילוח חד, בהדרגה לחתוך בכל צד של הגוש שרף להרכיב טרפז עם צדדים חלקים.
    2. שים את סיפון מעמדה האופקית ולסובב את הבלוק עד שהצד הארוך ביותר של הטרפז פונה כלפי מטה.
    3. השתמש בכלי חיתוך יהלום או סכין זכוכית לקצץ פני השטח של יצירה המרובעת. הגדר את ultramicrotome לקצץ 300 מיקרומטר חלקים עבים על 1 מ"מ / s. התאם את הסכין להיות אנכית במקביל ליצירה מְרוּבָּע ולהציג זווית אופקי קטן מאוד של כ 1 °.
      הערה: זווית זו תאפשר למשתמש לגשת רקמות כמעט במקביל לפני השטח של bלנעול, שבו אלמנטים immunolabeled נוטים יותר למצוא. בעת שימוש בפרמטרים הללו עם כלי חיתוך היהלום, שרף מציג צבע לבן מבריק. כאשר הרקמה מתבצעת לחתוך, זה משתנה לצבע סגול או ירקרק.
    4. השתמש בסכין יהלום אולטרה 45 ° מאובזר עם סירה המלאה במים מזוקקים לקצץ 80 חלקים עבים מיקרומטר, להחליק חלקים על ידי העברה עליהם עם חתיכת סופג נייר הטה קסילן, וכן לאסוף קטעים סדרו על רשתות חריץ ניקל formvar מצופה או רשתות נחושת חשופים 150 רשת (איור 1E).
  4. מניחים את רשתות בתוך קופסת אחסון רשת.
  5. כתם הרשתות עם ציטראט להוביל.
    1. השתמש במזרק 5 מ"ל ומסנן מזרק 0.2 מיקרומטר להכין 1: פתרון 1 של מניות פתרון ציטראט להוביל מסוננים ומים מזוקקים מסונן. להגן עליו מפני אור.
      הערה: הפתרון המניות של ציטרט להוביל צריכה להיעשות טרי מדי חודש, כדי למנוע היווצרות של depos מוצקשֶׁלָה. עיין גיליון נתונים מהותיים עבור מתכון המניות. בנוסף, אם סדרות רבות של רשתות צריכות להיות מוכתמות, לשנות את הפתרון בדילול כאשר הוא הופך להיות חלבי.
    2. מניח כל רשת על ירידה של הפתרון המדולל, עם הסעיף במגע עם הפתרון. דגירה של 3 דקות.
    3. להשתמש בפינצטה קטנה להחזיק את הרשת, וכן לשטוף ביסודיות את זה בשתי כוסות המכילות מים מזוקקים.
    4. הסרה של עודפי מים באמצעות נייר סופג בעדינות. אחסן את הרשתות בקופסא לרשת. חכה 30 דקות לפני בחינת הסעיפים ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים (TEM; איור 1F).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בחלק זה, אנו מציגים תוצאות נציגים שהושגו בעקבות התצפית, ברמת EM השידור, של רקמת המוח הפרימטים immunostained הקבוע כימי בתערובת של acrolein 3% ו 4% PFA. השגנו שימור טוב של ultrastructure, כפי שצוין על ידי מעטפת המיאלין יחסית ללא פגע והדמיון המודרך המסודר של ממברנות כפולות (איור 2 א). קשרים סינפטיים, יחד עם אלמנטים עצביים מן המיקרו-סביבה, ניתן לזהות בקלות (איור 2B). אלמנטים עצביים שכותרתו עם diaminobenzidine (DAB) im...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול אמין זלוף transcardiac של פרימטים לא אנושיים אימונוהיסטוכימיה טרום ההטבעה המתאימה לבדיקת מדגם EM. למרות טיפוסי קריו-EM, כגון CEMOVIS, מספק שימור טוב של ultrastructure המוח, זה גם מגביל את השימוש אימונוהיסטוכימיה 12. טכניקות אחרות, כוללים החלפת קריו וטכניקת Tokuyaso, לאפשר שיתוף של פוסט-הטבעת אימונוהיסטוכימיה, אך הטכניקות הללו הן יקרות בשל התקנים נוספים הדרושים בתהליך ויכולות להיות רב זמן ומיומן-מאתגר 12,<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC, 401,848-2011 כדי MP). MP קיבל פרס הקריירה מן Fonds דה משוכלל ונדיר קוויבק-Santé (FRQ-S). LE היה הנמען של דוקטורט מן FRQ-S (FRQ-S 14D 29,441). אנו מודים מארי ג'וזי Wallman לקבלת סיוע טכני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נתרן פוספט נטול מים דו-בסיסי (Na2HPO4)Fisher scientificS374-500
Monobasic monohydrate נתרן פוספט (NaH2PO4· H2O)EM ScienceSX0710-1
נתרן כלורי (NaCl)פישר מדעיS271-3
הידרוקסימתיל אמינומתאן (THAM)פישר מדעיT370-500
הידרוכלוריד דילול EMDHX0603-31 N. המוצר מאכל. יש להשתמש עם הגנה מתאימה.
דילול NaOHEMDSX0590-15 N. המוצר מאכל. יש להשתמש עם הגנה מתאימה.
פרפורמלדהיד (PFA)SigmaP6148דילול של 4%. המוצר נדיף מאוד בצורת האבקה שלו ורעיל מאוד. השתמש בזהירות מתחת למכסה אוורור עם הגנה מתאימה.
אקרולאין (90%)סיגמא110221דילול של 3%. המוצר רעיל מאוד. השתמש מתחת למכסה אוורור עם הגנה מתאימה.
שולחן אוורור נתיחה לאחר המוותMopecCE400
משאבת זלוף אלקטרוניתקול פרמרמאסטרפלקס L/S 7523-90
מחט (זלוף)terumo NN-1838R18 גרם 11/2
מחט NN-2713R21 גרם 1/2
קטמין20 מ"ג/ק"ג
קסילזין4 מ"ג/ק"ג
אצפרומזין0.5 מ"ג/ק"ג
אזמל
להבי אזמלנוצות                    לאנס201011                    J9913מס '22 לניתוח ומס '11
למספריים
Rongeurs
VibratomeLeicaVT 1200Sכיול להב לפני כל שימוש, כאשר המכשיר מאפשר זאת
סכין גילוח ויברטוםGilletteGIN 642107
גליצרולפישר מדעיG33-4דילול 30%
אתילן גליקולפישר מדעיE178-4דילול 30%
נתרן בורוהידריד (NaBH4)SigmaS-9125
סרום סוס רגיל (NHS)Jackson immunoResearch Laboratories008-000-121דילול 2%
ג'לטין דגים קריםAurion900.0330.5% דילול. המוצר המקורי מרוכז ב-40%
נוגדן ראשוני, SERTSanta Cruz biotechnologySC-14581/500 דילול
נוגדן ראשוני, דילול ChATChemicon (Millipore)AB144P1/25
נוגדן ראשוני, THImmunoStar229411/1,000 דילול
נוגדן משני ביוטיניל,מעבדות וקטורBA-95001/1,000 דילול
נוגדן משני ביוטיניל,מעבדות וקטורעכבר BA-20001/1,000 דילול
ערכת ABC עלית Vectastain מעבדותוקטורPK61008.8 ומיקרו; L/mL של A ו-B כל אחד
3,3'-diaminobenzidine (DAB)SigmaD5637דילול של 0.05%. המוצר נדיף מאוד בצורת האבקה שלו ורעיל. אין לזרוק פסולת לכיור.
מי חמצן (H<תת>2O2) 30%פישר מדעיH-3230.005% דילול
אוסמיום טטרוקסיד (OsO4)מדע מיקרוסקופי אלקטרונים2% 19152
4% 19150
תמיסה מקורית יכולה להיות 2 או 4%. שימו לב לאיזה מהם משמש לחישוב הדילול הסופי של 1%. המוצר רגיש מאוד לאור. אוסמיום רעיל מאוד. השתמש רק מתחת למכסה אוורור עם הגנה מתאימה.
שרף אפוקסי דוחה מים DurcupanSigmaA: שרף אפוקסי M (44611)
B: מקשה 964 (44612)
C: מאיץ 960 (DY 060) (44613)
D: פלסטיק (44614) 		פילמור 48 שעות ב-58 מעלות; C לפני שזורקים פסולת.
כוסות אלומיניוםמדע מיקרוסקופי אלקטרונים70048-01
אלכוהול מסחריאתנול1019Cלדלל במים מזוקקים בריכוז מתאים
תחמוצת פרופילןמדע מיקרוסקופי אלקטרונים20401ממס אורגני. נדיף מאוד ורעיל. השתמש מתחת למכסה המנוע.
שקופיות זכוכית בינונית לא מצופותמעבדות מחקר מוח3875-FRמשטח גריז עם שמן מינרלי
סרט פלסטיק (סרט הטבעה של Aclar)מדע מיקרוסקופי אלקטרונים50425-25משטח גריז עם שמן מינרלי
UltramicrotomeLeica UC7EM UC7
כלי חיתוך יהלום (אולטרה-טריים)דיאטומה UT 1081יכול להשתמש בסכין זכוכית לחלופין
Ultra 45° סכין יהלום דיאטום MC13437מצויד בסירה
XylenesFisher scientificX5SK-4
150-mesh רשתות נחושתאלקטרונים מדע מיקרוסקופיG150-cu
תיבת רשתאלקטרונים מדע מיקרוסקופי71138יכול לאחסן עד 100 רשתות
נתרן ציטראטאנכימיה81983
עופרת חנקתיתסיגמאL-6258הכינו תמיסת מלאי של ציטראט עופרת העשויה מ-1.33  גרם עופרת חנקתית ו-1.76  גרם נתרן ציטראט מדולל ב-42  מ"ל מים מזוקקים מבושלים ומקוררים מראש שאליהם 8  מ"ל של 1  N NaOH מתווספים לאחר השלמת ההמרה מחנקת עופרת לציטראט עופרת. ה-pH צריך להיות בערך 12. אחסן את התמיסה בבקבוק פלסטיק הרמטי והגן מפני אור.
מזרק מסנן מזרק SS-05L5 מ"ל
קורנינג4312220.2 ומיקרו; m
נייר סופג (נייר ביבולוסי)מדע מיקרוסקופי אלקטרונים70086-1
סרט מעבדתפרפילםPM-999
שמן מינרליסיגמאM5904
טרומוכירורגיים EM עזים טרומו

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pozzi, P., Gandolfi, D., et al. High-throughput spatial light modulation two-photon microscopy for fast functional imaging. Neurophotonics. 2 (1), 015005(2015).
  2. Zhou, Y., et al. A comparison study of detecting gold nanorods in living cells with confocal reflectance microscopy and two-photon fluorescence microscopy. J. Microsc. 237 (2), 200-207 (2010).
  3. Chao, W., Kim, J., Rekawa, S., Fischer, P., Anderson, E. H. Demonstration of 12 nm resolution Fresnel zone plate lens based soft X-ray microscopy. Opt. Express. 17 (20), 17669-17677 (2009).
  4. Wachulak, P., Bartnik, A., Fiedorowicz, H. A 50 nm spatial resolution EUV imaging-resolution dependence on object thickness and illumination bandwidth. Opt Express. , (2011).
  5. Wachulak, P., et al. A compact "water window" microscope with 60 nm spatial resolution for applications in biology and nanotechnology. Microsc. Microanal. , 1-10 (2015).
  6. Stikov, N., et al. In vivo histology of the myelin g-ratio with magnetic resonance imaging. Neuroimage. 118, 397-405 (2015).
  7. Stikov, N., et al. Quantitative analysis of the myelin g-ratio from electron microscopy images of the macaque corpus callosum. Data Brief. 4, 368-373 (2015).
  8. Mollenhauer, H. H. Artifacts caused by dehydration and epoxy embedding in transmission electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 26 (6), 496-512 (1993).
  9. Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Q. Rev. Biophys. 37 (1), 3-13 (2004).
  10. Sander, B., Golas, M. M. Visualization of bionanostructures using transmission electron microscopical techniques. Microsc. Res. Tech. 74 (7), 642-663 (2011).
  11. Ren, G., Rudenko, G., Ludtke, S. J., Deisenhofer, J., Chiu, W., Pownall, H. J. Model of human low-density lipoprotein and bound receptor based on cryoEM. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (3), 1059-1064 (2010).
  12. Webster, P., Schwarz, H., Griffiths, G. Preparation of cells and tissues for immuno EM. Methods Cell Biol. 88, 45-58 (2008).
  13. Kürner, J., Medalia, O., Linaroudis, A. A., Baumeister, W. New insights into the structural organization of eukaryotic and prokaryotic cytoskeletons using cryo-electron tomography. Exp. Cell Res. 301 (1), 38-42 (2004).
  14. Humbel, B. M. Freeze-substitution. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 13, 319-341 (2009).
  15. Stierhof, Y., Humbel, B. M., van Donselaar, E., Schwarz, H. Cryo-fixation, freeze-substitution rehydration and Tokuyaso cryo-sectioning. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 14, 344-365 (2009).
  16. Leranth, C., Pickel, M. V. Electron microscopic pre-embedding double-immunohistochemical methods. Neuroanatomical tract-tracing methods 2. , 129-172 (1989).
  17. Luft, J. H. The use of acrolein as a fixative for light and electron microscopy. Anat. Rec. 133, 305-305 (1959).
  18. Saito, T., Keino, H. Acrolein as a fixative for enzyme cytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 24 (12), 1258-1269 (1976).
  19. King, J. C., Lechan, R. M., Kugel, G., Anthony, E. L. Acrolein: a fixative for immunocytochemical localization of peptides in the central nervous system. J. Histochem. Cytochem. 31 (1), 62-68 (1983).
  20. Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J. Cell Biol. 17, 19-58 (1963).
  21. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: I. Preservation with aldehyde perfusates versus direct perfusion with osmium tetroxide with special reference to membranes and the extracellular space. J. Ultrastruct. Res. 12, 160-186 (1965).
  22. Sesack, S. R., Pickel, V. M. Dual ultrastructural localization of enkephalin and tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the rat ventral tegmental area: multiple substrates for opiate-dopamine interactions. J. Neurosci. 12 (4), 1335-1350 (1992).
  23. Mathai, A., Ma, Y., Paré, J., Villalba, R. M., Wichmann, T., Smith, Y. Reduced cortical innervation of the subthalamic nucleus in MPTP-treated parkinsonian monkeys. Brain. 138 (4), 946-962 (2015).
  24. Villalba, R. M., Paré, J., Smith, Y. Three-dimensional electron microscopy imaging of spines in non-human primates. Transmission electron microscopy methods for understanding the brain. 115, 81-103 (2016).
  25. Eid, L., Champigny, M., Parent, A., Parent, M. Quantitative and ultrastructural study of serotonin innervation of the globus pallidus in squirrel monkeys. Eur. J. Neurosci. 37 (10), 1659-1668 (2013).
  26. Eid, L., Parent, A., Parent, M. Asynaptic feature and heterogeneous distribution of the cholinergic innervation of the globus pallidus in primates. Brain Struct. Funct. 221, 1139-1155 (2016).
  27. Eid, L., Parent, M. Morphological evidence for dopamine interactions with pallidal neurons in primates. Front. Neuroanat. 9, 111-114 (2015).
  28. McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods Mol. Biol. 117, 77-97 (1999).
  29. Gilkey, J., Staehelin, L. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. J. Electron Microsc. Tech. 3, 177-210 (1986).
  30. Korogod, N., Petersen, C. C. H., Knott, G. W. Ultrastructural analysis of adult mouse neocortex comparing aldehyde perfusion with cryo fixation. eLife. 4, (2015).
  31. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: III. Structural changes after exsanguination and delayed perfusion. J. Ultrastruct. Res. 14, 47-63 (1966).
  32. Schultz, R. L., Maynard, E. A., Pease, D. C. Electron microscopy of neurons and neuroglia of cerebral cortex and corpus callosum. Am. J. Anat. 100 (3), 369-407 (1957).
  33. Gocht, A. Use of LR white resin for post-embedding immunolabelling of brain tissue. Acta Anat. (Basel). 145 (4), 327-339 (1992).
  34. Eldred, W. D., Zucker, C., Karten, H. J., Yazulla, S. Comparison of fixation and penetration enhancement techniques for use in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 31 (2), 285-292 (1983).
  35. Manocha, S. L. Effect of glutaraldehyde fixation on the localization of various oxidative and hydrolytic enzymes in the brain of rhesus monkey, Macaca mulatta. Histochem. J. 2 (3), 249-260 (1970).
  36. Mrini, A., Moukhles, H., Jacomy, H., Bosler, O., Doucet, G. Efficient immunodetection of various protein antigens in glutaraldehyde-fixed brain tissue. J. Histochem. Cytochem. 43 (12), 1285-1291 (1995).
  37. Storm-Mathisen, J., Ottersen, O. P. Immunocytochemistry of glutamate at the synaptic level. J. Histochem. Cytochem. 38 (12), 1733-1743 (1990).
  38. Hwang, S. J., Rustioni, A., Valtschanoff, J. G. Kainate receptors in primary afferents to the rat gracile nucleus. Neurosci. Lett. 312 (3), 137-140 (2001).
  39. Palay, S. L., McGee-Russeel, S. M., Gordon, S. Jr, Grillo, M. A. Fixation of neural tissues for electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. J. Cell Biol. 12, 385-410 (1962).
  40. Corthell, J. Chapter 9, Perfusion and Immersion Fixation. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 1st ed, Academic Press. 83-90 (2014).
  41. Helander, K. G. Formaldehyde prepared from paraformaldehyde is stable. Biotech. Histochem. 75 (1), 19-22 (2000).
  42. van Harreveld, A., Khattab, F. I. Perfusion fixation with glutaraldehyde and post-fixation with osmium tetroxide for electron microscopy. J. Cell. Sci. 3 (4), 579-594 (1968).
  43. Renno, W. M. Post-embedding double-gold labeling immunoelectron microscopic co-localization of neurotransmitters in the rat brain. Med. Sci. Monit. 7 (2), 188-200 (2001).
  44. Ellisman, M. H., Deerinck, T. J., Shu, X., Sosinsky, G. E. Picking Faces out of a Crowd: Genetic Labels for Identification of Proteins in Correlated Light and Electron Microscopy Imaging. Methods Cell Biol. 111, 139-155 (2012).
  45. Labrecque, S., et al. Hyperspectral multiplex single-particle tracking of different receptor subtypes labeled with quantum dots in live neurons. J. Biomed. Opt. 21 (4), 046008(2016).
  46. Bailey, R., Smith, A., Nie, S. Quantum dots in biology and medicine. Physica E Low Dimens. Syst. Nanostruct. 25 (1), 1-12 (2004).
  47. Perkovic, M., et al. Correlative light- and electron microscopy with chemical tags. J. Struct. Biol. 186 (2), 205-213 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DAB

מאמרים קשורים