Method Article

לדוגמא ריבוב של רקמות משופרת שימוש משולב מבשר איזוטופים תיוג ו Isobaric תיוג (cPILOT)

DOI:

10.3791/55406

⸱

May 1st, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Pittsburgh, 2SGS North America Inc., 3Large Molecule Analytical Development, Pharmaceutical Development & Manufacturing Science, Janssen Research and Development

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיוג מבשר איזוטופים בשילוב ותיוג isobaric (cPILOT) הוא אסטרטגית פרוטאומיקה כמותית המשפר יכול ריבוב מדגם של תגי isobaric. פרוטוקול זה מתאר את היישום של cPILOT לרקמות מתוך שולטת מודל עכבר מחלת אלצהיימר ו wild-type.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ישנה דרישה גוברת לנתח דגימות ביולוגיות רבות להבנת מחלות גילוי סמן ביולוגי. אסטרטגיות פרוטאומיקה כמותיות המאפשרות מדידה בו זמנית של מספר דגימות הפכה נפוצה לצמצם במידה ניכרת את עלויות וזמניות ניסיוני. המעבדה שלנו פיתחה טכניקה הנקראת מבשר בשילוב תיוג איזוטופי ותיוג isobaric (cPILOT), אשר משפר מדגם ריבוב של תיוג איזוטופי מסורתיים או גישות תיוג isobaric. cPILOT העולמי ניתן ליישם דגימות שמקורם בתאים, ברקמות, נוזלי גוף, או אורגניזמים שלמים נותן מידע על שכיחותם יחסית חלבון על פני תנאים מדגמים שונים. cPILOT עובד ע"י 1) באמצעות תנאי חיץ pH נמוכים כדי פפטיד dimethylate סלקטיבי N-טרמיני 2) באמצעות תנאי חיץ pH הגבוה לתייג אמינים ראשוניים של שאריות ליזין עם ריאגנטים isobaric-זמינים מסחרי (ראה טבלה של חומרים / ריאגנטים). המידהריבוב המדגם זמין תלוי מספר ההתוויות מבשרות משומשות מגיב תיוג isobaric. כאן, אנו מציגים ניתוח 12-Plex באמצעות קל וכבד dimethylation בשילוב עם שש-Plex ריאגנטים isobaric לנתח 12 דגימות מרקמות עכבר בניתוח יחיד. ריבוב משופר מועיל להקטנת זמן ניסיוני ועלות וחשובה יותר, מה שמאפשר השוואה על פני תנאים מדגמים רבים (ביולוגי משכפלות, שלב מחלה, טיפולים תרופתיים, גנוטיפים, או בזמן נקודות אורכות) עם הטיה וטעייה ניסיוניות פחות. בעבודה זו, גישת cPILOT הגלובלית משמשת כדי לנתח מוח, לב, כבד ורקמות ברחבי ביולוגי משכפל ממודל עכבר מחלת אלצהיימר בקרות מסוג פרא. ניתן ליישם גלובל cPILOT ללמוד תהליכים ביולוגיים אחרים ומותאם להגדיל ריבוב מדגם גדול מ 20 דגימות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטאומיקה קרובות כרוך הניתוח של דגימות רבות השתמשו כדי להבין טוב יותר תהליכי מחלה, קינטיקה אנזימטית, ופוסט translational שינויים, בתגובה לגירויים סביבתיים, בתגובת טיפולים רפואיים, גילוי סמן ביולוגי, או מנגנוני סמים. יכול להיות מועסק שיטות כמותיות למדוד הבדלים ביחס ברמות החלבון ברחבי דגימות וניתן ללא תווית או לערב תיוג איזוטופי (מטבולית, כימיים, או אנזימטי). שיטות תיוג איזוטופ יציבות גדלו ב פופולרי כי הם מאפשרים דגימות רבות להיות מנותחות בו זמנית ומתאימים דגימות מתאים שונים, רקמות, נוזלי גוף, או אורגניזמים שלמים. תיוג איזוטופ שיטות 1, 2,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

משפט ואתיקה: עכברים נרכשו ממוסד מחקר ביו עצמאי, ללא כוונת רווח ו שוכנו אגף משאבי חיות מעבדה באוניברסיטת פיטסבורג. כל הפרוטוקולים חיה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש באוניברסיטת פיטסבורג.

1. מיצוי חלבון ואת הדור של פפטידים עבור תיוג-כימי

  1. חלץ חלבון מן הרקמה, תאי, או נוזלי גוף.
    1. Homogenize 60-90 מ"ג של רקמות (למשל מוח, לב וכבד) ב חיץ מלוח פוספט ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cPILOT משתמשת כימיה מבוססת אמינה כדי כימי פפטידים תווית על יכולות ריבוב N- הסופי ואת השאריות ליזין ושפר מדגם. איור 2 מציג נתוני MS נציג כי מתקבל ניתוח cPILOT 12-Plex של מוח, לב, כבד ורקמות ממודל עכבר מחלת אלצהיימר בקרות מסוג פרא. כפי שניתן לראות בטבלה 1, שני משכפל ביולוגי עבור מחלת אלצהיימר ו עכברי-בר כלול בניתוח 12-Plex זה. איור 2 א מראה זוג שיא-טעון כפליים כי הוא מופרד על ידי ריווח m / z.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cPILOT מאפשרת מדידה בו זמנית של יותר מ 12 דגימות ייחודי. על מנת להבטיח תיוג מוצלח בשני שאריות N- הסופית וליזין של פפטידים, זה הכרחי כדי לקבל את ה- pH הנכון עבור כל קבוצה של תגובות ולבצע את התגובה dimethylation הראשון עבור תיוג פפטיד. dimethylation סלקטיבי על הסופית- N מבוצע על ידי בעל pH ב ~ 2.5 (± 0.2). זו מושגת על ידי ניצול ההבדלים של PKA של קבוצות אמינו על ליזין ואת N- הסופית. בשעה 2.5 pH, ליזין אינו פעיל (pKa ~ 10.5); עם זאת, אם ה- pH הוא חומצי מעט (כלומר pH 5-7) או ב.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש המחברים שום אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים מאוניברסיטת פיטסבורג קרנות הזנק NIH, מענק R01 NIGMS (GM 117,191-01) כדי RASR.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מים - MS GradeFisher ScientificW6-44 L כמות אינה הכרחית
אצטוניטריל - MS GradeFisherScientific A955-44 L כמות אינה הכרחית
חומצה אצטיתJ.T. Baker9508-01
תמיסת אמוניום הידרוקסיד (28 - 30%)Sigma Aldrich320145-500ML
אמוניום פורמטAcros Organics208-753-9
חומצה פורמיתפלוקה אנליטית94318-250ML-F
BCA ערכת בדיקת חלבוןפירס תרמו פישר סיינטיפיק23227
אוריאהביורד161-0731
טריסביורד161-0716
דיתיותרייוטול (DTT)פישר סיינטיפיקBP172-5
יודואצטמיד (IAM)Acros Organics144-48-9
L-ציסטאיןסיגמא אולדריץ', כימיה168149-25G
L-1-tosylamido-2 פנילאתיל כולורמתיל קטון (TPCK) שטופל בלבלב בקרסיגמא אולדריץ',T1426-100MG
CH2O); 36.5 - 38% ב-H2Oסיגמא אולדריץ', מדעיהחייםF8775-25ML
תמיסת פורמלדהיד (13CD2O); 20 wt % ב-D2O, 98 אטום % D, 99 אטום % 13Cסיגמא אולדריץ', כימיה596388-1G
נתרן ציאנובורוהידריד; דרגת ריאגנט, 95%סיגמא אולדריץ'156159-10גרם
נתרן ציאנובורורודוטריד; 96 אטום % D, 98% CPסיגמא אולדריץ', כימיה190020-1G
קצות סיבוב חזקים (SCX) ערכת הכנה לדוגמאProtea BioSciencesSP-155-24kit
מאגר טריאתיל אמוניום ביקרבונט (TEAB)סיגמא אולדריץ', ערכתT7408-100ML
(TMT 6 plex) - 6 תגובות (1 x 0.8 מ"ג)Thermo Fisher Scientific90061
הידרוקסילאמין הידרוכלורידסיגמא אולדריץ', כימיה255580-100G
מערבל מערבולת סטנדרטיפישר סיינטיפיק2215365ניתן להשתמש בכל מיקסר
אואזיס HLB 1 סמ"ק (10 מ"ג) מחסניות מיצוימים186000383אלו הן מחסניות C18
סעפת ואקום Visiprep SPE, DL (תוחם חד פעמי), דגם 24 יציאותסיגמא אולדריץ'57265דגם 12 יציאות מספיק גם
Speed-vacThermo ScientificSPD1010כל מותג של שואב מהירות מספיק
תא אמבט מיםThermo Scientific2825/2826כל מותג של  תא אמבט מים עם טמפרטורות מבוקרות מספיק.
הומוגנייזר מכני (כלומר FastPrep-24 5G)MP Biomedicals116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D עם דגימה אוטומטית של Nano LC AS-2Sciex-דגםזה אינו זמין עוד. כל ננו LC עם דגימה אוטומטית מספיק.
LTQ Orbitrap Velos Mass SpectrometerThermoScientific-דגםזה אינו זמין עוד. ניתן להשתמש במכשירים אחרים ברזולוציה גבוהה (למשל Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion או Orbitrap Fusion Lumos).
תוכנת חלבונים (למשל Proteome Discoverer)Thermo ScientificIQLAAEGABSFAKJMAUH 
איזון אנליטימטלר טולדוAL54
צלחת ערבובVWR12365-382כל מותג של צלחות ערבוב מספיקות
מד pH (תואם Tris)פישר סיינטיפיק (Accumet)13-620-183כל מותג של מד pH מספיק
pH 10 מאגרפישר סיינטיפיק06-664-261כל מותג של מאגר pH 10 מספיק
pH 7 מאגרפישר סיינטיפיק06-664-260כל מותג מאגר pH 7 מספיק
1.5 מ"ל צינורות אפנדורף, 500 pkפישר סיינטיפיק05-408-129כל מותג של צינורות אפנדורף 1.5 מ"ל מספיקים
0.6 מ"ל צינורות אפנדורף, 500 pkפישר סיינטיפיק04-408-120כל מותג של צינורות אפנדורף 0.6 מ"ל מספיקים
0.65 ומיקרו; m יחידות סינון צנטריפוגלי Ultrafree MC DVEMD MilliporeUFC30DV00
2 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה, 72 יחידותThermo Scientific69720
C18 חומר אריזה (5  ומיקרו; מ', 100 וארינג;)BrukerPM5/61100/000פריט זה אינו זמין עוד מ-Bruker. חומר אריזה חלופי עם המפרט המפורט יספיק
לחומר אריזה C18 (5  ומיקרו; מ', 200 וארינג;)BrukerPM5/61200/000פריט זה אינו זמין עוד מ-Bruker. חומר אריזה חלופי עם מפרט רשום יספיק
תמיסת פורמלדהיד ( תיוג איזוברי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ong, S. -E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  2. Koehler, C. J., Arntzen, M. Ø, de Souza, G. A., Thiede, B.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

cPILOTIsobaric TaggingDimethylation LabelingSample MultiplexingProteomics AnalysisTissue HomogenizationStrong Cation ExchangeMass SpectrometryAlzheimer Disease ModelBiological Replicates

Related Articles