תכונות מיקרוביאלית של מתכות כגון נחושת וכסף הוכרו במשך מאות שנים. פרוטוקול זה מתאר פעימה לייזר ablation בנוזלים, שיטה של סינתיזה חלקיקי מתכת המספק את היכולת לכוונן את המאפיינים של חלקיקים אלה כדי למטב את ההשפעות האנטי מיקרוביאלית שלהם.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תכונות מיקרוביאלית של מתכות כגון נחושת וכסף הוכרו במשך מאות שנים. פרוטוקול זה מתאר פעימה לייזר ablation בנוזלים, שיטה של סינתיזה חלקיקי מתכת המספק את היכולת לכוונן את המאפיינים של חלקיקים אלה כדי למטב את ההשפעות האנטי מיקרוביאלית שלהם.
הופעתה של חיידקים עמידים בפני ריבוי מחלות היא דאגה קלינית עולמית המוליכה חלק מהשערה על החזרתנו לעידן "טרום אנטיביוטיקה" של הרפואה. בנוסף למאמצים לזהות תרופות מולקולות קטנות מולקולות קטנות, יש כבר עניין רב בשימוש חלקיקי מתכת כמו ציפויים עבור מכשירים רפואיים, תחבושות הפצע, ואריזת הצרכן, בשל תכונות מיקרוביאלית שלהם. מגוון רחב של שיטות זמין עבור סינתזה nanoparticle תוצאות בספקטרום רחב של תכונות כימיות ופיזיות אשר יכול להשפיע על יעילות אנטיבקטריאלית. כתב יד זה מתאר את פעימה לייזר ablation בנוזל (PLAL) שיטה כדי ליצור חלקיקים. גישה זו מאפשרת כוונון עדין של גודל nanoparticle, הרכב, ויציבות באמצעות שיטות שלאחר הקרנה, כמו גם תוספת של פעילי שטח או הרחקות נפח. על ידי שליטה בגודל החלקיקים ואת הרכב, מגוון רחב של תכונות פיסיקליות וכימיות של nanopa מתכתRtics ניתן לחקור אשר עשויים לתרום יעילות מיקרוביאלית שלהם ובכך פותחים אפיקים חדשים לפיתוח אנטיבקטריאלי.
Nanoparticles (NPs) מוגדרים בדרך כלל כמו חלקיקים שיש להם לפחות ממד אחד כי הוא פחות מ -100 ננומטר אורך. שיטות כימית מסורתיות NP סינתזה בדרך כלל דורשים סוכני הפחתת מסוכנים, כגון borohydrides ו hydrazines. לעומת זאת, לייזר אבלציה של מטרות מתכת מוצק שקוע במדיום נוזלי (פולס לייזר ablation בנוזלים - PLAL) מספק נתיב ידידותי לסביבה עבור סינתזה NP אשר עונה על כל 12 של עקרונות הכימיה הירוקה 1 , 2 . ב PLAL, יעד מתכת שקוע הוא מוקרן על ידי פעימות לייזר חוזרים. כמו לייזר ablates את היעד, פלומה צפופה של אשכולות אדי אטומי הוא שוחרר לתוך המדיום הנוזלי שבו NPs במהירות coalesce. NPs המיוצרים על ידי PLAL הם מפוזרים היטב במדיום מימי ואת גודל, polydispersity, ואת ההרכב של NPs ניתן לשלוט בקלות על ידי שינוי נוזל אבלציה מימית כמו גם לייזרAmeters 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 .
מאפיינים Nanoparticle יכול להיות מכוון על ידי התאמת מספר פרמטרים לייזר, כולל: גל, גל, אורך הדופק (נסקרו בהתייחסות 7 ). פלואורס לייזר מחושב כאנרגיה הדופק חלקי שטח של נקודה לייזר על פני היעד. ההשפעות המדויקות של שטף על גודל polydispersity של NPs הם קצת שנויים במחלוקת. ככלל, הוכח כי במערכות לייזר פועלות "ארוכות" ו"מעטות " , יש משטרים נמוכים וגבוהים, המייצרים מגמות שליליות וחיוביות, בהתאמה , 8 , 9 , 10 , 11 . גודל NPOns ניתן למדוד אמפירי באמצעות טכניקות כגון פיזור אור דינמי ומיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM), כמתואר להלן.
הבחירה של אורך גל לייזר יכולה להשפיע על המנגנונים הפיזיים שבאמצעותם NPs נוצרים. באורכי גל קצרים יותר (אולטרה סגול), פוטונים באנרגיה גבוהה מסוגלים לשבור את הקשרים הבין-אטומיים 12 . מנגנון זה של אבלציה צילום הוא דוגמה של סינתזה NP מלמעלה למטה כי זה גורם לשחרור של קטעים קטנים במיוחד של חומר אשר נוטים לייצר דגימות polydisperse גדול יותר על מרווה בנוזל צולל 12 , 13 , 14 . לעומת זאת, אבלציה ליד אינפרא אדום (λ = 1,064 ננומטר) מניב מנגנון סינתזה מלמטה למעלה הנשלט על ידי אבלציה פלזמה 12 . ספיגת לייזר על ידי המטרה משחררת אלקטרונים מתנגשים עם, ולאחר מכן בחינם, אלקטרונים מחויב. כגOllisions להגדיל, החומר הוא מיונן, ובכך הצתה פלזמה. הנוזל שמסביב מגביל את הפלסמה, משפר את יציבותה ומגדיל עוד יותר את הקליטה. כמו פלזמה מתרחבת הוא הרווה על ידי נוזל החסימה, NP הם מרוכזים עם גיאומטריות שונות 4 , 12 , 15 .
הבחירה של משך הדופק לייזר יכול להשפיע עוד יותר על תהליך היווצרות NP. נפוץ לייזרים ארוכים פעמו, עם משכי הדופק יותר מאשר כמה picosonds, כוללים את כל מילי, מיקרו, ננו וכמה לייזרים פעמו picosond. במשטר רוחב הפולס הזה, משך הדופק של הלייזר ארוך יותר מהזמן של איזון הפלקטרון אלקטרונים, שהוא בדרך כלל בסדר גודל של כמה picoseconds 4 , 16 , 17 , 18 , 19. התוצאה היא דולף של אנרגיה לתוך המדיום אבלציה שמסביב היווצרות של NPs על ידי מנגנונים תרמיים כגון פליטת thermionic, אידוי, רותחים ונמס 1 , 20 .
הפעילות האנטיבקטריאלית של NPs מושפעת במידה רבה על ידי גודל החלקיקים 21 , 22 , 23 , 24 . כדי להגביר את הפחתת גודל monodispersity, NPs יכול להיות מוקרן בפעם השנייה באמצעות לייזר של אורך גל ליד התהודה פלסמון (SPR) של NP. קרינת לייזר האירוע נספג על ידי NP דרך עירור של SPR. פיצול של NP עשוי להתרחש באמצעות אויד תרמי 25 , 26 או קולומב פיצוץ 27 , 28 . צילום החידוש מעלההוא הטמפרטורה של NP מעל נקודת ההיתוך, וכתוצאה מכך שפיכת השכבה החיצונית של החלקיקים. הוכח כי הוספת סוכנים כגון polyvinylpyrrolidone (PVP) או נתרן dodecyl סולפט (SDS) לפתרון יכול מאוד לשפר את ההשפעות שלאחר קרינה 5 . ההשפעה של תוספת של מומסים שונים תוארו במספר דוחות 1 , 4 , 6 . הקלות של מניפולציה של המאפיינים NP ידי PLAL מעניקה שיטה חדשה לפתח מיקרוביאלית חדש NP מבוססי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
1. מיקוד לייזר Nanosecond ו מדידת Fluence
2. סינתזה של חלקיקי כסף על ידי פעימה לייזר ablation ב נוזלי
3. אפיון חלקיקי מתכת

4. לאחר הקרנה
5. מדידת תכונות אנטיבקטריאליות של חלקיקים
הערה: הרעילות של NPs כסף נגד שני חיובי גראם ( Bacillus subtilis ) ו- Gram שלילית ( Escherichia coli ) נבדק 31 . השיטה מותאמת בקלות לכל מינים; אולם המינון היעיל של חלקיקים עשוי להשתנות במידה ניכרת ויש לקבוע באופן אמפירי. כאן, E. coli משמש כמערכת מודל לתיאור של השיטה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
באמצעות מטרות כסף, פרמטרים לייזר המתואר לעיל, ו 60 מ"מ SDS ב נוזל אבלציה, NPs כסף נוצרים עם ספיגה אופיינית UV- VIS ב SPR ( איור 2 א ). מדידות TEM ו- DLS חושפות קוטר NP ממוצע של כ 25 ננומטר לפני שלאחר הקרנה ( איור 2 ב ). אבלציה של היעד כסף במשך 30 דקות בדרך כלל התשואות ריכוז NP של 200 מיקרוגרם / מ"ל. בהערכת רעילות אנטי מיקרוביאלית של NPs כסף, 15 מיקרוגרם / מ"ל מעכב מאוד צמי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
השפעות אנטי מיקרוביאליות חוזרות של NP דורשות ייצור עקבי של NPs בגדלים וריכוזים דומים. לכן, זה קריטי כדי לתקנן פרמטרים לייזר כולל גל, גל, אורך הדופק. בעוד פיזור אור דינמי היא שיטה קלה ומהירה להערכת גודל NP, כימות מדויק של התפלגות גודל דורש מדידה ישירה על ידי TEM. כמו כל קרן לייזר יש מאפיינים שונים במונחים של פרופיל מצב סטייה, זה קריטי להעסיק תהליך אמפירי להניב את הרצף אופטימלי וגובה נוזלי מעל המטרה. מאז הגודל של חלקיקים יכול להיות מותאם על ידי שלאחר הקרנה, את היעילות של ייצור החלקי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
למחברים אין מה לחשוף.
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (NSF פרסים CMMI-0922946 ל- DB, CMMI-1300920 ל- DB ו- S.O'M., ו- CMMI-1531789 ל- S.O'm, DB ו- EAK) בוש מענק מחקר ביו-רפואי ל- EAK ו- S.O'M.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Nanosecond Nd:YAG לייזר | Ekspla | NL303 | |
| שלב סריקת xy ממונע | Standa | 8MTF | |
| UV-VIS ספקטרופוטומטר | Agilent | Cary 60 | |
| יחידת פיזור אור דינמית | Malvern | Zetasizer ZS 90 | |
| Microbalance | Maktek | TM 400 | |
| מיקרוסקופ אלקטרונים שידור | Zeiss | EM 902 | |
| יעד רדיד כסף | אלפא Aesar | 12127 | |
| עדשת אורך מוקד 250 מ"מ | אופטיקה אדמונד | 69-624 | |
| רשתות TEM נחושת | Pacific Grid-Tech | Cu-400LD | רשת מצופה תחרה/סרט דק |
| E. coli MG1655 | ATCC | 47076 | |
| Bacto טריפטון | BD Biosciences | ||
| 211705 תמצית שמרים | BD Biosciences | 212750 | |
| נתרן כלורי | פישר סיינטיפיק | BP3581 | |
| בקטו אגר | BD Biosciences | 214010 | |
| נתרן דודציל סולפט | פישר סיינטיפיק | BP166-100 | |
| פוליוויניל פירולידון | פישר סיינטיפיק | BP431-100 | |
| דיסק נירוסטה (לשלב אבלציה) | Metal Remnants, Inc. | N / A | קוטר 1.5 אינץ', 16 מד |
| Fisher Scientific | 02-540G | ||
| מוט ערבוב מגנטי | Fisher Scientific | 14-513-57 | |
| צלחת ערבוב מגנטית | Fisher Scientific | 11-100-49SH | |
| מד אנרגיה וכוח לייזר | קוהרנטי | 1098579 | |
| קלטת פחמן | שינטו Chemitron Co. Ltd. | קלטת STR אמבט | |
| מים סוניקט | ברנסון | 1510 | |
| מדחס אוויר | GMC | Syclone 3010 | לייבוש יעד אבלציה |
| עדשת אורך מוקד 75 מ"מ עדשת | אופטיקה אדמונד | 34-096 | עדשת מיקוד לאחר הקרנה |
| קובט קוורץ | תאים מדויקים בע"מ | 21UV40 | נתיב אור 50 מ"מ (לאחר הקרנה) |
| Kanamycin | פישר סיינטיפיק | BP906-5 | |
| מיקרוסקופ אור | Nikon | 50i | מיקרוסקופ זה משמש למיקוד הלייזר בשלב האבלציה. הדגם הספציפי הזה כבר לא זמין, אבל כל מיקרוסקופ אור עם מטרה של 4X יעבוד. |
| מצלמת CCD | AmScope | MT5000-CCD | |
| מיקרומטר שקופית | טד פלה | 2280-70 |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.