מאמר שיטה

באמצעות חיישנים ביולוגיים מבוססי Enzyme למדוד טוניק ו phasic גלוטמט בעכברי מודל אלצהיימר

DOI:

10.3791/55418

⸱

3 במאי 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychology, West Virginia University, 2Department of Drug Discovery & Development, Auburn University, 3Department of Neuroscience, University of Kentucky Medical Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים את ההתקנה, תוכנת ניווט, וניתוח נתונים עבור שיטה מרחבית מדויקת ובזמן של מדידת טוניק ושינויי גלוטמט תאי פאזית in vivo באמצעות מערכי microelectrode enzyme-linked (MEA).

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיבוש עצבי הוא לעתים קרובות מרכיב מרכזי של מחלות של מערכת העצבים המרכזית (CNS), משחק תפקיד פתולוגיה שבבסיס מחלת אלצהיימר, פרקינסון, דיכאון, וחרדה. באופן מסורתי, microdialysis כבר את הטכניקה הנפוצה ביותר (שיבח) כדי לבחון שינויים הנוירוטרנסמיטר המתרחשים הפרעות אלה. אבל בגלל microdialysis יש את היכולת למדוד איטיים 1-20 שינויים דקים על פני שטחים גדולים של רקמה, יש לו את החסרון של הפולשנות, פוטנציאל להרוס חיבור מהותי בתוך המוח יכולת דגימה איטית. טכניקה חדשה יחסית, מערך microelectrode (MEA), יש יתרונות רבים למדידת שינויים הנוירוטרנסמיטר ספציפיים בתוך אזורים במוח הבדידים כפי שהם מתרחשים, מה שהופך את גישה מדויקת במרחב ובזמן. בנוסף, באמצעות MEAs היא פולשנית, המאפשרת מדידה של שינויים הנוירוטרנסמיטר in vivo. במעבדה שלנו, אנו חהכבר יש מתעניינים במיוחד לשינויים הנוירוטרנסמיטר גלוטמט, הקשורים לפתולוגיה מחלת האלצהיימר. ככזה, השיטה המתוארת כאן נעשה שימוש כדי להעריך שיבושים בהיפוקמפוס פוטנציאליים גלוטמט במודל של עכברים טרנסגניים של מחלת אלצהיימר. בקצרה, השיטה נהוגה כרוך ציפוי microelectrode רב באתר עם אנזים מאוד סלקטיבית של הנוירוטרנסמיטר עניין בשימוש באתרים המתייחסים לעצמו להפחית את רעשי רקע ואת interferents. לאחר ציפוי וכיול, את MEA ניתן לבנות עם micropipette והוריד לתוך אזור במוח של עניין באמצעות מכשיר stereotaxic. כאן, השיטה המתוארת כרוך בהרדמת RTG (TauP301L) 4510 עכברים באמצעות מכשיר stereotaxic כדי למקד תת אזורים (DG, CA1, ו CA3) של ההיפוקמפוס.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מדידת שינויים הנוירוטרנסמיטר במוח הוא כלי חיוני עבור מדעני מוח לומדים מחלות של מערכת העצבים המרכזית (CNS) כי מאופיינות לעתים קרובות הנוירוטרנסמיטר חוסר ויסות. למרות microdialysis בשילוב עם כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC / EC) הייתה השיטה הנפוצה ביותר למדוד שינויים ברמות הנוירוטרנסמיטר תאיים 1, 2, 3, 4, ברזולוציה במרחב ובזמן של בדיקות microdialysis לא יכול להיות אידיאלי עבור נוירוטרנסמיטורים , כגון גלוטמט, כי מוסדר בחוזקה בחלל 5 התאים, 6. בגלל ההתקדמות בגנטיקה ודימות, ישנן שיטות נוספות שיכולות לשמש למיפוי גלוטמט in vivo. באמצעות כתבי ניאון גלוטמט מקודדים גנטיים (iGluSnFR) עלד הדמיה שני פוטונים, החוקרים מסוגלים לדמיין שחרור גלוטמט על ידי נוירונים האסטרוציטים הן במבחנה in vivo 7, 8, 9. יש לציין, זה מאפשר הקלטה משדה גדול יותר של נוף ואינו לשבש את החיבור המהותי של המוח. בעוד שיטות האופטיות החדשות אלה מאפשרות להדמיה של קינטיקה גלוטמט ומדידה של תגובות חושיות ומתחזקות פעילות עצבית, הם חסרים את היכולת לכמת את כמות הגלוטמט שטח תאי מוח באזורים דיסקרטיים.

שיטה חלופית היא מערך microelectrode enzyme-linked (MEA) שיכול למדוד באופן סלקטיבי רמות הנוירוטרנסמיטר תאיות, כגון גלוטמט, באמצעות ערכת הקלטה בהפניה עצמית. טכניקת MEA נוצלה בעבר ללמוד שינויי גלוטמט התאים הבאים מוחי טראומטיפציעה 10, 11, 12, הזדקנות 13, 14, מתח 15, 16, אפילפסיה 17, 18, 19 מחלת אלצהיימר, 20, ו הזרקה של 21 ויראלי לחקות ומייצג שיפור לעומת מגבלות המרחב והזמן הגלום microdialysis. בעוד microdialysis מגביל את היכולת למדוד בקרבת הסינפסות 22, 23, יש MEAs רזולוציה מרחבית גבוהה המאפשרת אמצעים סלקטיבית של זליגת גלוטמט תאי ליד הסינפסות 24, 25. שנית, ההחלטה הזמנית הנמוכה של microdialysis (1 - דק 20) מגבילה את היכולת לחקור אתדינמיקה מהירה של שחרור גלוטמט וסילוק המתרחשת האלפית השני כדי הטווח שני 26. בגלל הבדלי השחרור או השחרור של גלוטמט לא יכולים להיות ברורים במדדים של טוניק, נחים רמות גלוטמט, זה עשוי להיות חיוני כי שחרור גלוטמט וסילוק להימדד ישירות. MEAs לאפשר אמצעים כאלה עקב הרזולוציה הגבוהה הזמנית שלהם (2 הרץ) ומגבלות נמוכות של זיהוי (<1 מיקרומטר). שלישית, MEAs מאפשרים לבחון וריאציות תת-ב נוירוטרנסמיטורים בתוך אזור במוח מסוים, כגון בהיפוקמפוס חולדה או עכבר. לדוגמא, באמצעות MEAs אנחנו בנפרד יכולים למקד gyrus המשוננת (DG), קורנו ammonis 3 (CA3) ו קורנו ammonis 1 (CA1) של ההיפוקמפוס, אשר מחוברים באמצעות במעגל trisynaptic 27, לבחון הבדלים תת-ב גלוטמט התאי. בשל גודלו של בדיקות microdialysis (1 - 4 מ"מ אורך) ואת הנזק שנגרם על ידי השתלת 28 </ sup>, 29, הבדלים תת-קשים להתמודד. יתר על כן, המערכות האופטיות רק מאפשרות גירוי באמצעות גירויים חיצוניים, כגון גירוי שפם או הבהוב אור, אשר אינו מאפשר תת-גירוי 7. יתרון סופי של MEAs פני שיטות אחרות הוא היכולת ללמוד אזורי משנה אלה in vivo מבלי לשבש הקשרים החיצוניים ו פנימיים שלהם.

כאן, אנו מתארים כיצד מערכת הקלטה (למשל, FAST16mkIII) בשילוב עם MEAs, מורכב microelectrode ריבוי אתרי קרמיקה מבוססת, יכולה להיות מצופית באופן דיפרנציאלי על אתרי הקלטה כדי לאפשר להתערב סוכנים כדי להיות גילוי והסרה מן האות אנליטי. אנחנו גם להדגים ניתן להשתמש במערכים אלה ללימודי מבוססי amperometry של רגולציה גלוטמט in vivo בתוך DG, CA3, ואת אזורי המשנה בהיפוקמפוס CA1 של RTG הרדים (TauP301L) 4510 עכברים, מ נפוץמודל יד הבית של מחלת אלצהיימר. בנוסף, אנו מספקים אישור של רגישות מערכת MEA לדינמיקה המהירה של שחרור גלוטמט וסילוק ידי טיפול בעכברים עם riluzole, תרופה לראות במבחנה כדי להקטין שחרור גלוטמט ולהגדיל ספיגת גלוטמט 30, 31, 32, 33, והוכחת השינויים האלה בהתאמה in vivo במודל עכבר TauP301L.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ציפוי מערך microelectrode עם אנזימים או Layer מטריקס

  1. הכנת פתרון מטריקס חלבון
    1. תשקלי 10 מ"ג אלבומין בסרום שור (BSA) ולהעביר את הצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
    2. הוספת 985 μL של מי DI אל הצינור המכיל microcentrifuge BSA. מערבבים את הפתרון על ידי תסיסה ידנית (re-בפיפטה באמצעות 1000 פיפטה μL ~ 3 פעמים, עד BSA הוא נמס).
      הערה: אין להשתמש מערבולת לערבב הפתרון מכיוון שהדבר עלול להציג אוויר לתוך התמיסה. כמו כן, להגדיר את פיפטה בנפח <1000 μL (למשל 700 μL) כדי למנוע החדרת בועות אוויר. הפתרון עשוי להיות ממוקם ב microcentrifuge במידת הצורך.
    3. לאחר פתרון BSA הוא נמס, מוסיפים 5 μL של פתרון glutaraldehyde 25%. מערבב את הפתרון על ידי צינור ההיפוך הסגור 3 - 5 פעמים. הפתרון שהתקבל הוא BSA 1% עם glutaraldehyde 0.125%.
    4. הקדש את solu מטריקס חלבוןtion עבור 5 דקות. הפתרון יופיע צהוב בהיר.
  2. הכנת פתרון האנזים הרצוי (למשל, מונואמין גלוטמט)
    1. הכן את פתרון מונואמין גלוטמט על ידי הוספת מים DI מסונן אל lyophilized, אנזים מטוהרים (למשל, 50 מים μL DI הוסיף 25 יחידות של מונואמין גלוטמט להניב 0.5 U / μL).
      הערה: פתרון המניות Aliquot (למשל, 1 μL) ולאחסן את aliquots במיכלים בגודל מתאים (למשל, 500 צינורות μL microcentrifuge) ב -20 מעלות צלזיוס. Aliquots ניתן לאחסן עד 6 חודשים בתנאים אלה.
    2. להוסיף 4 μL של פתרון BSA / glutaraldehyde אל הצינור aliquoted microcentrifuge המכיל מונואמין גלוטמט. מערבבים את הפתרון על ידי תסיסה ידנית (re-בפיפטה עם טפטפת 10 μL. פיפטה יש להגדיר נפח <5 μL). הפתרון שהתקבל הוא BSA 1%, glutaraldehyde 0.125% ו 0.1 מונואמין גלוטמט U / μL.השתמש פתרון לציפוי מיד.
      הערה: פתרון הציפוי מונואמין גלוטמט ניתן להשתמש רק בתוך 15 דקות. למרות מספר MEAs ניתן מצופה פתרון אחד מוכן, מומלץ שלא יעלה חלון זמן שמיש עבור מונואמין גלוטמט. מספר האלקטרודות שניתן מצופה בתוך 15 דקות להשתנות. באופן כללי, 4 עד 6 אלקטרודות יכולים להיות מצופים בכל פעם.
  3. ציפוי MEA
    1. בדרך כלל, מעיל וזוג האתר הקלטה (ים) על MEA עם האנזים הרצוי (מונואמין גלוטמט) וזוג שונים של האתר הקלטה (ים) ( "סנטינל" באתר (ים)) מצופה עם חלבון-מטריצה ​​פעילה.
    2. השתמשו microsyringes המילטון-קצה קהה (למשל 10 μL) כדי MEAs מעיל עם מונואמין L-גלוטמט או פתרון מטריקס חלבון פעיל (BSA + glutaraldehyde). הנהלים המשמשים ציפויי החלבון-מטריקס אנזים או לא פעילים זהים.
    3. נקו את המזרקים לפני ואחרי השימוש (3 שטיפות עםמי DI, 3 שטיפות עם מתנול, 5 שטיפות עם מי DI).
      הערה: מזרקים מוקדש משמשים להחלת מעילים של אנזים (מונואמין גלוטמט) או-מטריקס חלבון. אין להשתמש באותו מזרק לפתרון אחר. מומלץ לבצע ציפוי החלבון-מטריקס לפני ציפויי אנזים.
    4. צייר את מונואמין גלוטמט או מטריצת החלבון באמצעות 10 מזרק μL המילטון. לחץ בעדינות את הבוכנה לוותר חרוז קטן של פתרון בקצה המזרק (דמיינו באמצעות מיקרוסקופ לנתח).
    5. באמצעות מיקרוסקופ לנתח יכול למקד לאתרי הקלטת MEA, להחיל הפתרון באתרי ההקלטה המתאימים באמצעות פנייה באתרי ההקלטה בקצרה עם פתרון האגל / חרוז, מייצג שכבה אחת. שלוש שכבות מספיקות עבור שני-מטריקס חלבון ואת מעייל האנזים. שכבות עבות יכולות להפחית את הרגישות של MEA.
    6. הרם את אגל הפתרון ישר מעלה את אתרי הקלטות (כלומר syrinGE טיפ אסור לגרד פני השטח MEA).
    7. הגדרת טיימר עבור 1 דקות. זוהי הדרישה במינימום הזמן בין יישומי ציפוי לאתר ההקלטה (ים). אפשר MEAs מצופה אנזים לרפא על 4 מעלות צלזיוס למשך 5-7 ימים.
    8. רשום את מספר מעילים מיושם, כמה זמן לקח כדי להחיל את ציפוי, מספר אלקטרודה, ואת שם ותאריך במחברת המעבדה.

גלוון 2. עם m-phenylenediamine הסלקטיביות משופר

  1. Dihydrochloride מ-phenylenediamine הכנה (MPD) פתרון
    הערה: פלייט שכבת הדרה, MPD, כדי למנוע חמצון של דופמין ומולקולות גדולות, interferent אחרים (למשל, חומצה אסקורבית), ובכך לשפר את הסלקטיביות של חיישן עבור גלוטמט / H 2 O 2 מעל מולקולות בפוטנציה-interferent אחרים.
    1. מדדו 50 מ"ל של 0.05 בופר פוספט M (PBS) בתוך בקבוק מדידה ולהעביר 50 מ"ל של 0.05M PBS על גדול יותר (150 מ"ל) בקבוק Erlenmeyer.
    2. שימוש בצינור מחובר למכל חנקן (למשל, באמצעות הצינורות חבר מפליט לחץ), לצרף קצה פיפטה (טיפ P200 למשל) עד הסוף הפתוח של הצינור. מניחים את צינורות עם קצה פיפטה מצורף פתרון PBS ולכסות הפתרון רופף עם parafilm. הפעל פתרון בועת חנקן בעדינות במשך 20 דקות.
    3. לשקול 0.045 גרם של MPD.
      זהירות: MPD הוא חומר קרצינוגני פוטנציאלית. שקילה של MPD צריכה להתבצע באמצעות סולם בתוך במנדף. יש להשתמש בכפפות ומסכה בעת שימוש MPD. ודא למכסת המנוע הוא פונקציונלי כי האבנט הוא משך אל רמת העבודה ההולמת. מיד משטחים נקיים שייתכן מזוהמים עם MPD כדי למנוע הכתמה קבע.
    4. לאחר מבעבע, להעביר את כל ה MPD לפתרון PBS-בגז דה. מכסים את פתיחת הבקבוק עם parafilm פתרון מערבולת בעדינות כדי לפזר MPD בתמיסה. הימנע aggressivדואר ערבוב או שימוש מערבולת מכיוון שהדבר עלול להציג גזים לתוך התמיסה.
    5. העבר הפתרון מבחנה 50 מ"ל. בר ומערבב אינו הכרחי.
  2. Electroplating האלקטרודה
    1. השג אלקטרודת הייחוס. השתמש אלקטרודות התייחסות מוקדשות MPD ציפוי בלבד. השתמש אלקטרודה התייחסות שונה עבור פרוצדורות כיול.
    2. מקם את זרוע הפלסטיק של בעל אלקטרודה הפניה מעל הכוס. בדקו בועות אוויר אלקטרודת זכוכית ההפניה (ייתכן שלא תוכל לראות). בעדינות קפיצית בקצה הדיסטלי של האלקטרודה ההתייחסות להסיר בועות אוויר בקצה.
    3. מניחים את האלקטרודה הפניה דרך הפתח בזרוע פלסטיק נמוך לתוך מבחנה המכילה PBS. ודא כי האלקטרודה התייחסות לא לפנות בתחתית הכוס.
    4. חבר את האלקטרודה התייחסות headstage (למשל 2 PA / mV) ולחבר (מחבר DIP למשל) MEA להיות צלחת MPDד אל headstage.
    5. מנמיכים את MEA לתוך התמיסה בכוס כזה רק כי קצה MEA הוא שקוע בפתרון. אין להטביע את טיפי MEA בנוזל מעבר "הבועה" השחורה (הבידוד השחור הממוקם מעל קצה MEA). פעולה זו עלולה לגרום נזק MEA.
    6. הפעל כיול "מבחן" כדי לאמת את הפונקציונליות של ערוצי אלקטרודה וחיבור אל headstage.
      הערה: למרות שהגדרות חומרה צריכות לשקף את הציוד בשימוש, פרטים הקשורים אנליטי / interferent סוג ואת הריכוז לא צריך להזין את הכיול "המבחן". מצב recoding צריך להיות "amperometry" ואת "V-מוחל" צריך להיות -0.7 V. אמת הקלטה אופיינית לכל הערוצים.
    7. לבטל על ידי בחירת "ביטול" כאשר קישוריות של כל האתרים הקלטה מאומתת. אין צורך לשמור את נתוני הכיול.
    8. בחר בסמל "גלוון" על שולחן העבודה. 'אל גלווןתפריט ol יופיע. בדוק את ההגדרות הנכונות מוזנות:
      משרעת PP: 0.25
      אופסט: -0.5
      תדירות: 0.05
      משך (דקות): 20
    9. בחר בלחצן "השהה" כדי להתחיל ציפוי. השדה הזמן שחלף צריך להתחיל לספור לאחור.
    10. בסיום (כל הזמן שחלף), בחר "אחר MEA" בתפריט הצץ להתחיל MPD ציפוי MEA נוסף. החלף את MEA מצופה עם MEA להיות מצופה MPD לחזור על התהליך אלקטרוליטי שימוש באפשרות אלקטרוליטי.
      הערה: מומלץ להשתמש בפתרון MPD מוכן לא יותר מ 2 פעמים או בתוך פרק 1 h זמן. כן פתרון חדש כדי להכין יותר מ 2 MEAs.
    11. בחר "תוכנת יציאה" כדי לסיים אלקטרוליטי. לשטוף טיפי אלקטרודה מצופה MPD עם מים די (כדי למנוע שאריות מלח) וחנות (24 ח) לפני הכיול.
    12. הסר את האלקטרודה ההתייחסות מהפתרון ולשטוף במי DI לפני הצבת לתוך הים המתאיםפתרון torage (למשל 3 M NaCl). ודא קצה האלקטרודה הפניה הוא שקוע בפתרון. לאט אלקטרודה הפנית זכוכית נמוכה לתוך הפתרון כדי למנוע פגיעה בזכוכית.
    13. השלך את הפתרון MPD במיכל פסולת מסוכנת שכותרתו כראוי.

3. כיול MEA עבור איתור גלוטמט סלקטיביות (איור 1) 21

  1. הכנת הפתרונות הדרושים כיול.
    הערה: עיין בטבלה 1.
  2. בצע כיול תחת בחישה מתמדת (סוללה מגנטית מופעלת בוחשת) בשעה 37 ° C. הפעל את כרית חימום או במחזור אמבט מים להשיג בר ומערבבים קטן. מערבבים לאט אבל מהר מספיק שכאשר תוספת נעשית (להלן), הרמה החדשה הגיעה במהירות.
  3. חברו את headstage (2 PA / mV) למערכת ההקלטה שליטה והכנס את קצה MEA לתוך 40 מ"ל של עורר 0.05 M PBS (להשתמש בכוס 50 מ"ל).
  4. חברו את rאלקטרודה eference. פליק בסוף כדי להבטיח שאין בועות אוויר.
  5. פתח את התוכנית להקלטה ולחץ על "כיול". ודא שההגדרות נכונות (לבדוק באתרי סנטינל שנבחרים כמו זה עשוי להשתנות עם אלקטרודות שונות), לבחור מספר MEA ולחץ על "התחל".
  6. אפשר 5 - 10 דקות עבור איזון; מתחילים פעם הבסיס התייצב (<0.004 נה / שינוי דק ').
  7. בחר "Baseline" ולהוסיף 500 μL של 20 חומצה אסקורבית מ"מ (interferent; הסופי [250 מיקרומטר]) ובחר "Interferent" (AA נחשב interferent המוח כולו) ברגע הנוכחי הגיע לרמה חדשה, יציבה, אם כל. אפשר 0.5 - 1 דקות בין תוספות. אם MEA הוא electroplated כראוי, כמעט ללא שינוי יש לשים לב.
  8. להוסיף 40 μL של 20 מ"מ L- גלוטמט ([מיקרומטר 20] הסופי) ופעם הנוכחי הגיע לרמה חדשה, יציבה, בנוסף סימן 1 st "אנליטי". חזור שלוש פעמים עבור סכום כולל של 3 glutamatתוספות דואר.
  9. להוסיף 40 μL DA. אל תבחר "אנליטי"; בחר "חומר מבחן" - DA אולי רק להיות interferent באזורים המכילים DA.
  10. להוסיף 40 μL פראוקסיד. אל תבחר "אנליטי"; בחר "חומר מבחן".
  11. לחץ על כפתור "עצור" ברגע כיול נגמר.
  12. כדי לקבוע את הפונקציונליות של MEA, לחץ על כרטיסיית החישוב ולהקליט את הפרמטרים הבאים במחברת מעבדה.
    1. עבור עיצוב MEA (3000 מיקרומטר 2) המשמשים כיולים אלה, להשתמש MEA עם שיפוע ≥ 0.004 נה / מיקרומטר אך המדרונות הנמוכים יכול לשמש בניסויים מסוימים. אם יש פחות הבדל 10% ב המדרון שבין מצופה אנזים ואתרי ללא ציפוי, ולאחר מכן להשתמש MEAs אלה לשחרור עורר בלבד או נקי / לבטל את MEA.
    2. השתמש גבול הגילוי (לוד) ≤ 1.5 מיקרומטר. אם לוד עולה 1.5 מיקרומטר, ולאחר מכן להשתמש MEAs אלה releas עוררדואר ספיג בלבד. אין להשתמש באלקטרודות אלה להקלטת רמות טוניק.
    3. השתמש סלקטיביות עבור אנליטי הרצוי (כלומר, גלוטמט) מעל interferent של> 20 יחידות שרירותיות. אם סלקטיביות היא פחות מ 20, אז נקי / לבטל את MEA.
    4. השתמש ליניאריות (R 2) של עקומת כיול של ≥ 0.90. אם הליניאריות פחות מ 0.90, אז נקיים או להשליך MEA.
  13. שמור את הקובץ עם # של MEA, תאריך, וראשי התיבות של כיול האדם.

4. להרכיב את micropipette

הערה: Micropipettes (זכוכית נימים) צריך עצה עם קוטר פנימי של 10 - 15 מיקרומטר.

  1. מניחים את micropipette מרכזי בקרב כל האתרים הקלטה ארבעה פלטינה הר 50-100 מיקרומטר מעל MEA באמצעות שעווה דביקה חמר.
  2. כדי לטעון את micropipette, להשתמש במזרק 1 מ"ל מלאים גלוטמט או פתרון KCl, A filte מזרק סטרילי 0.22 מיקרומטרr, ואת ארוך 97 מ"מ, 28-מד מילוי פיפטה, רשאים למלא את micropipette. כלומר, להכניס את המחט בראש של micropipette ולמלא בתחתית של micropipette (סוף לכיוון MEA), מוודא שאין בועות.
  3. צרף את micropipette למערכת ולהוציא לחץ על 2 - 20 psi במשך כ 1 ים.

5. פלייט האלקטרודה התייחסות מיניאטורי in vivo השתמש

  1. הכן את פתרון ציפוי (50 גרם NaCl / 90 מ"ל 1 M HCl בכוס מ"ל 100 (אמבטיה ציפוי)) וחותכים האלקטרודה אמבטיה (~ 10 ס"מ אורך של פלטינה (Pt) חוט (~ 0.02" קוטר)).
  2. חותכים 10 - 15 ס"מ חתיכה ארוכה של חוט כסף מצופה טפלון (0.008" חשוף) ולהשתמש בסכין גילוח כדי לגרד ~ 1 ס"מ של ציפוי טפלון מקצה אחד של סוף חוט כסף.
  3. הלחמת סיכת זהב על קצה אחד ומקום קצה אחד של חוט כסף חשוף לאמבטית הציפוי.
  4. שימוש במתאם DC (להשתמש במתאם DC רק בעל תפוקה של ~ 9 -. 15 VDC מקסימום),מהדק את החוט "אדום" (+) אל חוטי כסף מוכן (אלקטרודה הפניה) בצד סיכת זהב. הצמד את "שחור" (-) תיל אל הקתודה אמבטיה Pt.
  5. חברו את מתאם DC. חפש את תהליך הציפוי הנכון - בועות אמורות להופיע בבית אלקטרודה האמבטיה; אלקטרודת ייחוס הופכת צבע כסוף / אפור.
    זהירות: אל תפעיל את המוביל [שחור (-) לעומת האדום (+)] - ציפוי אמבטיה ייהרס אם זו מתרחשת פתרון ציפוי טרי יצטרך להתבצע. פתרון רע יהפוך בצבע צהוב: אין להשתמש!
    הערה: התגובה ציפוי לוקח 2-5 דקות בדרך כלל: Ag 0 + Cl - → AgCl + e -
  6. בדוק את אלקטרודת הייחוס.
    1. גדר מודד את 100 - הגדרת 200 mV DC.
    2. מניחים אמת מידה (כלומר, אלקטרודה נבדק בעבר ידוע שזה עובד) אלקטרודה התייחסות 3 M NaCl ולבדוק כנגד אלקטרודת הייחוס מצופה החדש.
      הערה: אם לנוing אלקטרודה התייחסות חדשה, יש להשרות 3 M NaCl לפני השימוש (12 h מומלץ).
    3. מניחים את ההובלה "אדום" (+) על סיכת זהב של האלקטרודה הפניה להיבדק. מניחים את "שחור" - להוביל על אלקטרודה benchmark (). מגוון הודעה מקובל הוא ± 10 mV. 0 mV הוא אידיאלי על פני 2 אלקטרודות התייחסות.

6. כירורגיה בעלי חיים כללי להקלטות MEA

  1. הכנה לניתוח
    1. מניחים כלים לניתוח בחומר חיטוי אמש.
    2. הסר את הכלים מן החיטוי ולשטוף ביסודיות למקם את הכלים על משטח ניתוח סטרילי. קבל כרית חימום.
    3. כייל שתי אלקטרודות ולצרף את micropipette כמתואר נהלים 3 ו 4.
    4. הפוך את האלקטרודה התייחסות כמפורט בסעיף 5.
    5. הפוך 200 גלוטמט מיקרומטר ו 70 מ"מ KCl. עיין בטבלה 1.
    6. השג את החיה ולהקליט את משקלו על גיליונות הניתוח.
    7. הכן את ההרדמה ולהדליק את כרית החימום.
  2. בצע ניתוח MEA
    1. באמצעות isoflurane (זרימת 4% חמצן), להרדים את החיה בתא אינדוקציה עד קצב הנשימה ירד באופן משמעותי ובעל החיים אינו מגיב הבוהן או קמצוץ הזנב. קצב נשימת שיא ואת טמפרטורת גוף בכל 15 דקות.
    2. מניחים את החיה המכשיר stereotaxic באמצעות מוטות אוזן לייצב את הראש. ודא החיה מאובטחת הראש לא זז. מנמיכים את זרימת isoflurane ל -1.5 - 3% חמצן. ודא כי כרית החימום ממוקמת כראוי תחת בעלי החיים מוגדרים 37 ° C כדי לספק חום משלימה. אי אספקת חום משלימה עלול לגרום היפותרמיה עמוקה ומוות בטרם עת של החיה.
    3. החל משחת עין באמצעות מטוש צמר גפן סטרילי ולהקליט את קצב הנשימהטמפרטורת הגוף. באמצעות גוזם מופעל באמצעות סוללה נטענת, לגלח את החלק העליון של הראש. השתמש מספרי כירורגיות הקטנים כדי להסיר את הפרווה ליד האוזניים.
    4. בשלב זה, לשים על כפפות ניתוחים סטרילי. החל יוד ואז אלכוהול (שלוש פעמים) לקרקפת.
    5. באמצעות אזמל, עושה חתך ישר למטה באמצע הקרקפת ולהפיץ את העור באמצעות מלחציים כלב שור. קח טיפ כותנת סטרילי כדי לספוג את כל דם. להשתמש במי חמצן כדי להקל על המראה של גבחת ו למבדה.
    6. בדוק כי הראש ממוקם כראוי על ידי מדידת D / V ו קואורדינטות M / L של גבחת ו למבדה. שינויים לתאם צריכים להיות אפס אם הראש נמצא על מישור שטוח. התאם את סורגי ראש האוזן ככל שיידרש כדי להבטיח מטוס שטוח.
    7. מצא גבחת, ואפס את הקואורדינטות. באמצעות הקואורדינטות הרצויות, נע שמאלה וימינה ולעשות סימן באמצעות סמן קבע. באמצעות cauterizer / סמן, ליצור ריבוע גדול סביב סימן עם מספיק מקום כדי להגיעהאזור הרצוי.
    8. באמצעות כלי סיבובי סטרילי, לקדוח סביב הסימן המרובע. לספוג כל דם באמצעות מטוש צמר גפן סטרילי. ביסודיות ולחטא את המקדח לפני כל שימוש.
    9. צרף את MEA אל headstage ו רשאים למלא את פיפטה עם הפתרון הרצוי הראשון. הקפד להשאיר פער פיפטה בלי פתרון כל כך שהפתרון שגורש יכול להיבחן. צרף את הצינורות אל micropipette הזכוכית.
    10. הפעילו את הטנק חנקן ואת מפליט הלחץ (psi = 5, זמן = 0.6 s). מבחן (כפתור אדום ידני עיתונות) כדי להבטיח את פיפטה לא סתום לפני התחילה.
    11. כייל את micropipette. התחל 0 על reticle ומקום חתיכת סרט כחול על headstage כדי לציין את נקודת ההתחלה. הפעל את הקורא הדיגיטלי ולאפס את זה לאפס. רד 1 מ"מ (DV) ולספור את מספר קרציות הפתרון עבר על reticle. 10 קרציות צריכים להיות שווים 1 מ"מ (1 מ"מ = 250 NL), כך 1 tick = 25 NL.
    12. מניחים את האלקטרודה הפניה בתוךבמיקום מרוחק מן MEA כאלה שזה עדיין בקשר נוזלי עם המוח כדי להשלים את המעגל.
    13. מצא גבחת עם MEA מצורף אפס הקורא הדיגיטלי. הזז את MEA לקואורדינטות הרצויות. לאט לאט להוריד את MEA עד הקצה נוגע המוח. אפס את DV לתאם לאט לאט להוריד את MEA לתוך המוח.
    14. על תכנית ההקלטה, לחץ על האלקטרודה המכויל הרצוי ולאחר מכן לחץ על "בצע ניסוי." לאחר מכן, המערכת תתחיל להקליט רמות טוניק עבור אנליטי של עניין בעוד החיה הוא מורדם.
    15. זום לצייר שיסייעו בשמירת בסיס ולאפשר האלקטרודה אל בסיס עבור 20 - דקות 45.
    16. אחרי הבסיס הוא יציב, להגדיר את מפליט לחץ כדי 0.6 s ו- 5 psi ולחץ על הכפתור האדום על מפליט הלחץ להוציא. הקלט את הזמן ואת הלחץ, כמו גם נפח / קרציות עבר על גיליון ההזרקה (איור 2). בצע את כל הערות נדרשות (כלומר,פסגה גדולה, תופעות דילול, פיפטה סתום,-היקף o בסיס / רועש).
    17. עבור זריקות גלוטמט, לחכות 3 - 5 דקות בין זריקות. עבור KCl זריקות לחכות 1 - 2 דקות בין זריקות. להזריק באמצעות אותו בלחץ זמן לפחות 3 פעמים. שנת שעה וחזור. נסה לא לשנות לחץ אלא אם micropipette יש סתימה.
    18. אם micropipette יש סתימה, להגביר את הלחץ עד 30 psi.
    19. שיא מאזורי המוח הרצוי, חוזר משני צידי המוח באמצעות פתרונות שונים. קלט בסיס בכל אזור חדש עבור 20 דקות.
    20. קח את MEA עם micropipette המצורפת, לשטוף עם מים די ומשרים PBS לילה עד שכל הדם נעלם.
    21. להרדימו ולשמור את המוח בתוך שפופרת מראש שכותרתו ולאחסן במקפיא -80 ° C או לשמור בצד אחד עבור קיבוע. להרדימו, מנת יתר עם isoflurane (אינהלציה). בצע עריפה באמצעות מספריים כירורגיים לנתח את האזורים הרצויים.

7. MEAs מצופה ניקוי לאחר השימוש

  1. אל תנקה MEAs אם בשימוש. אם יש מוך או אבק על משטח נקי עם מתנול ולתת להתייבש במשך 24 שעות לפני הציפוי.
  2. הפעל באמבט מים (80 מעלות צלזיוס) ולספוג קצה MEA עבור 30 דקות. נגב בזהירות את קצה האלקטרודה עם כותנה היטה המוליך כדי להסיר כל פסולת כי ניתן להשאיר על קצה האלקטרודה. אין לקבל את "חלק הבידוד" השחור של MEA הרטוב.
  3. באמצעות שלושה sonicators שונה, יש להשרות את קצה MEA ב (1) Citrisolv, סוכן מסחרי ממס וסליקה (2) איזופרופיל, ו (3) מי DI עבור 5 דקות. נגב בזהירות את קצה האלקטרודה עם כותנה היטה המוליך כדי להסיר כל פסולת כי ניתן להשאיר על קצה האלקטרודה.
  4. בדוק את הטיפים תחת מיקרוסקופ לנתח כדי להבטיח את השכבות הוסרו בהצלחה.

ניתוח 8.

  1. כדי לנתח את הנתונים,ראשיתיצא הניסוי הרצוי על ידי לחיצה כפולה על הניסוי המוגמר ובחירת "נתוני הייצוא" מהתפריט הנפתח קובץ.
  2. לשמור את הנתונים האלו אל מיקום הקובץ הרצוי ולפתוח בתכנית הניתוח. לחץ על "פתח" בתכנית הניתוח ולבחור את הקובץ שנשמר לאחרונה.
  3. תן את התכנית כמה רגעים כדי להעלות את הקובץ ולאחר מכן לבדוק בניסוי תחת לשונית סמני אירוע. תחת פלט, לבדוק את התיבות עבור הפרמטרים הרצויים. לדוגמא, בסיס, משרעת, אזור שיא (שטח מתחת לעקומה), עליית T, ו- T 80.
  4. לחץ רענון ולאחר מכן לנתח לייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני (זו עשויה להימשך מספר דקות). התכנית תיתן הנחיה לשמור את הקובץ במיקום הרצוי. לאחר השמירה, את הקובץ ניתן לערוך גיליון אלקטרוני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעוד הטכנולוגיה הזו יכולה לשמש כדי למדוד שינויים glutamatergic איתות בסוגים רבים של מודלים בבעלי חיים, כגון פגיעה מוחית טראומטית, הזדקנות, מתח, ואפילפסיה, כאן אנו מדגימים כיצד הטכנולוגיה MEA יכול לשמש כדי לבחון שינויים glutamatergic במודל עכבר מהונדס של tauopathy האנושי 19, 20. RTG (TauP301L) 4510 העכבר מבטא את המוטציה P301L ב טאו הקשורים דמנציה פרונטו-טמפורלית ו פרקינסון קשורה כרומוזום 17,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקת MEA מאפשרת מדידה של קינטיקה המהירה של שחרור הנוירוטרנסמיטר ספיג במבחנה ובחי. לפיכך, הטכנולוגיה מייצרת מגוון רחב של פלט נתונים כולל רמות הנוירוטרנסמיטר טוניק, שחרור הנוירוטרנסמיטר עורר, וסילוק הנוירוטרנסמיטר. עם זאת, בגלל השימוש MEAs היא הליך מורכב יחסית, ישנם גורמים רבים שעלולים צריך להיות מותאם לשימוש מוצלח. לדוגמה, במהלך הכיול, אפשר לציין כי אין גל אות (מסך אוסצילוסקופ) או כי התגובות לגירויים הן מינימליות, או נעדר. ככל הנראה עקב תקלה במערכת, הפעלה מחדש ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GG הוא הבעלים הבלעדי של Quanteon, LLC שעושה מערכת הקלטה FAST-16 המשמש למדידות גלוטמט במחקר זה. JEQ הוא יועץ שילם עבור Quanteon.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (MNR; U54GM104942), NIA (MNR; R15AG045812), איגוד האלצהיימר (MNR; NIRG-12-242,187), גרנט הסנאט סגל מחקר WVU (MNR), ו WVU PSCOR גרנט (MNR).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
FAST-16mkIII-8 ערוץQuanteon16mkIII
מערכי מיקרואלקטרודותCenMetW4 או 8-TRK
סרום בקר אלבומין (BSA)סיגמא-אולדריץ'A-305910 גרם (פג תוקף לאחר חודש)
גלוטראלדהידסיגמא-אולדריץ'G-6257100 מ"ל (פג תוקף לאחר 6 חודשים)
גלוטמט אוקסידאזUS ביולוגי או סיגמא אולדריץ'G4001-01 או 10064650 UI (פג תוקף לאחר 6 חודשים)
מזרקי המילטוןהמילטון#803832 מזרקים
מתנולBDHUN12304 ליטר
m-פנילאנדיאמין דיהידרוכלוריד (mPD)ACROS Organics133056025025 גרם
אלקטרודות ייחוס (RE-5B)BASMF-20793 אלקטרודות
מגנטי המופעל על ידי סוללה צלחת ערבובCole-parmerEW-04804-01יכול לרכוש מספק אחר
גלוטמטסיגמא-אולדריץ'G-1626100 גרם
חומצה אסקורביתTCI50-81-7500 גרם
דופמין הידרוכלורידאלפא Aesar62-31-75 גרם
חומצה פרכלוריתVWRUN2920500 מ"ל
פוסטסיום כלורידVWR7447-40-71 ק"ג
נתרן כלוריVWR7647-40-71 ק"ג
סידן כלורידMP153502100 גרם
נתרן הידרוקסידBDH1310732500 גרם
זכוכית פיפטות פליטה בלחץCenMet
שעווה דביקהKerrlab625יכול לרכוש מספק שונה
MicrosyringeWorld Precision InstrumentsMF28G-5
דוגמנות חימרWalMartיכול לרכוש מספק אחר
Picospritzer IIIParker
Silverחוט AM מערכות#786500
חומצה הידרוכלוריתBDH7647010 2.5 ליטר
חוט פלטינהAM מערכות778000
אקדח הלחמהLowes או הום דיפויכול לרכוש מספק אחר
מולטימטרוולמארטיכול לרכוש מספק אחר
PhysioSuiteKent Scientificיכול לרכוש מספק אחר
SomnoSuiteKent Scientificיכול לרכוש מספק אחר
מכשירסטריאוטקסיStoeltingניתן לרכוש מספק
שונה מעבדה דיגיטלית סטנדרטיתStoeltingניתן לרכוש מספק אחר
Meiji EMZ מיקרוסקופ Meiji EMZ-5
מקדחהDremelMicro
MetricideMetrex102800
אזמלVWRניתן לרכוש מספק אחר
מספריים לניתוחVWRניתן לרכוש מספק אחר
ספוגיות כותנה סטריליותPuritan25806ניתן לרכוש מספק אחר
משחת עינייםPuralube משחהלהשיג מהווטרינר
ספוגיות יודVWRS48050יכול לרכוש מספק אחר
ספוגיות אלכוהולחנות תרופות מקומיתיכול לרכוש מספק אחר
וילון ניתוח סטריליDynarex4410יכול לרכוש מספק אחר
מי מלח סטרילייםTeknovaS5815יכול לעשות הלמה משלו באמצעות מסננים
מי חמצן (3%)בית מרקחתיכול לרכוש מספק אחר
כרית חימוםWalMartיכול לרכוש משונה הספק
וטרינרית מקומי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
  2. Cavus, I., et al. Extracellular metabolites in the cortex and hippocampus of epileptic patients. Ann Neurol. 57 (2), 226-235 (2005).
  3. Montgomery, A. J., Lingford-Hughes, A. R., Egerton, A., Nutt, D. J., Grasby, P. M. The effect of nicotine on striatal dopamine release in man: A [11C]raclopride PET study. Synapse. 61 (8), 637-645 (2007).
  4. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 7 Unit 7.1 (2009).
  5. Hu, S., Sheng, W. S., Ehrlich, L. C., Peterson, P. K., Chao, C. C. Cytokine effects on glutamate uptake by human astrocytes. Neuroimmunomodulation. 7 (3), 153-159 (2000).
  6. He, X., et al. The association between CCL2 polymorphisms and drug-resistant epilepsy in Chinese children. Epileptic Disord. 15 (3), 272-277 (2013).
  7. Xie, Y., et al. Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR. J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).
  8. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
  9. Hefendehl, J. K., et al. Mapping synaptic glutamate transporter dysfunction in vivo to regions surrounding Abeta plaques by iGluSnFR two-photon imaging. Nat Commun. 7, 13441(2016).
  10. Hinzman, J. M., Thomas, T. C., Quintero, J. E., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Disruptions in the regulation of extracellular glutamate by neurons and glia in the rat striatum two days after diffuse brain injury. J Neurotrauma. 29 (6), 1197-1208 (2012).
  11. Thomas, T. C., Hinzman, J. M., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Hypersensitive glutamate signaling correlates with the development of late-onset behavioral morbidity in diffuse brain-injured circuitry. J Neurotrauma. 29 (2), Epub 2011 Dec 2011 187-200 (2011).
  12. Hinzman, J. M., et al. Diffuse brain injury elevates tonic glutamate levels and potassium-evoked glutamate release in discrete brain regions at two days post-injury: an enzyme-based microelectrode array study. J Neurotrauma. 27 (5), 889-899 (2010).
  13. Stephens, M. L., Quintero, J. E., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Age-related changes in glutamate release in the CA3 and dentate gyrus of the rat hippocampus. Neurobiol Aging. 32 (5), Epub 2009 Jun 2017 811-820 (2009).
  14. Nickell, J., Salvatore, M. F., Pomerleau, F., Apparsundaram, S., Gerhardt, G. A. Reduced plasma membrane surface expression of GLAST mediates decreased glutamate regulation in the aged striatum. Neurobiol Aging. 28 (11), 1737-1748 (2006).
  15. Hascup, E. R., et al. An allosteric modulator of metabotropic glutamate receptors (mGluR(2) ) (+)-TFMPIP, inhibits restraint stress-induced phasic glutamate release in rat prefrontal cortex. J Neurochem. 122 (2), Epub 02012 Jun 07713 619-627 (2012).
  16. Rutherford, E. C., Pomerleau, F., Huettl, P., Stromberg, I., Gerhardt, G. A. Chronic second-by-second measures of L-glutamate in the central nervous system of freely moving rats. J Neurochem. 102 (3), 712-722 (2007).
  17. Matveeva, E. A., et al. Reduction of vesicle-associated membrane protein 2 expression leads to a kindling-resistant phenotype in a murine model of epilepsy. Neuroscience. 202, Epub 2011 Dec 2013 77-86 (2011).
  18. Matveeva, E. A., et al. Kindling-induced asymmetric accumulation of hippocampal 7S SNARE complexes correlates with enhanced glutamate release. Epilepsia. 53 (1), Epub 02011 Dec 0334 157-167 (2012).
  19. Hunsberger, H. C., Rudy, C. C., Batten, S. R., Gerhardt, G. A., Reed, M. N. P301L tau expression affects glutamate release and clearance in the hippocampal trisynaptic pathway. J Neurochem. 132 (2), 169-182 (2015).
  20. Hunsberger, H. C., et al. Riluzole rescues glutamate alterations, cognitive deficits, and tau pathology associated with P301L tau expression. J Neurochem. 135 (2), 381-394 (2015).
  21. Hunsberger, H. C., et al. Peripherally restricted viral challenge elevates extracellular glutamate and enhances synaptic transmission in the hippocampus. J Neurochem. , (2016).
  22. Obrenovitch, T. P., Urenjak, J., Zilkha, E., Jay, T. M. Excitotoxicity in neurological disorders--the glutamate paradox. Int J Dev Neurosci. 18 (2-3), 281-287 (2000).
  23. Hillered, L., Vespa, P. M., Hovda, D. A. Translational neurochemical research in acute human brain injury: the current status and potential future for cerebral microdialysis. J Neurotrauma. 22 (1), 3-41 (2005).
  24. Burmeister, J. J., Gerhardt, G. A. Self-referencing ceramic-based multisite microelectrodes for the detection and elimination of interferences from the measurement of L-glutamate and other analytes. Anal Chem. 73 (5), 1037-1042 (2001).
  25. Burmeister, J. J., et al. Improved ceramic-based multisite microelectrode for rapid measurements of L-glutamate in the CNS. J Neurosci Methods. 119 (2), 163-171 (2002).
  26. Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J Neurosci. 25 (11), 2906-2916 (2005).
  27. Greene, J. G., Borges, K., Dingledine, R. Quantitative transcriptional neuroanatomy of the rat hippocampus: evidence for wide-ranging, pathway-specific heterogeneity among three principal cell layers. Hippocampus. 19 (3), 253-264 (2009).
  28. Borland, L. M., Shi, G., Yang, H., Michael, A. C. Voltammetric study of extracellular dopamine near microdialysis probes acutely implanted in the striatum of the anesthetized rat. J Neurosci Methods. 146 (2), Epub 2005 Mar 2005 149-158 (2005).
  29. Jaquins-Gerstl, A., Michael, A. C. Comparison of the brain penetration injury associated with microdialysis and voltammetry. J Neurosci Methods. 183 (2), Epub 2009 Jun 2025 127-135 (2009).
  30. Azbill, R. D., Mu, X., Springer, J. E. Riluzole increases high-affinity glutamate uptake in rat spinal cord synaptosomes. Brain Res. 871 (2), 175-180 (2000).
  31. Gourley, S. L., Espitia, J. W., Sanacora, G., Taylor, J. R. Antidepressant-like properties of oral riluzole and utility of incentive disengagement models of depression in mice. Psychopharmacology (Berl). 219 (3), Epub 2011 Jul 2021 805-814 (2011).
  32. Frizzo, M. E., Dall'Onder, L. P., Dalcin, K. B., Souza, D. O. Riluzole enhances glutamate uptake in rat astrocyte cultures). Cell Mol Neurobiol. 24 (1), 123-128 (2004).
  33. Fumagalli, E., Funicello, M., Rauen, T., Gobbi, M., Mennini, T. Riluzole enhances the activity of glutamate transporters GLAST, GLT1 and EAAC1. Eur J Pharmacol. 578 (2-3), Epub 2007 Oct 2025 171-176 (2008).
  34. Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain. J Neurochem. 96 (6), Epub 2006 Jan 1625 1626-1635 (2006).
  35. Kane, R. L., Martinez-Lopez, I., DeJoseph, M. R., Vina, J. R., Hawkins, R. A. Na(+)-dependent glutamate transporters EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 274 (45), 31891-31895 (1999).
  36. Ramsden, M., et al. Age-dependent neurofibrillary tangle formation, neuron loss, and memory impairment in a mouse model of human tauopathy (P301L). J Neurosci. 25 (46), 10637-10647 (2005).
  37. Oddo, S., et al. Triple-transgenic model of Alzheimer's disease with plaques and tangles: intracellular Abeta and synaptic dysfunction. Neuron. 39 (3), 409-421 (2003).
  38. Zang, D. W., et al. Magnetic resonance imaging reveals neuronal degeneration in the brainstem of the superoxide dismutase 1 transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 20 (7), 1745-1751 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים