הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Assay תואם תפוקה גבוהה כדי להעריך יעילות התרופה נגד Macrophage passaged

7.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55453

⸱

24 במרץ 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham

במאמר זה

סיכום

מודלים ומבחנים חדשים שישפרו את תהליך פיתוח התרופות המוקדם לתרופות נגד שחפת מהדור הבא הם רצויים מאוד. כאן, אנו מתארים בדיקה מהירה, זולה ותואמת BSL-2 להערכת יעילות התרופה נגד Mycobacterium tuberculosis שניתן להתאים בקלות לבדיקה בתפוקה גבוהה.

תקציר

תהליך פיתוח התרופות המוקדם לתרופות נגד שחפת מעוכב על ידי תרגום לא יעיל של תרכובות בעלות פעילות חוץ גופית ליעילות בסביבה הקלינית. סביר להניח שהדבר נובע מחוסר התחשבות במחסומי החדירה התאיים הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית הקיימים במארח הנגוע. לאחרונה הקמנו מודל זיהום חלופי המייצר מבנים מצטברים גדולים של מקרופאגים המכילים M. tuberculosis (Mtb) צפוף בליבתו, שהיה מתאים לבדיקת רגישות לתרופות. מודל הדבקה זה הוא זול, מהיר והכי חשוב תואם BSL-2. כאן, אנו מתארים את ההליכים הניסיוניים ליצירת מבנים מצטברים של Mtb/מקרופאגים שייצרו Mtb העובר במקרופאגים לבדיקת רגישות לתרופות. בפרט, אנו מדגימים כיצד ניתן להתאים את מערכת ההדבקה הזו ישירות לפורמט צלחת 96 בארות המראה יכולת תפוקה לסינון ספריות תרכובות כנגד Mtb. בסך הכל, בדיקה זו היא תוספת חשובה לארגז הכלים לגילוי תרופות Mtb הזמין כיום בשל הפשטות, העלות האפקטיבית והמדרגיות שלה.

מבוא

שחפת (TB) נותרה איום בריאותי הגלובלי רציני למרות הזמינות של כימותרפיה נגד שחפת במשך 40 שנה 1. זה נובע בחלקו לדרישת תקופות טיפול ארוך של למעלה מ -6 חודשים באמצעות שילובי תרופות מרובות, אשר מוביל לחולה אי קיום 2. הופעה של TB עמיד לתרופות בשנים האחרונות חריף עוד יותר בעיות בתחום שבו פיתוח מוצלח של תרופות קליניות שאושרה הנו כמעט אפסי 3. ואכן, למרות בפיתוח תרופות נגד שחפת ממצה, רק תרופה אחת כבר FDA אישר לשימוש קליני ב -40 השנים האחרונות 4. לפיכך, דורות חדשים של תרופות אנטי-TB יש צורך דחוף כדי לטפל בבעיה זו.

בעיית מפתח לגילוי סמי TB היא חוסר העברה מוצלחת תרכובות עם פעילות במבחנה יעילה במסגרת הקלינית= "Xref"> 5, 6, 7. בתחילה, גישות ה ביעדים שימשו למסך אנטי סמים חיידק השחפת 5, אשר לא הצליחו לתרגם בתאים שלמים של חיידקים. גם כאשר תאי חיידק השחפת משמשים, זה בד"כ מבוצע באמצעות תרבויות גדלו מרק, אשר לא לחזות במדויק יעילות תרופת in vivo 8, 9. בעיות אלה הוכרו מבחני מיון תרופה נגד מקרופאגים המכילים חיידקי שחפת או סמוי חיידק שחפת הוקמו 8 בהצלחה, 10, 11, 12. עם זאת, גם אלה מבחנים מתקדמים יותר לא נותנים תמורה מספקת לחסמים החדירים שתרופות נתקלות הנגעים ריאתי הלא vascularized, ובסופו של המוקדים נמקי באתר של זיהום. אכן, אפילו עבור ריפמפיצין התרופה הראשונה אונליין TB, מינון תת אופטימלית נחקר בשל לקוי ברקמות vivo ובנוזל השדרה מוחין (CSF) חדירה 13, 14, 15 וכן ירד היעילות נגד תאיים 8 MTB, 9. ככזה, מודלי מבחנים חדשים שייקחו בחשבון פרמטרים אלה במהלך תהליך פיתוח מוקדם להוביל היה ללא ספק לשפר את המאמצים לגילוי סמי TB.

כדי לתת מענה לצורך זה, הקמנו לאחרונה מודל זיהום זול, מהיר, BSL-2 תואם חלופי בדיקות יעילות תרופת חיידקי שחפת 16. מודל זיהום זה מיוצר ארוז חיידק שחפת בצפיפות בתוך מבנים המצרפי מקרופאג גדולים, אשר סכם את המחסומים חדירי הסלולר רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית שנוצר-passaged מקרופאג חיידקי שחפת עם מצב פיסיולוגי שינה הדומה סמויה חיידק שחפת. חיידק השחפת נגזר ממודל זיהום זה היה בשילוב עם assay microtiter resazurin (הרמ"א) כדי להעריך יעילות התרופה, אשר הפיק תוצאות עקביות עם מודלים זיהום תאיים אחרים בקורלציה גם עם היכולת דיווח של סמים TB נפוצה מנת להגיע לריכוזי CSF גבוהה ביחס ריכוזים בסרום 16.

כאן אנו מתארים בפרוטרוט את הדור של חיידק השחפת / מבנים המצרפי מקרופאג לייצר-passaged מקרופאג חיידק השחפת מתאים בדיקות רגישות סמים באמצעות הרמ"א. בפרט, אנו מראים כיצד מערכת זיהום זה יכול להיות מותאם בפורמט 96-גם עבור תאימות עם התפוקה ההקרנה של תרופות נוגדות-TB מועמד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: כפי שחפת mc 2 6206 הוא זן לֹא אַלִים 17, 18, כל העבודה בפרוטוקול זה יכול להתבצע במתקן 2 רמת בטיחות ביולוגית (BSL-2).

1. תנאי תרבות עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק הבעת שחפת mc 2 6206 (חיידקי השחפת -GFP)

הערה: M. שחפת H37Rv נגזר auxotroph זן mc 2 6206 (Δ panCD, Δ leuCD) הפך עם GFP להביע פלסמיד pMN437 משמש ברחבי פרוטוקול זה 16. אפשר להחליף את זן חיידקי השחפת -GFP עם GFP שאינו מביע זן פראי סוג כדי לאפשר נגישות קלה יותר של הזן לחוקרים. עם זאת, הביטוי GFP רצוי לאפשר אישור ויזואלי של phagocytosis היווצרות של אגרגטים MTB / מקרופאג. עבור לוןאחסון לטווח גרם, MTB -GFP הוקפאו ב -80 מעלות צלזיוס 7H9 מדיה מלאה (כמתואר בשלב 1.1) בתוספת 20% גליצרול.

  1. הכן התקשורת חיידק השחפת -GFP מלאה (7H9-C) על ידי השלמת 7H9 בינוני עם 10% מידלברוק OADC, 0.02% tyloxapol, 24 מיקרוגרם / מ"ל D-חומצה פנטותנית, 50 מיקרוגרם / מ"ל L-לאוצין ו -50 מיקרוגרם / מ"ל hygromycin B.
  2. להפשיר בקבוקון אחד של חיידק השחפת -GFP ולהוסיף 10 מ"ל של 7H9-C בבקבוק PETG תחתית מלבנית 30 מ"ל.
  3. לדגור על 37 מעלות צלזיוס על שייקר רוטרי (50 סל"ד). קח מדידות צפיפות אופטית (OD 600) כל כמה ימים עד OD 600 מגיע 1.0 (כ 5-8 ימים).
  4. לדלל ותרבות מעבר לפי הצורך כדי לשמור על OD 600 בין 0.2-1.0.
  5. עבור זיהום, להשתמש תרבות הוקמה של חיידק השחפת -GFP במסגרת שלב צמיחת הלוגריתמים (OD 600 של 0.6-1). כדי למנוע תרבויות clumpy, sonicate את הבקבוק תרבות חיידקי השחפת באמבט מים (130 ואט; 3 x פולסים של 5) oncדואר או פעמיים בשבוע

2. תנאי התרבות THP-1 תאים

  1. הכן התקשורת תא THP-1 המלא (RPMI-C) על ידי משלים RPMI 1640 בינוני עם 10% בסרום שור העובר חום מומת, 2 מ"מ L- גלוטמין, ו -10 מ"מ HEPES.
  2. דגירה התאים בבקבוק T-75 על 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified של 5% CO 2.
  3. ספירת תאים באמצעות hemocytometer או cytometry זרימה בכל יום אחר ולשמור תאים THP-1 בצפיפות בין 0.1 כדי 0.6 מיליון דולר מ"ל.

3. פרוטוקול זיהום כדי לייצר מבני צבירת MTB / Macrophage

  1. THP-1 הכנת תא (לכל צלחת 96-היטב)
    1. צנטריפוגה 7 x 10 6 THP-1 תאים ב 250 XG במשך 5 דקות. Resuspend ב 7 מ"ל RPMI-C.
  2. הכנה חיידק השחפת -GFP
    1. צנטריפוגה 2.8 x 10 8 חיידק השחפת -GFP ב 3,200 XG במשך 5 דקות בצנטריפוגה מתנדנד דלי uלשיר המרה של OD 600 1.0 = 3 x 10 8 חיידקים / מ"ל.
    2. שטפי פעם עם כמו RPMI-C ו צנטריפוגות בשלב 3.2.1.
    3. גלולה ב 7 מ"ל RPMI-C ו מערבולת למשך 10 s.
  3. הַדבָּקָה
    הערה: ראה איור 1 עבור תבנית.
    1. כן צלחת 96-היטב על ידי הוספת 200 μL של מים סטריליים בשורות A ו- H ועמודות 1 ו 12 עבור שפת מים כדי למנוע אידוי של מדיום התרבות.
    2. הוספת 200 μL RPMI-C לעמודה 2 (B2 כדי G2) לפיקוח רקע (Blank).
    3. כדי להדביק, להוסיף ההשעיה חיידקי השחפת -GFP (שלב 3.2) כדי ההשעיה תא THP-1 (שלב 3.1) ומערבבים היטב על ידי pipetting. צפיפות התאים THP-1 הסופית היא 5 x 10 5 לכל מיליליטר והריבוי המקביל של זיהום הוא 40.
    4. יוצקים את ההשעיה THP-1 / חיידקי השחפת -GFP למאגר 25 מ"ל.
    5. הוספת 200 μL של THP-1 / חיידקי השחפת -GFP השעיה לכל 96-הבארות הנותרות (B3 דרך G11) usinפיפטה רב ערוצי ga.
      הערה: אם עובד עם 96-גם צלחות מרובות, באופן קבוע resuspend השעית THP-1 / חיידק השחפת שנותרה המאגר כדי להבטיח אפילו תערובת מתווספת כל טוב.
    6. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 למשך 7-10 ימים.
    7. שינוי תקשורת כל 2 ימים על ידי הסרת 100 לאט μL בילה תקשורת מהחלק העליון של כל טוב והוספה בעדינות 100 μL מראש חממו RPMI-C באמצעות pipet רב ערוצית. אל resuspend בארות ומפריעים המצרפים MTB / מקרופאג על החלק התחתון של הבארות.
    8. מבחינה ויזואלית לבחון את הבארות ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (אובייקטיבי 4-10X) יומי, ובשים לב לגודל של אגרגטים MTB / מקרופאג. במשך היום 7-10, אגרגטים MTB / מקרופאג צריכים להיות גדולים מספיק (ראה איור 2 לעיון) כדי להמשיך לבדיקה יעילה תרופה (סעיף 4).
    9. אם תרצה, ללכוד תמונות של 96-בארות באמצעות מערכת הדמית תא אוטומטית מצוידותעם מסנן שדה GFP בהיר קובע לתעד היווצרות המצרפי MTB / מקרופאג.
      הערה: אם אין למשתמשים גישה למערכת הדמיה אוטומטיות, תמונות של בארות נציג ניתן לקחת באמצעות כל מיקרוסקופ מתאים עם GFP ושדה בהיר יכולות.

4. צמיחה Assay עיכוב כדי להעריך את חיידקי השחפת נגד יעילות התרופה נגזר MTB / אגרגטים Macrophage

  1. הכנה ותרופות (תנאים בשלושה עותקים עבור שתי תרופות)
    הערה: ראה איור 1A עבור תבנית.
    1. צלחת 96-היטב נפרדת, להוסיף 125 μL של תקשורת 7H9-C כדי B2 עד G10.
    2. הכן שתי תרופות במחיר כפולה לריכוז הסופי הרצוי הגבוה ביותר 1 מיליליטר של 7H9-C לתת דין וחשבון על הדילול בשלב 4.2.4.
    3. הוסף 250 μL של כל תרופה לבארות B11-C11-D11 ו- E11-F11-G11, בהתאמה עבור טיפולים בשלושה עותקים.
    4. שימוש pipet הרב ערוצית, סדרתי dilיוטה תרופות המבחן כפול על ידי העברת 125 μL מ B11-G11 לתוך B10-G10. מערבבים על ידי pipetting 5 פעמים בכל שלב.
    5. המשך כדי לעבור 125 μL מעמודה לעמודה (מימין לשמאל) על פני הצלחת, ולהפסיק אחרי טור 4.
    6. לאחר ערבוב בעמודה 4, להשליך 125 μL לתוך מיכל פסולת. עמודות 2 ו -3 לא יכילו כל תרופות כדי לאפשר שימוש כרקע (בלנק) ובקרות צמיחה חיובית.
      הערה: לחילופין, בצע תבנית באיור 1B לספריות בדיקות סמים. כל צלחת 96-גם יכולה להכיל 58 תרופות בריכוז יחיד. כן זה צלחת סמים באמצעות כפול לריכוז הסופי הרצוי שכן הוא יהיה מדולל וחצי בשלב 4.2.4.
  2. טיפול תרופתי:
    1. אחזר את צלחת 96-היטב המכיל את חיידקי השחפת -infected מקרופאגים (אגרגטים MTB / מקרופאג).
    2. בזהירות למזוג את כל הבארות הרלוונטיות (B2 דרך G11) עם pipet רב ערוצית.בצע זאת באופן דו-שלבי: ראשית להסיר 150 μL ללא הטיית הצלחת, ולאחר מכן להסיר התקשורת הנותרים (~ 50 μL) על ידי הטיית הצלחת החדרת קצה פיפטה לקצה התחתון של הבאר. כפי MTB / אגרגטים מקרופאג הם חסיד אל תחתית הבאר, לא חומר צריך ללכת לאיבוד.
    3. בעדינות להוסיף 100 μL של תקשורת 7H9-C לכל הבארות הרלוונטיות (B2 דרך G11) של הצלחת המכילה אגרגטים MTB / מקרופאג.
    4. שימוש pipet רב ערוצית, להעביר 100 μL מהתרופה המכיל צלחת 96-היטב (שלב 4.1) על הבארות המקבילות של הצלחת הזיהום.
    5. מקום בשקית אטומה דגירה במשך 3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס.

5. כימות של יעילות התרופה באמצעות assay Resazurin microtiter טוב

  1. הכן resazurin פתרון המניות בריכוז סופי של 0.8 מ"ג / מ"ל ב H 2 O. סינון דרך קרום PVDF גודל 0.22 מיקרומטר הנקבוביות לעיקור.
  2. כן resazurin עובד פתרון על ידי ערבוב פתרון מניות resazurin, H 2 O ו Tween-80 (פתרון 20% ב O H 2) בתוך 2: יחס 1: 1. ריכוזים גמר הן 0.4 מ"ג / מ"ל ​​resazurin ו 5% Tween-80.
  3. באמצעות קורא צלחת, התקנת תכנית לקרוא קרינת עירור 530 ננומטר ו 590 ננומטר פליטה כל 30 דקות במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. קורא צלחת טרום חם 37 ° C.
  4. להוסיף 20 μL של פתרון עובד resazurin לכל בארות רלוונטי (B2 דרך G11) של הצלחת טיפול תרופתי (שלב 4.11) באמצעות pipet הרב ערוצית.
  5. מניחים צלחת על צלחת הקורא ולהפעיל את התוכנית להקים בשלב 5.3.
    הערה: כדי להקל על העיבוד של כמויות גדולות של צלחות assay, זה מספיק כדי לפתח את assay C חממת 37 ° ולבצע קרינה יחידה קוראה לכל 24 h. זה חל גם על משתמשים שאין להם גישה קוראת צלחת עם יכולות הקינטית דגירה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לאשר את חוסנו של התאמת המודל זיהום זה 96-גם בפורמט צלחת, אנחנו כאן בחנו את הרגישות לתרופה של חיידק השחפת נגזר 96-היטב שלנו מותאם מודל הזיהום ריפמפיצין (RIF) ו moxifloxacin (Moxi) בהתאם לתבנית ניתנת באיור 1A. אנו מראים כי הדור של חיידק שחפת / מקרופאג המצרפי מבני מפתח assay זה יכול להיות מיוצר באופן מהימן במתכונת צלחת 96-היטב (איור 2), ובכך שהיא מאפשרת תאימות תפוקה (איור 1B). מק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הנה, יש לנו תיאר בפרוטרוט מודל חלופי בחיידק השחפת זיהום מתאים בדיקות יעילות התרופה. מודל זה לוקח בחשבון שני גורמים מרכזיים שיש לתת את דעת יותר במהלך תהליך פיתוח תרופות TB מוקדם: הנוכחות של מחסומים רלוונטיים מבחינה הפיזיולוגית לחדירה בסמי שינויים מטבוליים של חיידק השחפת במהלך הדבקה. למרות שאנו בעבר הראינו את היתרונות של מודל הזיהום שלנו והצענו את האפשרות של דרוג את הזיהום עבור תאימות תפוקה 16, כאן אנו מראים כי זהו אכן ברי השגה על ידי התאמת ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לד"ר פרנק וולשנדורף על הגישה לקורא לוחות ההדמיה האוטומטי Cytation 3. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מענק NIH R01-AI104499 ל-OK. חלקים מהעבודה בוצעו במתקני UAB CFAR ועל ידי UAB CFAR Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core, הממומנים על ידי NIH/NIAID P30 AI027767 ועל ידי NIH 5P30 AR048311.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
7H9BD Difco271310עקוב אחר המלצות היצרן Middlebrook
OADCBD Biosciences212351
TyloxapolSigmaT8761הכן תמיסת מלאי של 20% ב-H2O; מסנן לעקר
חומצה D-Pantothenic מלח HeicalciumSigmaP5710הכן תמיסת מלאי של 24 מ"ג/מ"ל ב-H2O; מסנן לעקר
L-leucineMP Biomedicals194694הכן תמיסת מלאי של 50 מ"ג/מ"ל ב-H2O; לסנן לעקר
Hygromycin BEMD Millipore400051הכן תמיסת מלאי של 200 מ"ג/מ"ל בבקבוק מדיה H2O
Nalgene Square PETG ThermoFisher2019-0030
RPMI 1640 MediaHycloneSH30027.01
סרום בקר עובריאטלנטה ביולוגיS12450H
L-גלוטמיןקורנינגMT25005CI
HEPESHycloneSH30237.01
Cytation 3 קורא צלחותBiotekניתן להחלפה עם כל קורא צלחות פלואורסצנטי ומיקרוסקופ
Gen5 תוכנהBiotekהקלטה וניתוח של rezasurin coversion
Rifampicin Fisher ScientificBP2679250הכינו תמיסת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל ב-H2O
Moxifloxacin HydrochlorideAcros Organics457960010הכינו תמיסת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל ב-H2O
Resazurin נתרן מלחסיגמאR7017הכינו 800 μ תמיסת מלאי g/mL ב-H2O; מסנן לעקר
Tween-80Fisher ScientificT164500הכן תמיסת מלאי של 20% ב-H2O; לעקר מסנן

מקורות

  1. Barry, C. E. Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery. Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).
  2. Bass, J. B. Jr, et al. Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention. Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).
  3. Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. The challenge of new drug discovery for tuberculosis. Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).
  4. Palomino, J. C., Martin, A. TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug. Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).
  5. Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. The future for early-stage tuberculosis drug discovery. Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).
  6. Evangelopoulos, D., Fonseca, da, D, J., Waddell, S. J. Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them. Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).
  7. Ekins, S., et al. Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis. J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).
  8. Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5 (10), e1000645(2009).
  9. Hartkoorn, R. C., et al. Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein. Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).
  10. Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. (83), e51114(2014).
  11. Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).
  12. Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).
  13. Dutta, N. K., Karakousis, P. C. Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin? Front Microbiol. 6, 1117(2015).
  14. van Ingen, J., et al. Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment? Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).
  15. Donald, P. R. Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children. Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).
  16. Schaaf, K., et al. A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis. Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).
  17. Sampson, S. L., et al. Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs. Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).
  18. Jain, P., et al. Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis. MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).
  19. Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136 (1), 37-49 (2009).
  20. Collins, L., Franzblau, S. G. Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).
  21. Snewin, V. A., et al. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Resazurin Assay96THP1BSL 2High throughput Screening
Assay תואם תפוקה גבוהה כדי להעריך יעילות התרופה נגד Macrophage passaged
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.