מודלים ומבחנים חדשים שישפרו את תהליך פיתוח התרופות המוקדם לתרופות נגד שחפת מהדור הבא הם רצויים מאוד. כאן, אנו מתארים בדיקה מהירה, זולה ותואמת BSL-2 להערכת יעילות התרופה נגד Mycobacterium tuberculosis שניתן להתאים בקלות לבדיקה בתפוקה גבוהה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Assay תואם תפוקה גבוהה כדי להעריך יעילות התרופה נגד Macrophage passaged
במאמר זה
סיכום
תקציר
תהליך פיתוח התרופות המוקדם לתרופות נגד שחפת מעוכב על ידי תרגום לא יעיל של תרכובות בעלות פעילות חוץ גופית ליעילות בסביבה הקלינית. סביר להניח שהדבר נובע מחוסר התחשבות במחסומי החדירה התאיים הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית הקיימים במארח הנגוע. לאחרונה הקמנו מודל זיהום חלופי המייצר מבנים מצטברים גדולים של מקרופאגים המכילים M. tuberculosis (Mtb) צפוף בליבתו, שהיה מתאים לבדיקת רגישות לתרופות. מודל הדבקה זה הוא זול, מהיר והכי חשוב תואם BSL-2. כאן, אנו מתארים את ההליכים הניסיוניים ליצירת מבנים מצטברים של Mtb/מקרופאגים שייצרו Mtb העובר במקרופאגים לבדיקת רגישות לתרופות. בפרט, אנו מדגימים כיצד ניתן להתאים את מערכת ההדבקה הזו ישירות לפורמט צלחת 96 בארות המראה יכולת תפוקה לסינון ספריות תרכובות כנגד Mtb. בסך הכל, בדיקה זו היא תוספת חשובה לארגז הכלים לגילוי תרופות Mtb הזמין כיום בשל הפשטות, העלות האפקטיבית והמדרגיות שלה.
מבוא
שחפת (TB) נותרה איום בריאותי הגלובלי רציני למרות הזמינות של כימותרפיה נגד שחפת במשך 40 שנה 1. זה נובע בחלקו לדרישת תקופות טיפול ארוך של למעלה מ -6 חודשים באמצעות שילובי תרופות מרובות, אשר מוביל לחולה אי קיום 2. הופעה של TB עמיד לתרופות בשנים האחרונות חריף עוד יותר בעיות בתחום שבו פיתוח מוצלח של תרופות קליניות שאושרה הנו כמעט אפסי 3. ואכן, למרות בפיתוח תרופות נגד שחפת ממצה, רק תרופה אחת כבר FDA אישר לשימוש קליני ב -40 השנים האחרונות 4. לפיכך, דורות חדשים של תרופות אנטי-TB יש צורך דחוף כדי לטפל בבעיה זו.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: כפי שחפת mc 2 6206 הוא זן לֹא אַלִים 17, 18, כל העבודה בפרוטוקול זה יכול להתבצע במתקן 2 רמת בטיחות ביולוגית (BSL-2).
1. תנאי תרבות עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק הבעת שחפת mc 2 6206 (חיידקי השחפת -GFP)
הערה: M. שחפת H37Rv נגזר auxotroph זן mc 2 6206 (Δ panCD, Δ leuCD) הפך עם GFP להביע פלסמיד pMN437 משמש ברחבי פרוטוקול זה ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי לאשר את חוסנו של התאמת המודל זיהום זה 96-גם בפורמט צלחת, אנחנו כאן בחנו את הרגישות לתרופה של חיידק השחפת נגזר 96-היטב שלנו מותאם מודל הזיהום ריפמפיצין (RIF) ו moxifloxacin (Moxi) בהתאם לתבנית ניתנת באיור 1A. אנו מראים כי הדור של חיידק שחפת / מקרופאג המצרפי מבני מפתח assay זה יכול להיות מיוצר באופן מהימן במתכונת צלחת 96-היטב (איור 2), ובכך שהיא מאפשרת תאימות תפוקה (איור 1B). מק.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הנה, יש לנו תיאר בפרוטרוט מודל חלופי בחיידק השחפת זיהום מתאים בדיקות יעילות התרופה. מודל זה לוקח בחשבון שני גורמים מרכזיים שיש לתת את דעת יותר במהלך תהליך פיתוח תרופות TB מוקדם: הנוכחות של מחסומים רלוונטיים מבחינה הפיזיולוגית לחדירה בסמי שינויים מטבוליים של חיידק השחפת במהלך הדבקה. למרות שאנו בעבר הראינו את היתרונות של מודל הזיהום שלנו והצענו את האפשרות של דרוג את הזיהום עבור תאימות תפוקה 16, כאן אנו מראים כי זהו אכן ברי השגה על ידי התאמת .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
אנו מודים לד"ר פרנק וולשנדורף על הגישה לקורא לוחות ההדמיה האוטומטי Cytation 3. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מענק NIH R01-AI104499 ל-OK. חלקים מהעבודה בוצעו במתקני UAB CFAR ועל ידי UAB CFAR Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core, הממומנים על ידי NIH/NIAID P30 AI027767 ועל ידי NIH 5P30 AR048311.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 7H9 | BD Difco | 271310 | עקוב אחר המלצות היצרן Middlebrook |
| OADC | BD Biosciences | 212351 | |
| Tyloxapol | Sigma | T8761 | הכן תמיסת מלאי של 20% ב-H2O; מסנן לעקר |
| חומצה D-Pantothenic מלח Heicalcium | Sigma | P5710 | הכן תמיסת מלאי של 24 מ"ג/מ"ל ב-H2O; מסנן לעקר |
| L-leucine | MP Biomedicals | 194694 | הכן תמיסת מלאי של 50 מ"ג/מ"ל ב-H2O; לסנן לעקר |
| Hygromycin B | EMD Millipore | 400051 | הכן תמיסת מלאי של 200 מ"ג/מ"ל בבקבוק מדיה H2O |
| Nalgene Square PETG Thermo | Fisher | 2019-0030 | |
| RPMI 1640 Media | Hyclone | SH30027.01 | |
| סרום בקר עוברי | אטלנטה ביולוגי | S12450H | |
| L-גלוטמין | קורנינג | MT25005CI | |
| HEPES | Hyclone | SH30237.01 | |
| Cytation 3 קורא צלחות | Biotek | ניתן להחלפה עם כל קורא צלחות פלואורסצנטי ומיקרוסקופ | |
| Gen5 תוכנה | Biotek | הקלטה וניתוח של rezasurin coversion | |
| Rifampicin | Fisher Scientific | BP2679250 | הכינו תמיסת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל ב-H2O |
| Moxifloxacin Hydrochloride | Acros Organics | 457960010 | הכינו תמיסת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל ב-H2O |
| Resazurin נתרן מלח | סיגמא | R7017 | הכינו 800 μ תמיסת מלאי g/mL ב-H2O; מסנן לעקר |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164500 | הכן תמיסת מלאי של 20% ב-H2O; לעקר מסנן |
מקורות
- Barry, C. E. Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery. Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).
- Bass, J. B. Jr, et al. Treatment of tuberculosis and t....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
