הערכה תת סוגי Cardiomyocyte בעקבות תמלול פקטור בתיווך תכנות מחדש של פיברובלסטים עכבר עובריים

Antonio Fernandez-Perez; Nikhil V. Munshi

doi:10.3791/55456

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הערכה תת סוגי Cardiomyocyte בעקבות תמלול פקטור בתיווך תכנות מחדש של פיברובלסטים עכבר עובריים

7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55456

⸱

22 במרץ 2017

Antonio Fernandez-Perez¹ , Nikhil V. Munshi¹

¹Department of Internal Medicine- Cardiology, UT Southwestern Medical Center

במאמר זה

סיכום

כתב יד זה מתאר פרוטוקול שלב אחר שלב ליצירה וכימות של תת-סוגים לבביים מגוונים שתוכנתו מחדש באמצעות אספקה מתווכת רטרו-וירוס של Gata4, Hand2, Mef2c ו-Tbx5.

תקציר

תכנות מחדש ישיר של סוג תא אחד למשנהו התגלה לאחרונה כפרדיגמה רבת עוצמה לרפואה רגנרטיבית, מידול מחלות ומפרט שושלת. בפרט, ההמרה של פיברובלסטים למיוציטים דמויי קרדיומיוציטים מושרים (iCLMs) על ידי Gata4, Hand2, Mef2c ו-Tbx5 (GHMT) מייצגת דרך חשובה ליצירת מיוציטים לבביים דה נובו במבחנה וב-vivo. עדויות עדכניות מצביעות על כך ש-GHMT מייצר מגוון גדול יותר של תת-סוגים לבביים ממה שהוערך בעבר, ובכך מדגיש את הצורך בגישה שיטתית לביצוע מחקרים נוספים. עם זאת, לפני שניתן להשתמש בתכנות מחדש ישיר כאסטרטגיה טיפולית, יש להבין בפירוט את היסודות המכאניסטיים של המרת שושלת כדי ליצור תת-סוגים לבביים ספציפיים. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט ליצירת iCLMs על ידי תכנות מחדש בתיווך GHMT של פיברובלסטים עובריים של עכברים (MEFs).

אנו מתארים שיטות לבידוד MEF, ייצור רטרו-ויראלי וזיהום MEF כדי להשיג תכנות מחדש יעיל. כדי לקבוע את זהות תת-הסוג של תאים מתוכנתים מחדש, אנו מפרטים גישה שלב אחר שלב לביצוע אימונוציטוכימיה על iCLMs באמצעות קבוצה מוגדרת של נוגדנים תואמים. מוצגות גם שיטות למיקרוסקופיה קונפוקלית, זיהוי וכימות של iCLMs ותתי סוגים בודדים של פרוזדורים (iAM), חדרים (iVM) וקוצב לב (iPM). לבסוף, אנו דנים בתוצאות מייצגות של ניסויי תכנות מחדש ישיר טיפוסיים ומדגישים היבטים טכניים חשובים של הפרוטוקול שלנו כדי להבטיח המרה יעילה של שושלת. יחד, הפרוטוקול האופטימלי שלנו אמור לספק גישה מדורגת לחוקרים לבצע ניסויי תכנות מחדש לבביים משמעותיים הדורשים זיהוי של תת-סוגים בודדים של CM.

מבוא

הלב הוא האיבר הפונקציונלי הראשון לפתח בעובר ^{^1,} ^2. בשיתוף עם מערכת הדם, היא מספקת חמצן, חומרי הזנה, וכן מנגנון סילוק פסולת במהלך פיתוח. שלושה שבועות לאחר ההפריה, הלב האנושי פועם בפעם הראשונה והרגולציה הראויה מתוחזק על ידי cardiomyocytes (CMS). ההפסד בלתי הפיך של תאים מיוחדים אלה היא אפוא הנושא היסודי אותו אי ספיקת לב מתקדמת. בעוד כמה אורגניזמים כגון דג הזברה Xenopus יש פוטנציאל להתחדשות לב, הלב של יונקי הבוגרים מוגבל יותר ^{^3,} ^{^5,} ^6. לפיכך, בהתחשב הפונקציה הקריטית של הלב, אין זה מפתיע כי מחלת לב היא הגורם המוביל למוות בעולם, והיוותה 600,000 מקרי מוות בארצות הברית לבדה ^7. הrefore, טיפולים מבוססי תאים כדי לתקן או להחליף את שריר הלב נפגע ביעילות הם עניין קליני גדול.

המחקר הזרע של יאמאנאקה ועמיתיו ⁸ הראה כי ביטוי כפוי של ארבעה גורמי שעתוק מספיק כדי להמיר תאי פיברובלסטים בדיל באופן מלא לתאי גזע פלוריפוטנטיים. עם זאת, יכולת tumorigenic של כל אסטרטגיות תאי גזע פלוריפוטנטיים כבר דאגה קריטית בשימוש שלהם למטרות טיפוליות. זה הניע התחום המדעי לחפש שיטות חלופיות כדי transdifferentiate תאים תוך הימנעות שלב פלוריפוטנטיים. לאחרונה, מספר קבוצות הראו את הכדאיות של אסטרטגיה זו על ידי הצגת המרה ישירה של פיברובלסטים עכבר לתאי cardiomyocyte דמוי המושרה (iCLMs) עם ביטוי אקטופי של שעתוק גורמי Gata4, Mef2c, Tbx5, ובהמשך, Hand2 (GMT ו GHMT ^9, ^{בהתאמה),} ^10. Furthermore, באותה האסטרטגיה ניתן לבצע in vivo ו ברקמות אדם נגזר ^{^9,} ^{^11,} ^12. מחקרים שנעשה לאחרונה הדגישו גורמים נוספים או מסלולי איתות כי יכול להיות מווסת כדי לשפר את יעילות תכנות מחדש של לב עוד ^{^13,} ^{^14,} ^15. יחדיו, מחקרים אלה להדגים את הפוטנציאל של transdifferentiation ביים עבור טיפולים רגנרטיבית. עם זאת, היעילות הנמוכה של תכנות מחדש CM, המנגנונים המולקולריים הידועים, שחזור עולה בקנה אחד בשל הבדלים מתודולוגיים ^16, ואת האופי הטרוגני של iCLMs להישאר unaddressed.

על מנת ישירות להעריך ההטרוגניות iCLM, עצבנו assay בדידה החזקה תא בודד לזיהוי התפתחות sarcomere ו specificatio שושלת לבn ושניים מאפיינים דרושים של cardiomyocytes הפונקציונלי. יש לפחות שלושה סוגים עיקריים של CM בלב כהגדרתו לפי המיקום שלהם תכונות חשמליות ייחודי: פרוזדורים (PM), חדרית (VM) ו קוצב לב (PM) ^{^17,} ^{^18,} ^{^19,} ^20. בשנת מערך מתוזמר, הם לאפשר שאיבה הנכונה של דם. במהלך פגיעה לבבית, אחד או כל תת עלול להיפגע, ואת הסוג של טיפול בתא היה צורך לטפל על בסיס כל מקרה לגופו. כיום, רוב האסטרטגיות להתמקד בדור הכולל של cardiomyocytes, בעוד מעט עבודה נעשתה כדי ללמוד את המנגנונים המולקולריים אשר מסדיר מפרט תת סוג.

המחקר הבא מפרט כיצד לכמת כראוי סרקומר מאורגן היטב לזהות קבוצה מגוונת של תת cardiomyocyte. באמצעות קוצב לב (PM) עכבר כתב -specific, אנו מסוגלים להחיל iהגישה mmunocytochemical להבחין מיוציטים המושרה דמוי פרוזדורים (IAM), myocytes חדרית דמוי המושרה (IVM), ו myocytes PM דמוי המושרה (iPMs) ^21. בהתבסס על התצפיות שלנו, רק תאים כי תערוכת ארגון sarcomere מסוגלים פועם ספונטני. פלטפורמת תכנות מחדש ייחודית זו מאפשרת להערכת התפקיד פרמטרים מסוימים של בארגון sarcomere, מפרט תת סוג, והיעילות של תכנות מחדש CM ברזולוציה תא בודד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הפרוצדורות הכרוכות שיטות חיה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש במרכז הרפואי Southwestern UT.

1. ניתוק של Hcn4-GFP E12.5 עכבר עובריים פיברובלסטים (MEFs)

הגדרת הזדווגויות מתוזמן בין זכרים Hcn4-GFP הומוזיגוטים ונקבות CD-1.
הקורבן נקבה בהריון E12.5 ידי המתת חסד פחמן דו חמצני ו נקע בצוואר הרחם לאחר מכן.
1. סר קרן רחם עם מלקחיים לנתח כפי שתואר לעיל ^{^22,} ^23, ולהכניס אותם לתוך צלחת פטרי על קרח עם בופר פוספט 1x (PBS) ללא Ca ^{2 +} או Mg ^2+.
ביצוע כל הצעדים הבאים בשכונה בתרבית רקמה באמצעות טכניקה סטרילית.
1. הסר את העוברים מן הרחם מי שפיר שק באמצעות מספריים לנתח מלקחיים. שמור את השליה מחוברת לטיפול טוב יותר. PregnaCD-1 NT הנקבות בדרך כלל ללדת בין 10 ל 14 גורים.
2. שימוש לנתח מלקחיים, לקחת את העוברים המבודדים ובמהירות לשטוף אותם פעמים 70% (v / v) EtOH.
  הערה: השטיפות צריכות להיות מהירות כדי למזער מוות של תאים.
3. הסר את הראש, גפיים, זנב, ואיברים פנימיים, כולל הלב מן העוברים המבודדים.
4. מניחים את הרקמה הנותרת בצלחת 10 ס"מ עם 1 מ"ל של 1x PBS ופשטי- דק באמצעות סכין גילוח סטרילי עד כ 1 מ"מ ³ בגודל.
5. העברת רקמות טחון לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל עם PBS.
6. ספין ב 300 XG במשך 3 דקות. בזהירות לשאוב PBS עודף.
7. הוסף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין- EDTA סטרילי לכל העובר. דגירת תאים באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. בעדינות מערבבים את הצינור כל 4 דקות. יתר העיכול של הרקמות תפחית באופן משמעותי את התשואה.
8. תערובת תאים וורטקס במהירות מרבית (3,200 סל"ד) במשך 4 שעות.
9. הוסף 2 מ"ל של התקשורת פיברובלסטים לכל העובר ומערבבים. t מסנןhrough מסננת תא 100 מיקרומטר בעזרת פיפטה כדי לסייע התאים דרך המסננת. עיין בטבלה 1 לגיבוש כל המדיומים הבאים.
10. ספין ב 300 XG למשך 4 דקות. בזהירות לשאוב supernatant.
11. הוסף 10 מ"ל של התקשורת פיברובלסטים טריים לכל 3 עוברים triturate 6-10 פעמים.
12. פלייט התאים 1 צלחת בתרבית רקמה 15 ס"מ עבור כל 3 עוברים מוכנים. לילה תרבות חממה 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
13. לאחר דגירת הלילה, להחליף את התקשורת עם 30 מיליליטר טרי של תקשורת לכל צלחת. מניח תאים בחזרה לתוך חממת הלילה.
  הערה: בדוק Hcn4-GFP ⁺ תא זיהום תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. התרבות צריכה להיות GFP ^- ורק להיות GFP ⁺ על תכנות מחדש.
14. למחרת, תאי קציר עם 3 מיליליטר של 0.25% מחוממים מראש הטרי טריפסין-EDTA. רוזן ולהקפיא תאים. בדרך כלל, להקפיא תאים ב 3 x 10 ⁶ תאים לכל מיליליטר. Yie הצפויld צריך להיות 3 x 10 ⁶ תאים לכל עובר.

הפקת רטרו-וירוס 2. תכנות מחדש

זהירות: הפרוטוקול הבא דורש ייצור וטיפול רטרווירוסים זיהומיות. בצע את השלבים הבאים בתוך ארון בטיחות ביולוגית רמה 2 תחת הנחיות BSL-2 ו טכניקה סטרילית. השתמש 10% אקונומיקה להיפטר מכל החומרים חשופים רטרווירוסים.

ייצור רטרו-וירוס והכנת MEFs
הערה: הפרוטוקול הבא הוא לייצור retroviral 6 צלחות היטב זיהום MEF ב 24 גם צלחות. עבור פורמטים אחרים, עיין בטבלה 2. MEFs הם מצופה ב יום -1, ולכן העיתוי יהיה צורך בתיאום כראוי עבור כל ניסוי (ראה גם סעיף 2.3 ו איור 2).
1. לשמור פלאט-E (PE) תאים לפי המלצות היצרן. בקצרה, תאים PE תרבות DMEM בתוספת 10% FBS, 1 מיקרוגרם / מ"ל puromycin, 10 מיקרוגרם / מ"ל blasticidin, פניצילין, סטרפטומיצין. מעבר תאים 1: 4 כל יומיים כאשר התרבות מגיע 70-90% confluency.
2. יום -2: היום לפני transfection, זרע תאי פלאט-E ב 1 x 10 ⁶ תאים / גם בצלחת 6 באר במדיה transfection. תאים צריכים להיות ומחוברות 70-80% בזמן transfection.
Transfection באמצעות סוכן transfection מסחרי.
הערה: ריאגנטים המסחריים צריכים להיות בטמפרטורת חדר (RT) לפני transfection. עבור transfection DNA, להוסיף כל פלסמיד דנ"א retroviral בנפרד (G, H, M, ו- T) כדי ליצור קוקטייל GHMT ^9.
1. יום -1: בתוך צינור פוליסטירן חרוטי 15 מ"ל, לערבב 60 μL של התקשורת סרום מופחת עם 6 μL של מגיב transfection לכל תגובה עבור פורמט 6-גם צלחת. דגירה את התערובת במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  הערה: מאז מגיב transfection משמש כאן נקשר פלסטיקה,DD ישירות בתקשורת בסרום המופחתת כדי למנוע ירידה ביעילות transfection.
2. להוסיף סך של 2 מיקרוגרם של קוקטייל GHMT לכל תגובה לטפוח בעדינות לערבב אותו. לא מערבולת. דגירת התגובה במשך 15 דקות ב RT.
3. מוסיף את תערובת משלב 2.2.3 לתאי PE בצורת טיפה חכמה.
4. דגירת תאי פלאט-E טרנספקציה לילה חממת ₂ 37 מעלות צלזיוס, 5% CO. קלט בזמן transfection.
זריעה של פיברובלסטים עובריים בעכבר Hcn4-GFP.
1. 1 שעות לפני ציפוי MEFs, להכין צלחת 24 גם עבור immunocytochemistry.
  1. הוספת coverslip פיברונקטין 12 מ"מ לכל טוב.
  2. בארות מעיל עם 300 μL של פתרון קולגן שור (למשל, SureCoat) דגירה של 37 ° C חממה עבור H 1.
  3. פתרון הציפוי לשאוב מיד לפני ציפוי MEF.
2. להפשיר בקבוקון קפוא של Hcn4-GFP MEFs ולשטוף x1 עם fibrobl מחומם מראשתקשורת אס 'ב XG 500 במשך 5 דקות.
3. לקבוע כדאיות התא באמצעות הרחקה trypan כחול או צבעים דומים. לחשב את מספר תאים קיימא לכל מ"ל של התרבות באמצעות הנוסחה הבאה:
  תאי קיימא% = [1.00 - (מספר התאים הכחולים / מספר התאים הכוללים)] x 100
  1. חישוב מספר כולל של תאי קיימא באמצעות הנוסחא הבאה:
    תאי חיים = תאי% קיימא x גורם לדילול x 10,000 x נפח כולל של השעית תא
4. זרע 3 x 10 ⁴ תאים לכל טוב על צלחת 24 גם עם coverslip פתרון פיברונקטין קולגן שור שהוכן קודם לכן.
התמרה ואת תכנות מחדש של MEFs
הערה: על פי רשימותיו של היצרן, מתוחזקים היטב תאי פלאט-E לייצר כייל ממוצע של 1 x 10 ⁷ יחידות זיהום / מיליליטר. למרות כייל אינו נמדד ישירות עבור כל ניסוי, פקד GFP כלול תמיד כתחליף יעיל זיהום.ביטוי של GFP גבוה ועצמה (GFP ^+> 95%) בדרך כלל בקורלציה עם דור מוצלח בתיווך GHMT של iCLMs.
1. יום 0: 24 שעות שלאחר transfection, לסנן המדיום retroviral PE דרך פילטר אצטט תאית פעילי שטח ללא גודל 0.45 מיקרומטר נקבוביות ולהעביר צינור חרוטי 15 מ"ל. להוסיף polybrene לריכוז סופי של 8 מיקרוגרם / מ"ל. בזהירות לחדש תאים עם 2 מ"ל של מדיום transfection טריים.
  הערה: תאים בקלות לנתק מהצלחת אם התקשורת משתנה מהר מדי.
2. לשאוב את המדיום של MEFs התרבותי ולהוסיף מדיום retroviral שנאסף טרי; זה אמור להניב 1.7 מ"ל של התקשורת לכל גם צלחת 6 באר. הוסף את ~ 800 μL לכל טוב של צלחת 24 גם. חזור צלחת MEF אל האינקובטור דגירת הלילה.
3. יום 1: חזור על שלבי 2.4.1 ו 2.4.2. מחק תאים לאחר איסוף 2 ^nd וירוס. חזור MEFs הנגוע אל האינקובטור ולתת להם לנוח לילה.
4. יום 2: 48 שעות לאחר אינדוקציה, לשאוב את x1 תקשורת לשטוף מותנית התא עם 1x PBS. הוספת 500 μL מחומם מראש מדיה iCLM לכל גם צלחת 24 באר.
5. חלף תקשורת iCLM כל 2 - 3 ימים. צלחת תהליך 14 ימים לאחר אינדוקציה ויראלי עבור immunocytochemistry (ICC) ניתוח של תכנות מחדש של הלב.

3. Immunostaining של MEFs לתכנות מחדש

14-ימים-אינדוקציה פוסט, לשאוב התקשורת בזהירות.
יש לשטוף היטב עם כל 300 μL של PBS 1x קר כקרח. לשאוב פתרון עודף.
תקן תאים עם 250 μL של paraformaldehyde 4% (PFA) פתרון לכל גם צלחת 24 באר. דגירה 15 דקות ב RT.
הערה: קבוע התאים ניתן לאחסן PBS ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1 - 2 שבועות לפני מכתים.
תאים Permeabilize ידי x3 בארות כביסה עם 300 μL 0.1% PBS-TritonX 100 (PBST). דגירה 5 דקות ב RT בין שוטף. לשאוב פתרון עודף לאחר לשטוף האחרון.
בלוק 10דקות ב RT עם הצפת 1x יוניברסל בלוק ב 300 μL / טוב.
הכן חיץ מכתים (ICC): הוסף 1: 1 של PBS 1x ו 1x יוניברסל חסימת חיץ. מדולל נוגדנים עיקריים במאגר מכתים ICC דגירת נוגדני הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. עיין בסעיף חומר דילולים מומלצים.
1. כתם זוג אחד של שקופיות עם α-actinin עכבר, עוף αGFP וארנב Nppa עבור IPM והזדהות IAM.
2. הכתם זוג אחד של שקופיות עם-actinin α העכבר, עוף αGFP וארנב Myl2 לזיהוי IPM ו IVM.
למחרת, לשטוף x3 בארות עם 300 μL 0.1% PBST. דגירה 5 דקות ב RT בין שוטף. לשאוב פתרון עודף לאחר לשטוף האחרון.
כן דילולי הנוגדנים משני במאגר מכתים ICC. עיין בסעיף חומר דילולים מומלצים. דגירה נוגדנים משני 1 שעות ב RT, מוגן מפני אור.
1. כתם כל השקופיות עם antibodie משני הבאs: עכבר Alexa-555, עוף Alexa-488, ארנב Alexa-647.
לשטוף x3 בארות עם 300 PBST 0.1% μL. דגירה 5 דקות ב RT בין שוטף. להגן מפני אור.
להוסיף 2.4 μL של התקשורת הרכבה המכיל 1.5 מיקרוגרם / מ"ל של 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לשקופית מיקרוסקופ זכוכית. מוציאים בזהירות את coverslip מהבאר של צלחת 24 גם, להסיר פתרון עודף, ולהעביר לשקופית זכוכית עם התקשורת גובר. לחץ בעדינות את coverslip להסיר נפח אוויר עודף.
מגלשות חותמות עם לק העדיף או איטום פלסטיק. חנות רכובה שקופיות ב 4 ° C המוגנים מפני אור.

זיהוי 4. של תת לב באמצעות מיקרוסקופ Confocal

הערה: עבור הדמיה, מיקרוסקופ confocal מצויד לפחות 2 גלאי פלורסנט מסוגל זיהוי רפאים ב 405, 488, 555, ו 639 אורכי גל nm הוא הכרחי על מנת לזהות iPMs, איימס, ו iVMs. iMAGתאי דואר באמצעות תוכנית-Apochromat 20X / 0.75 אובייקטיבי או טוב יותר. באמצעות תוכנת ניתוח תמונה של היצרן, סריקת תמונות זום יכול להשיג תמונות באיכות טבילת 40X-שמן.

תמונה הספרייה: לקחת תמונות של 8 סיביות עם DAPI, Alexa-488, Alexa-555, וערוצי Alexa-647 (ch.). פיקסל להתעכב זמן של 6 שניות, גודל מסגרת 1024, צעד בתור 2, והעמיד ממוצע של 2 מספיק עבור תמונות ברזולוציה גבוהות.
עבור כל שקופית, להתחיל מקצה אחד ולהתחיל סריקה למעלה ולמטה בערוץ ניאון אדום (ch.) עבור-actinin α ⁺ תאים sarcomere ⁺ (עיין איור 3 ואיור 5A לדוגמאות). פסי sarcomere קלים יותר לזהות ויזואלית את אורך גל 555 ננומטר.
1. ברגע α-actinin ⁺ תא sarcomere ⁺ זוהה, לעבור CH ירוק. ולשמור פתק, ככל שהיא חיובית (IPM). Switch למחשב להעריך את פרק 647 מרחיקות אדום. (IAM או IVM).
  הערה: תאים שאינם α-actinin ⁺ / sarcomere ⁺ / Hnc4-GFP ⁺ / Nppa ^- / Myl2 ^- מיועדים iPMs. ביטוי של GFP יהיה לראות ברחבי התא (איור 4 א).
2. מגלשות הכתם עם-actinin α (עכבר Alexa555), Hcn4-GFP (עוף-Alexa488), Nppa (ארנב-Alexa647), ו DAPI. תאים הם α-actinin ⁺ / sarcomere ⁺ / Hnc4-GFP ^- / Nppa ⁺ הם IAM. מכתים Nppa יופיע perinuclear ו punctate (איור 4B).
3. מגלשות הכתם עם-actinin α (עכבר Alexa555), Hcn4-GFP (עוף-Alexa488), Myl2 (ארנב-Alexa647). תאים חיוביים-actinin α ⁺ / sarcomere ⁺ / Hnc4-GFP ^- / Myl2 ⁺ הם iVMs. מכתים Myl2 יפגין צורה מפוספסת לאורך נימת sarcomere. בשל וריאציות באיכות מכתים והמטוס-Z, תלמים לא תמיד גלוי בקלות (איור 4C).

= "Jove_title"> 5. קְבִיעַת כָּמוּת

הערה: על מנת להעריך את המספר האמיתי של MEFs לתכנות מחדש באופן פוטנציאלי, 2 בארות צלחת 24 גם הם זורעים במקביל הבארות הניסיוניות נקצרות יום אחד לאחר הציפוי. המספר הכולל של תאים מצופה מכן נקבע על ידי חישוב ממוצע שתי הבארות. זה הופך את התאים הכוללים בפועל המצופים (aTotal).

sarcomere ⁺
1. ראייה לבדוק כל תא על coverslip עבור-actinin α נכונה ⁺ / sarcomere ⁺ (לוחות מימין איור 3) ולהקליט (איור 5 ב-ט).
2. לסדר בטבלה את המספר הכולל של-actinin α ⁺ / sarcomere ⁺ על כל coverslip ומתחלקים על ידי התאים הכולל בפועל מצופה (aTotal) (איור 5 ב-iii). לדוגמא, אם aTotal = 12,500 תאים, ו -100 תאים היו אלפא-actinin ⁺ / sarcomere ⁺ אז, 0.8% של MEFs המצופה היו לתכנות מחדש. ממוצעניסוי reprograming יניב 1% α-actinin ⁺ / sarcomere ⁺ תאים (איור 5 ג).
סוג משנה ⁺
הערה: לקבלת השלבים הבאים, עיין איור 5 ב / C עבור זרימת עבודה כימות נציג iCLM. בקצרה, לכל sarcomere ⁺ תא, לסדר בטבלה אם הוא ייחודי עבור תת סוג (איור 5 ב-ט). חישוב סוג משנה% (איור 5 ב-iii) על ידי חלוקת מספר התאים תת סוג ⁺ מעל sarcomere הממוצע ⁺ תאים x 100 (איור 5 ב-ט). כדי לחשב את היעילות המוחלטת% תת סוג (איור 5 ב-ד), חלק את המספר תת סוג ⁺ תא מ איור 5 ב-i במספר הכולל של תאים הזורעים x 100 (איור 5 ב-ii).
1. עבור כל אחת actinin-α ⁺ / sarcomere ⁺ תאים, להעריך אם הם GFP ^+, Nppa ^+, או Myl2 +.
2. לסדר בטבלה המספר הכולל של α-actinin ⁺ / sarcomere ⁺ / Hnc4-GFP ⁺ / Nppa ^- / Myl2 ^-, actinin ⁺ / sarcomere ⁺ / Hnc4-GFP ^- / Nppa ^_+, ו α-actinin ⁺ / sarcomere ⁺ /-GFP Hnc4 ^- / Myl2 ⁺ תאים (איור 5 _ב-ט).
3. כדי לחשב את האחוז כל תת-סוג, לחלק את מספר תאי סוג משנה ⁺ במספר הכולל של α-actinin ⁺ / sarcomere ⁺ תאים כי גם להכפיל 100. GHMT מייצר iPMs, איימס, ו iVMs בערך יחסים שווים (איור 5B-iii).
4. כדי לחשב את מספרם המוחלט של תת-סוג ⁺ תאים, לחלק את המספר הכולל של תת-סוג ⁺ תאים עבור תנאי הניסוי ידי aTotal ולהתרבות על ידי 100 (איור 5 ב-ii). ביום iPMs הממוצע מייצג 0.3% מכלל אוכלוסיית התא הנגוע הכוללת, איימס 0.3%, ו0.25% iVMs (איור 5 ב-ד).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניצול של העכבר הכתב PM-ספציפי, פיתחנו אסטרטגיה immunostaining זמנית לזהות מיוציטים אנדוגני מגוונים כמו מתואר באיור 1. בעקבות צעדי תכנות מחדש שמוצגים באיור 2, אינדוקציה של CMS ספציפי תת סוג ניתן לאתר מוקדם ככל יום 4 ^21, אם כי שיעור נמוך. במשך היום 14, הניסוי ניתן לעצור שלהם ונבחנת לגביהם ארגון sarcomere (איור 3) וסוג משנה-מפרט (איור 4). איור 5

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המחקר הנוכחי מספק אסטרטגיה ישיר תכנות מחדש לגיור של MEFs לתוך קבוצה מגוונת של תת הלב באמצעות ביטוי בתיווך רטרו-וירוס של שעתוק לב גורמי Gata4, Mef2c, Tbx5, ו Hand2 (GHMT). שימוש בגישת immunostaining זמנית בשילוב עם עכבר כתב PM-ספציפי, אנו מסוגלים לזהות IAM, iVMs, ו iPMs ברזולוצית תא בודד. כזה assay מאפשר עבור ניסוי במערכת במבחנה מסוגלת לבודד את תרומתם של גורמי שעתוק פרט כלפי מגוון תת סוג ופיתוח sarcomere. במקביל, זה יכול להביא תובנה גורמי שעתוק חדשים או מולקולות קטנות כי ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

A.F.-P. נתמך על ידי מלגת המחקר לתארים מתקדמים של הקרן הלאומית למדע במסגרת מענק מס' 2015165336. N.V.M נתמך על ידי מענקים מה-NIH (HL094699), קרן Burroughs Wellcome (1009838) ו-March of Dimes (#5-FY14-203). אנו מודים ליאנג-ג'ה נאם, כריסטינה לובצ'יק ומינוטי בהקטה על תרומתם החשובה לפיתוח פרוטוקולים וניתוח נתונים. אנו מודים גם לג'ון שלטון על הקלט הטכני היקר ולחברי מעבדת מונשי על הדיון המדעי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM	Sigma	D5796	רכיב של מדיה iCLM, מדיה Plat-E, פיברובלסטים ומדיה טרנספקציה
מדיום 199	Thermo Fisher Scientific	11150059	רכיב של מדיה iCLM
סרום בקר עוברי (FBS)	Sigma	F2442	רכיב של מדיה iCLM, מדיה Plat-E, פיברובלסטים ומדיה טרנספקציה
אינסולין-טרנספרין-סלניום G	תרמו פישר סיינטיפיק	41400-045	רכיב של מדיה iCLM
תמיסת ויטמין MEM	Thermo Fisher Scientific	11120-052	רכיב של מדיה iCLM
חומצות אמינו MEM	Thermo Fisher Scientific	1601149	רכיב של מדיה iCLM
חומצות אמינו לא חיוניות	Thermo Fisher Scientific	11140-050	רכיב של מדיה iCLM
אנטיביוטיקה-אנטימיקוטיקה	תרמו פישר 15240062 מדעי		רכיב של תוסף מדיה iCLM
B-27	תרמו פישר 17504044		מדעי רכיב של מדיה iCLM
סרום סוס מומת בחום	תרמו פישר מדעי	26050-088	רכיב של מדיה iCLM
NaPyruvate	Thermo Fisher Scientific	11360-70	רכיב של מדיה iCLM
פניצילין/סטרפטומיצין	תרמו Fisher Scientific		1514022 רכיב של מדיה Plat-E ומדיה פיברובלסטים
Puromycin	Thermo Fisher Scientific	A11139-03	רכיב של מדיה Plat-E
Blasticidin	Gemini Bio-Products	400-128P	רכיב של מדיה
Plat-E Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050-061	רכיב של מדיה פיברובלסטים
סריקת לייזר קונפוקלית LSM700	Zeiss		לניתוח קונפוקלי
FuGENE 6 מגיב טרנספקציה	Promega	E2692	מגיב טרנספקציה
Opti-MEM סרום מופחת בינוני	תרמו פישר סיינטיפיקציה	31985-070	מגיב טרנספקציה
Polybrene	Millipore	TR-1003-G	מגיב אינדוקציה. יש להשתמש בריכוז סופי של 8 μ M/mL
Platinium-E (PE) קו תאי פקגין רטרו-ויראלי, Ecotropic	CellBiolabs	RV-101	קו תאי פאקקינג רטרו-ויראלי
טריפסין 0.25% EDTA	Thermo Fisher Scientific		עבור MEFs ו-Plat-E דיסוציאציה
של עכבר אנטי ואלפא;-אקטינין (שיבוט EA-53)	Sigma	A7811	נוגדן לניתוח קונפוקלי. השתמש ב-1:200
עוף אנטי-GFP IgY	Thermo Fisher Scientific	A10262	נוגדן לניתוח קונפוקלי. לשימוש ב-1:200
Rabbit Pab anti-NPPA	נוגדן AP8534A אבג'נט		לניתוח קונפוקלי. לשימוש ב-1:400
Rabbit Pab anti Myl2 IgG	נוגדן ProteinTech	10906-1-AP	לניתוח קונפוקלי. השתמש בתמיסת Vectashield בשעה 1:200
עם DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Vector Labs	H-1500	צבע לניתוח קונפוקלי
Superfrost Plus שקופיות מיקרוסקופ	Thermo Fisher Scientific	12-550-15	25 x 75 x 1.0 מ"מ
BioCoat Fibronectin 12 מ"מ	NeuVitro Corp	GG-12-1.5	כיסויים לניתוח קונפוקלי
100 μ מסננת תאים m	תרמו פישר סיינטיפיק	08-771-19
0.45 μ m מסנני מזרקים SFCA 25 מ"מ	תרמו פישר מדעי	09-740-106	לסינון וירוסים
6 מ"ל מזרקים	Covidien	8881516937	לסינון וירוסים
עז נגד עוף IgY (H& L) A488	Abcam	AB150169	נוגדן משני לניתוח קונפוקלי. לשימוש ב-1:400
חמור נגד ארנב A647 IgG(H+L)	Thermo Fisher Scientific	A31573	נוגדן משני לניתוח קונפוקלי. השתמש ב-1:400
עז נגד עכבר IgG(H+L) A555	Thermo Fisher Scientific	A21422	נוגדן משני לניתוח קונפוקלי. לשימוש ב-1:400
Triton X-100	Sigma	93443-100ml	לחדירות תאים
PBS של Dulbecco ללא CaCl₂ ו-MgCl₂ (D-PBS)	Sigma	D8537
Power Block 10x מגיב חסימה אוניברסלי	Thermo Fisher Scientific	NC9495720	לדלל ל-1x ב-H₂O
16% תמיסה מימית פרפורמלדהיד (PFA)	Electro Microscopy Sciences	15710	שימוש ב-4% מדולל ב-dH₂O
6 ס"מ& צלחות	אולימפוס	25-260
צלחות 6 בארות	Genesee Scientific	25-105
צלחות 24 בארות	Genesee Scientific	25-107
10 ס"מ כלי תרבית רקמות	קורנינג	4239
15 ס"מ כלי תרבית רקמות	תרמו פישר סיינטיפיק	5442
15 מ"ל צינורות חרוטיים	קורנינג	4308
50 מ"ל צינורות חרוטיים	קורנינג	4249
0.4% תמיסה כחולה טריפאן	סיגמא	T8154	לכדאיות
אתיל אלכוהול 200 הוכחה	תרמו פישר מדעי	7005
אקונומיקה	תרמו פישר מדעי	6009

מקורות

Sissman, N. J. Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology. Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).
Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6 (11), 826-835 (2005).
Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (24), 8850-8855 (2014).
Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6 (239), 239rv231(2014).
Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1 (3), 235-247 (2013).
Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (38), 11864-11869 (2015).
Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nat Commun. 6, 8243(2015).
Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application. Circ Res. 113 (1), 13-15 (2013).
Atkinson, A., et al. Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks. J Mol Cell Cardiol. 51 (5), 689-701 (2011).
Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L. Atrial cardiomyocyte calcium signalling. Biochim Biophys Acta. 1813 (5), 922-934 (2011).
Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. Establishment of the mouse ventricular conduction system. Cardiovasc Res. 91 (2), 232-242 (2011).
Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
Conner, D. A. Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
Ichim, C. V., Wells, R. A. Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation. J Transl Med. 9, 137(2011).
Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nat Commun. 5, 5807(2014).
Muraoka, N., Ieda, M. Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis. Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).
Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. , (1997).
Bass, G. T., et al. Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy. J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

GHMT

הערכה תת סוגי Cardiomyocyte בעקבות תמלול פקטור בתיווך תכנות מחדש של פיברובלסטים עכבר עובריים