מאמר שיטה

פרוטוקול טיהור HPLC המותאמים כי תשואות גבוהות טוהר עמילואיד בטא 42 ו עמילואיד בטא 40 פפטידים, מסוגל גיבוש oligomer

DOI:

10.3791/55482

⸱

27 במרץ 2017

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of California, Santa Cruz

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בזאת אנו מדווחים על פרוטוקול טיהור HPLC המותאמים כי התשואות בטא עמילואיד טוהר גבוהה 42 (Aβ42) ו עמילואיד בטא 40 (Aβ40) פפטידים, מסוגל היווצרות oligomer. בטא עמילואיד הוא פפטיד צבירה נוטה, הידרופובי מאוד מעורב מחלת אלצהיימר. אופי amyloidogenic של הפפטיד עושה הטיהור שלה אתגר.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פפטידים עמילואידוגניים כגון עמילואיד בטא (Aβ) המעורב במחלת אלצהיימר, יכולים להוות אתגר משמעותי כאשר מנסים להשיג חומר בטוהר גבוה. כאן אנו מציגים פרוטוקול טיהור HPLC מותאם לייצור פפטידים של עמילואיד בטא 42 (Aβ42) ועמילואיד בטא 40 (Aβ40) בטוהר גבוה. מצאנו כי השילוב של פאזה נייחת של פולי הידרופובי (סטירן/דיוויניל-בנזן) הזמין מסחרית, פאזה הפוכה במעבדת פולימר - סטירנדיוויניל בנזן (PLRP-S) בתנאי pH גבוהים, מאפשר השגת טוהר גבוה (>95%) Aβ42 בריצה כרומטוגרפית אחת. הטיהור ניתן לשחזור מאוד וניתן לתקן אותו הן לתנאי הכנה למחצה והן לתנאים אנליטיים בהתאם לכמות החומר המבוקש לטיהור. ניתן ליישם את הפרוטוקול גם על פפטיד Aβ40 בהצלחה זהה וללא צורך בשינוי השיטה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת האלצהיימר היא הפרעה ניוונית של מערכת העצבים כי תופעות למעלה מ -35 מיליון בני אדם ברחבי העולם. 1 מעורב מאוד ב שתחילתה והתפתחותה של המחלה, היא בטא עמילואיד צבירה נוטה, הידרופובי מאוד פפטיד (Aβ). 2 Aβ נע בין 36 כדי 43 חומצות אמינו אורך, עם זאת, הוא חשב כי גרסת חומצה 42-אמינו, עמילואיד בטא 42 (Aβ42), הוא הצורה הרעילה ביותר של החלבון. 3 זה נובע לרוב ליכולת של Aβ42 להיווצר קושי diffusible, מינים oligomeric כי הם האמינו להיות ישויות הנוירו במיוחד. 4 על מנת לקדם את ההבנה שלנו של הפפטיד Aβ, זה הכרחי כדי להשיג חומר טוהר גבוה באופן שיגרתי.....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. preparative טיהור HPLC של Aβ40 או פפטיד Aβ42

  1. הכן את החוצצים הבאים לטיהור HPLC.
    1. הכן חיץ (20 מ"מ NH 4 OH) על ידי הוספת 1.3 מ"ל של NH 4 OH (פתרון 28%) 1,000 מ"ל מים ultrapure.
    2. הכן חיץ B (אצטוניטריל 80% עם 20 מ"מ NH 4 OH) על ידי הוספת 1.3 מ"ל של NH 4 OH (פתרון 28%) לפתרון של 800 מ"ל של אצטוניטריל HPLC כיתה ו -200 מ"ל מים ultrapure.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטיהור של הפפטיד Aβ42 באמצעות שילוב של השלב הנייח PLRP-S לבין תוצאות שלב ניידות גבוהה pH ביצירת פסגה חדה, נפתרה לייצור הפפטיד Aβ בכל זמן שמירה בין 72 ו -74 דקות (איור 2 ג). אישור של זהות שיא נעשה באמצעות ספקטרומטריית מסה הזרקה ישירה של eluent שנאספו. Eluent ניתן לאחסן ב -20 ° C בתמיסה עד 12 שעות. תקופות ארוכות יותר של אחסון עלולות לגרום חמצון של החלבון. כדי לבודד את הפפטיד המטוהר, את eluent הוא פלאש קפוא בחנקן נוזל lyophilized. HPL.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיהור HPLC של הפפטיד Aβ תלויה מאוד על הבחירה של שני השלב הנייח המועסקים בתחום הטיהור בשלב הנייד נבחר כדי elute הפפטיד. הנקודה איזואלקטרית הנמוכה של הפפטיד ואת הנטייה גבוהה עבור צבירה לדקלם תנאי chromatographic מסורתיים להפרדת חלבונים הידרופובי (C4 או בשלב נייח C8 מצמיד עם eluent הנייד חומצי) מאתגר, עם הפפטיד Aβ משחרר כמו נקבה ממושכת, שאינו נפתר שיא (איור 2 א).

כדי לעקוף בעיה זו, בשלב נייח-S PLRP,.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים אין לי מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות Agilent לקבלת הסיוע הטכני שלהם. קייט מרקהאם ורפאל פלומינו מזוכים לעזרה הראשונית שלהם בסינתזה וטיהור של הפפטיד Aβ וד"ר Hsiau-וויי לי הוא הודה על עזרתו בהכנת איור 1 של כתב היד.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
משאבת רבע Agilent 1260 Infinity IIAgilentG7111Bhttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump
Agilent 1260 Infinity II גלאי אורך גל משתנה כפולAgilentG7114Ahttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector
מזרק ידני Agilent 1260 Infinity II מצויד בלולאת דגימה של נירוסטה 10 מ"לAgilent0101-1232http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
מזרק ידני Agilent 1260 Infinity II מצויד ב-20 ומיקרו; L לולאת מדגם נירוסטהAgilentG1328Chttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
טבעת מעמד תושבת הרכבהAgilent1400-3166
Agilent PLRP-S 300 Å 5  ומיקרו; m 4.6 x 250 מ"מ (אנליטי)AgilentPL1512-5501http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features
Aβ 42 או Aβ 40 פפטידמסונתז בתוך הבית באמצעות סינתיסייזר פפטידים אוטומטי CEM liberty.
אמוניום הידרוקסיד (NH<תת>4OH, תמיסה של 28%)פישרסיינטיפיקA669-500
אצטוניטרילפישר סיינטיפיקA998-4
מים בדרגת HPLCפישר סיינטיפיקW5-4
פלקון 50 מ"ל צינור צנטריפוגה חרוטיפישר סיינטיפיק14-954-49A
Supelco PEEK מתאים מקשה אחת אטום, חבילה של 5 eaסיגמא-אולדריץ'Z227250
Normject 5  מזרק סטרילי ccFisher Scientific1481729
16 מד SS מחטRheodyne3725-086

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's Disease. N. Engl. J. Med. 362 (4), 329-344 (2010).
  2. McGowan, E., et al. Aβ42 Is Essential for Parenchymal and Vascular Amyloid Deposition in Mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
  3. Gong, Y., et al. Alzheimer's disease....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

pH

מאמרים קשורים