In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג&#39;ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

Stefanie Dudczig; Peter D. Currie; Lucia Poggi; Patricia R. Jusuf

doi:10.3791/55490

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג'ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

7.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55490

⸱

22 במרץ 2017

Stefanie Dudczig¹^,² , Peter D. Currie² , Lucia Poggi³ , Patricia R. Jusuf¹^,²

¹School of Biosciences, The University of Melbourne, ²Australian Regenerative Medicine Institute (ARMI), Monash University, ³The David J Apple Center for Vision Research, Department of Ophthalmology, Heidelberg University

במאמר זה

סיכום

מעקב חיה של אבות רשתית WT בודדים רקע גנטי מובהק מאפשר הערכה של תרומת איתות שאינו אוטונומי התא במהלך הנוירוגנזה. כאן, שילוב של מציאת גן, דור הכימרה באמצעות השתלה העובר בתחום הדמית confocal זמן לשגות vivo נוצל למטרה זו.

תקציר

החוזק הגנטי וטכני הפכו את חוליות דג הזברה אורגניזם מודל מפתח אשר ההשלכות של מניפולציות הגן ניתן לייחס in vivo לאורך כל תקופת ההתפתחות המהירה. ניתן ללמוד מספר רב של תהליכים כולל התפשטות תאים, ביטוי גנים, נדידת תאים ומורפוגנזה. חשוב לציין, הדור של מפלצות באמצעות השתלות יכול להתבצע בקלות, ומאפשר תיוג פסיפס ומעקב של תאים בודדים תחת שפעת הסביבה המארחת. לדוגמא, על ידי שילוב של מניפולציות גן פונקציונליות של עובר המארח (למשל, באמצעות microinjection morpholino) ו הדמיה לחיות, את ההשפעות של חיצוני, אותות nonautonomous תא (המסופקים על ידי הסביבה המהונדסת הגנטי) על תאי תורם מושתלים בודדים ניתן להעריך. כאן אנו מדגימים כיצד גישה זו משמשת כדי להשוות את התחלתה של ביטוי transgene ניאון כמדד עיתוי determin גורל התאation בסביבות מארח גנטי שונה.

במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול עבור microinjecting עוברי דג זברה כדי לסמן תאים תורמים לגרום מציאת גן בעוברים מארחים, תיאור של טכניקת ההשתלה השתמשה כדי ליצור עבר chimeric, ואת הפרוטוקול להכנה והפעלה בתוך confocal הזמן לשגות vivo הדמיה של עוברים מרובים. בפרט, ביצוע הדמיה multiposition הוא קריטי כאשר משווים עיתוי אירועים כגון התפרצות של ביטוי גנים. זה דורש איסוף נתונים מתוך שליטה מרובה ועובר ניסיוני מעובד בו זמנית. גישה כזו ניתן להרחיב בקלות ללימודים של השפעות חיצוניות בכל איבר או רקמה של בחירה נגישה לחיות הדמיה, ובלבד השתלות ניתן לכוון בקלות על פי מפות גורל עובריות הוקמו.

מבוא

היכולת לחזות תהליכים התפתחותיים חשובים בתוך חוליות vivo ב תרמה להפיכת דג הזברה כמודל מפתח ללימוד תנאים נורמלים ומחלות (הנסקרת ב ^{^1,} ^2). בפרט, הרשתית העצבית היא חלק בלתי נגיש של מערכת העצבים המרכזית. הרשתית משאיל את עצמו לבצע מחקרים בקלות הנוירוגנזה בשל מבנהו מאורגן, אך פשוט יחסית, וסוגים נוירון שלה שמור ביותר על פני מינים בעלי חוליות ^3. דינמיקה של התנהגויות הסלולר כגון התפשטות, יציאת מחזור התא, חלוקת תא סימטרית, מפרט גורל, בידול, והיווצרות מעגלים עצבית ניתן בעקבות לאורך כל התהליך של retinogenesis, אשר הושלם ברשתית המרכזית של דג הזבר....