תא שלם תיקון מהדק הקלטות עבור קביעת electrophysiological של יון סלקטיביות ב Channelrhodopsins

סיכום

מאמר זה מתאר כיצד נקבעת סלקטיביות היונים של channelrhodopsin באמצעות רישומים אלקטרופיזיולוגיים של Patch-Clamp של תאים שלמים באמצעות תאי HEK293. כאן, מודגם ההליך הניסיוני לחקירת סלקטיביות כלוריד של תעלה רודופסין סלקטיבי של אניונים. עם זאת, ההליך ניתן להעברה לתעלות רודופסינים אחרים בעלי סלקטיביות מובחנת.

תקציר

במהלך העשור האחרון, channelrhodopsins הפך חיוני במחקר neuroscientific שבו הם משמשים כלים לא פולשני לתפעל תהליכים חשמליים בתאי היעד. בהקשר זה, סלקטיביות יון של channelrhodopsin הוא בעל חשיבות מיוחדת. מאמר זה מתאר את החקירה של סלקטיביות כלוריד עבור לאחרונה זיהו anion-channelrhodopsin ניטור של Proteomonas sulcata באמצעות הקלטות קליפ תיקון אלקטרו על תאים HEK293. ההליך הניסויי למדידת צילומי האור הנשלטים על ידי האור דורש תמסורת מהירה - מונוכרומטית - מקור אור צמוד למיקרוסקופ של תצורת טלאי קונבנציונאלי. ההליכים ההכנה לפני הניסוי מתוארים הכנת פתרונות שנאגרו, שיקולים על פוטנציאל צומת נוזלים, זריעה transfection של תאים, ו משיכת טפיחות תיקון. ההקלטה בפועל של יחסי המתח הנוכחיS כדי לקבוע את הפוטנציאל היפוך עבור ריכוזי כלוריד שונים מתרחש 24 שעות עד 48 שעות לאחר transfection. לבסוף, נתונים אלקטרופיזיולוגיים מנותחים ביחס לשיקולים תיאורטיים של הולכה כלוריד.

מבוא

Channelrhodopsins (CHR) הם ערוצי יון אור מגודלים המתרחשים בנקודת העין של אצות ירוקות נעות, ומשמשים כמחזירים ראשוניים עבור פוטוטקסיס ותגובות פוביות ¹ . מאז התיאור הראשון שלהם בשנת 2002, ChRs סללו את הדרך עבור השדה המתעוררים של optogenetics ויכול להיות מיושם במגוון של תאים נרגשים למשל בתוך שרירי השלד, הלב, או את המוח ^{3 , 4 , 5} . ביטוי של CHRs בתאי היעד גורם חדירות אור יון לשליטה של ​​התא בהתאמה. בהקשר נוירוני, זה מאפשר הפעלה ^{6 , 7 , 8} או עיכוב ^{9 , 10} של פעולה פוטנציאליים (AP) ירי - בהתאם יון שנערך - עם הזמן המרחבידיוק של אור המדגיש כיצד סלקטיביות יון של גרסה ChR קובעת יישום optogenetic שלה.

גידולי CHR הראשונים שהתגלו מ - Chlamydomonas reinhardtii ו- Volvox carteri חדירים לפרוטונים, אך גם לקטיונים מונוולנטיים כמו נתרן, אשלגן, ובמידה פחותה גם לקטיונים דו-קלים כגון סידן ומגנזיום ^{11 , 12 , 13} . כיום, יותר מ -70 קטיונים טבעיים (cCR) ^{14 , 15 , 16 , 17} וריאנטים מהונדסים שונים ^{18 , 19 , 20} עם מאפיינים שונים כגון גודל פוטו, רגישות ספקטרלית, קינטיקה, סלקטיביות קטיון זמינים. בעוד בתחום מדעי המוח, CCRs אששימשו להפעלת תאים ומפעילי APPS, משאבות מונעות על ידי אור, היו היריבים הזמינים רק עבור נוירונים משתיקים במשך שנים. בשנת 2014, שתי קבוצות הראו בו זמנית כי CCRs ניתן להמיר anion-conductrhopsops ניצח אניון (ACRs) על ידי שינוי של הקוטביות לאורך יון putative ניצוח באמצעות הנדסה מולקולרית ^{9 , 21} . לאחר מכן, ACRs טבעיים זוהו בכמה קריפטופיטים ^{22 , 23 , 24} . והכי חשוב, הפעלה קלה של ACRs מתווכת זרמי כלוריד נוירונים מבוגרים המאפשר עיכוב של הפעילות העצבית בעוצמות האור הרבה יותר נמוך מאשר משאבות מיקרוביאליות כי רק הובלה יחיד חיובי לכל פוטון נספג.

פעילות ChR ניתן לטפל ישירות על ידי אלקטרו קליפ הקלטות אלקטרומגנטית של זרמים האור המושרה בתאים HEK293. מהדק התיקוןהטכניקה פותחה במקור בסוף שנות ה -70 ²⁵ ושיפר עוד יותר על ידי Hamill et al. , המאפשר הקלטה של ​​ישות של זרמים מתא קטן (מצב תא שלם) עם רזולוציה גבוהה הנוכחי שליטה ישירה של מתח קרום ²⁶ . יישומי בתרבית תאים, טכניקה זו מספקת שליטה מדויקת של תנאי ההקלטה יונית כמו גם חשמל, ומאפשר לימוד סלקטיביות יון יחד עם התרומה היחסית של יונים לסך הנוכחי. כאן אנו מדגימים את בדיקת סלקטיביות יון עבור anion מנצח transrhodopsin של Proteomonas sulcata (פס ACR1) ^{22 , 23} באמצעות הקלטה של ​​יחסי מתח הנוכחי תחת ריכוזי כלוריד תאיים שונים כדי להוכיח מוליכות כלוריד גבוהה.

פרוטוקול

איור 1: תיקון ההתקנה של מהדק. (1) אחרים - אחרים - מכשור ספורטיבי (1) מקורות אור, (2) סיבים אופטיים, (3) תריס ניתנת לתכנות, (4) , (10) כלוב faraday, (11) מיקרוסקופ הבמה, (12) כניסת זלוף, (13) שקע זלוף, (14) חדר הקלטה, (15) חיישן ברמה נוזלים, (16) אלקטרודה אמבטיה עם גשר אגר, (19) מיקרוסקופ הפוכה, (21) מיקרוסקופ הפוכה, (21) מיקרוסקופ הפוכה, (21) מנורת מיקרוסקופ, שסתום, (25) שולחן אנטי רטט, (26) מצלמה CCD. ( א ) תמונות ( ב ) ייצוג סכמטי של ההתקנה. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של tאת דמותו.

1. הגדרה לפני ההקלטות

	תוֹך.	.1	תוספת
	כלוריד גבוה	כלוריד גבוה	כלוריד נמוך
	ג [mM]	C [mM]	C [mM]
Na-ASP	0	0	140
NaCl	110	140	0
KCl	1	1	1
CsCl	1	1	1
CaCl 2	2	2	2
MgCl 2	2	2	2
HEPES	10	10	10
EGTA	10	0	0
PH	7.2	7.2	7.2
אוסמולריות	290 mOsm	320 mOsm	320 mOsm

טבלה 1: הרכב יוני של פתרונות שנאגרו. הרכב של תאים תאיים (תוך) ו תאיים (תוספת) buffers עבור כלוריד סלקטיביות ניסויים בתאי HEK. קיצורים בשימוש: אתילן גליקול tetraacetic חומצה (EGTA), 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES) ו aspartate (ASP). כל הריכוזים נמצאים mM.

1. הכן את פתרונות ההקלטה בריכוז יון, כפי שמצוין בטבלה 1.
   1. הכן 15 מ"ל של 2 פתרונות מלאי M במים ultrapure עבור MgCl ₂ , CaCl ₂ , KCl ו CsCl.
   2. לשקול את מרכיבי מוצק עבור 100 מ"ל של תאיים ו500 מ"ל של הפתרונות שנאגרו תאיים בהתאם לטבלה 1 לתוך כוסות נפרדות ולהוסיף את הכמות המתאימה של פתרונות המניות מוכן לאחר מכן. לדוגמה, עבור חיץ תאיים, השתמש 0.3803 גרם (10 מ"מ) EGTA, 0.2383 גרם (10 מ"מ) HEPES ו 0.6428 גרם (110 מ"מ) NaCl ולהוסיף 100 μL של M ₂ MgCl ₂ ו CaCl ₂ ו 50 μL של 2 M KCl ו CsCl פתרונות המניות.
   3. מוסיפים מים אולטרה ופועלים בזהירות את החומציות באמצעות חומצות ובסיסים, אשר אינם מפריעים למדידה, כלומר אינם מבוצעים על ידי ה- CHR, כגון חומצת לימון ו- N-methyl-D-glucamine (NMG ⁺ ).
   4. התאם את osmolarity ל 290 mOsm עבור תאיים ל 320 mOsm עבור פתרונות תאיים עם גלוקוז.
      הערה: מעט פתרונות היפוכוטיים תוך תאיים מגדילים את שיעור ההצלחה של תיקון.
   5. סטרילי לסנן את כל הפתרונות באמצעות 0.22 מיקרומטר מסננים. פתרונות חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך שבועייםS או להקפיא ב -20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.
2. חישוב הפוטנציאל צומת נוזלי ולהכין פרוטוקולים הקלטה.
   הערה: שינוי ריכוז כלוריד תאיים לאחר קביעת תצורה של תא שלם גורם לצומת נוזלי משמעותי (LJP) שיש לתקן ^{27 , 28} . LJPs ניתן למדוד ישירות או מחושב, כאן האפשרות השנייה משמש. בפרוטוקול זה, תיקון on-line ישמש בדרישה פרוטוקול הקלטה אחת עבור כל חיץ חיצוני. עם זאת, עבור קבוצה גדולה יותר של פתרונות חיצוניים תיקון פוסט של LJP מומלץ להימנע תיקון שקר.
   1. פתח את המחשבון הפוטנציאלי לצומת (JPC) ²⁷ ופתח את הדו-שיח 'ניסוי חדש'. לאחר מכן בחר "תיקון מדידות מהדק". בחר "מדידות התא כולו", "תקן מלח פתרון אלקטרודה" ולהיכנס טמפרטורה של25 ° C. בין כל צעד, קדימה על ידי קבלת הבחירה על ידי לחיצה על כפתור "הבא".
      הערה: הניסויים מבוצעים בטמפרטורת החדר של 25 ° C במעבדה ממוזגת. ודא כי פתרונות חיץ יש טמפרטורת החדר לפני תחילת הניסויים. כדי לשנות את הטמפרטורה המדגם בשלב הדגירה או קאמרית ניתן להשתמש. טמפרטורת אמבט ניתן למדוד לעתים קרובות עם מדחום.
   2. מוסיפים את כל ריבועי אניון וקטיון הפרט של הפתרון pipetted ואת חיץ כלוריד גבוהה על פי הריכוזים המפורטים בטבלה 1 .
      הערה: ה- JPC יחשב LJP של -0.5 mV לתנאי ההתחלה.
   3. לחץ על "פתרון אמבטיה חדש" כדי להזין את הרכב אניוניק קטיוני של חיץ כלוריד נמוך.
      הערה: ה- JPC יחשב כעת LJP חדש של 12.6 mV בהתאם לפתרון ההקלטה החוץ תאגידי.
   4. הכן שני LJP תיקון פרוטוקולים עבורשני תנאי מדידה על ידי הפחתת LJP מחושב מן הפוטנציאל מחזיק מוחל; -0.5 mV עבור גבוה +12.6 mV עבור פתרונות כלוריד חיצוני נמוך. כך פרוטוקולים להתחיל עם -79.5 mV (כלוריד גבוהה) ו -92.6 mV (כלוריד נמוך), בהתאמה כדי להשיג LJP- תוקן החל פוטנציאל ההחזקה של -80 mV בשני המקרים.
      הערה: השלבים הבאים חלים על תוכנת רכישת הנתונים המוזכרת ברשימת החומרים.
   5. פתח את עורך הפרוטוקול בתוכנה הרכישה. עבור לתפריט "מצב" בחר "גירוי אפיזודי" וכולל 7 מטאטא.
   6. עבור לתפריט "Waveform" בעורך וכולל 200 ms תקופה עם 0 mV מחזיק פוטנציאל ואחריו תקופה של 2 עם משתנה פוטנציאל החזקת החל ב -79.5 mV עבור כלוריד גבוהה. כלול "רמת דלתא" של 20 mV עבור התקופה השנייה כדי להגדיל את פוטנציאל החזקה על ידי 20 mV בכל לטאטא.
   7. בתוך הצעדים מתח של waveform edזה להחיל 500 ms תקופה של תאורה עם 540 ננומטר אור (3.10 mW / mm²). לשם כך, שנה את "תבנית הסיביות הדיגיטלית" של התריס המחובר השולט במקור האור כדי להיות פעיל ב - ms 500 לאחר התקופה השנייה המתוארת לעיל (ראה סעיף 1.2.6).
      הערה: עוצמת האור יכולה להשפיע על תכונות ביופיסיקליות של זרמי ערוצים כמו משרעת או אי-פעילות. לכן, צפיפות הספק האור תמיד צריך להיות מדווח. כדי למדוד את עוצמת האור לאחר שעבר את כל אופטיקה ו coverslip, השתמש אופטומטר מכויל. כדי לחשב את צפיפות הספק, לקבוע את השדה המואר של המטרה על ידי מיקרומטר אובייקט ולחלק את עוצמת האור נמדדת על ידי שדה מואר נחוש.
   8. שמור את הפרוטוקול עבור הפתרון כלוריד תאיים גבוהה. לשנות את הפרוטוקול ולהחליף את הרמה הראשונה מחזיק פוטנציאל ידי -92.6 mV (כלוריד חיצוני נמוך). שמור פרוטוקול זה השני כדי למדוד את המצב כלורי נמוך תאיים.
3. ציפוי ליזין של כיסוי זכוכית מחליק לפי פרוטוקול מותאם ²⁹ .
   1. המקום כמה מחליק 100 מחליק בצלחת פטרי זכוכית להוסיף 250 מ"ל HCl (1 N).
   2. מניחים את צלחת פטרי עם כיסוי להחליק על שייקר ליניארי לנער בסל"ד 120 עבור 72 שעות כדי לנקות את מחליק לכסות ולאחר מכן לשטוף עם מים ultrapure לנטרל pH.
   3. משרים אלה בנפח קטן של אתנול 95% לניקוי נוסף.
      הערה: מחליק כיסוי מחליק יכול להיות מאוחסן באתנול 70% לפני שתמשיך. עבודה מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית עבור השלבים הבאים.
   4. באמצעות מבער בונזן ו פינצטה, להבה כל כיסוי להחליק ולהעביר אותו לתוך צלחת פטרי חדש.
   5. דגירה את מכסה זכוכית מחליק עם סטרילי 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​פולי- D- ליזין פתרון לפחות 1 שעות (או לילה) בטמפרטורת החדר תוך רועד עם שייקר ליניארי בסל"ד 150.
   6. שטפו את כיסוי מחליק עם מים ultrapure להסיר עודף poly-D- ליזין.
   7. מורחים את מחליק לכסות על נייר סטרילי להתייבש במשך 10 דקות, ולחשוף אותם לאור UV עבור עיקור (לפחות 20 דקות).
   8. אסוף את החלקים המכסים לתוך צלחת פטרי סטרילית מכוסה בנייר אלומיניום עד לשימוש.
4. הכן DNA של Ps ACR1 הגן התמזגו mCherry באמצעות טכניקות ביולוגיה מולקולרית סטנדרטית.
   1. לשכפל את קודון האדם אופטימיזציה רצף הגן קידוד פס ACR1 לתוך peGFP-C1 פלסמיד (CMV promotor, התנגדות kanamycin) במסגרת עם fluorophore mCherry באמצעות אנזימים הגבלה או שיטות שיבוט הוקמה אחרים.
      הערה: fluorophores אחרים יכולים לשמש גם, אבל הקפד לקבל את המסנן המתאים קובע זמין כדי לצפות הקרינה שלהם תחת מיקרוסקופ ההתקנה.
   2. להפוך את ה- DNA פלסמיד לתוך chemocompetent XL1Blue E. תאים coli באמצעות הלם חום לפי פרוטוקול סטנדרטי צלחת אותם על צלחות אגר (30 מיקרוגרם / mL kanamycin) ³⁰ 22pl לגדל את החיידקים מצופה במשך הלילה על 37 מעלות צלזיוס.
   3. למחרת, לחסן 4 מ"ל lysogeny מרק בינוני בתוספת 30 מיקרוגרם / מ"ל ​​kanamycin עם תאים מושבות בודדות דגירה אותם במשך הלילה ב 37 ° C ו 180 סל"ד בחממה.
   4. לאחר הדגירה לילה, לטהר את ה- DNA פלסמיד מן התרבויות באמצעות ערכת זמין מסחרית (ראה טבלה חומרים) על פי הוראות היצרן.
5. זרע את התאים
   הערה: בצע צעדים תחת מכסה המנוע זרימה למינרית.
   1. מקום עד שלוש ליזין מצופה זכוכית מחליק זה לצד זה בצלחת פטרי 35 מ"מ.
      הערה: לחץ בעדינות על החלק התחתון של התבנית כדי למנוע החלקה זו על זו.
   2. זרע 1.5 x 10 ⁵ תאים HEK ב 2 מ"ל רגיל Dulbecco השתנה הנשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברית (FBS) בכל מנה.
   3. להשלים את כל הרשתית טרנס בריכוז סופי של 1 מיקרומטר. לגדל את התאים לפחות יום אחד לפני שתמשיך עם שלב 1.6.
6. Transinterly transfect את התאים באמצעות lipofection ³¹ .
   1. עבור כל מנה של תאים, להכין פתרון של 2 מיקרוגרם של DNA פלסמיד (כפי שהוכנו בשלב 1.4) ב 250 DML μL ללא FBS ו 6 מגיב transfection μL (ראה טבלה חומרים ).
   2. לאחר 15 דקות הדגירה, בעדינות (dropwise) להוסיף את הפתרון לתאים.
7. הכן גשרים אגר
   1. הוסף 0.75 גרם agarose ל 50 מ"ל תמיסת נתרן סטרילי כלורי (140 מ"מ) ו לפזר אותו על ידי חימום במיקרוגל.
      הערה: 2 - 3 M KCl להכנת גשר אגר מפחית עוד יותר את LJP עקב ריכוז גבוה יותר ( למשל דיפוזיה מתמדת מהגשר) וניידות שווה של K ⁺ ו ^- Clions, אך נמנעה למזער את הדליפה של יון (במיוחד Cl ^- ) לתוך פתרון
   2. מלא 10 טיפים פיפטה μL (או צינור קוטר קטן) עם פתרון agarose נוזלי באמצעות מזרק.
      הערה: הימנע בועות אוויר בגשר.
   3. לאחר גשרים אגר כבר מקורר ומוצק, לאחסן אותם ב סטרילית 140 מ"מ פתרון נתרן כלורי.
8. הכינו הקלטה ו אלקטרודות אמבטיה.
   1. הסר חוטי כסף של אמבטיה הקלטה האלקטרודה של ההתקנה מהדק תיקון.
   2. פולנית החוטים עם נייר זכוכית כדי להסיר כלוריד כסף מניסויים קודמים. לטבול את חוט הכסף נקי ב 3 M KCl ולחבר אותו מוט חיובי של סוללה 1.5 V עבור ציפוי אלקטרוליטי עם כלוריד כסף.
      הערה: ניתן להשתמש באספקת חשמל במעבדה במקום בסוללה.
9. משוך בטמפרטורות נמוך תיקון התנגדות (1.5-3.0 MΩ) מ נימים זכוכית עם משיכה micropipette אש פולנית אותם כפי שתואר על ידי בראון et alLass = "xref"> 33. חנות טפטפות ללא אבק ליום המדידה.
10. הפעל את כל רכיבי ההתקנה כדי לחמם עד טמפרטורת עבודה 30 דקות לפני הקלטות. ודא כי מאגרים נמצאים בטמפרטורת החדר.

2. מדידות סלקטיביות

1. התחל את הקלטות 24 עד 48 שעות לאחר transfection חולף של התאים המתוארים 1.6.
2. במקום אחד לכסות להחליק בתא מדידה וחותמת אותו עם סיליקון כדי למנוע דליפה של חיץ חיצוני. חנות צלחת פטרי עם מחליק אחרים מחליק באינקובטור עבור קבוצה הבאה של ניסויים.
3. בזהירות למלא את החדר עם חיץ תאיים (גבוהה [Cl ^- ]) כדי למנוע ניתוק של תאים, ואז למקם אותו תחת מיקרוסקופ ולהשתמש המטרה 40X להדמיה תא.
4. שים גשר אגר על האלקטרודה אמבטיה ומכניסים אותו לתוך החדר יחד עם חיישן רמת הנוזל ואת השקע זלוף של המטפל באמבטיה.
5. להחליף את לשעברפתרון תאיים פעמיים עם 1 מ"ל של תמיסה חיצונית טריים (גבוהה [CL ^- ]) כדי להסיר תרבות שיורית בינוני מנותקת.
6. תביא את התאים להתמקד ולחפש תא transfected (פלואורסצנטי), אשר צריך להיות מבודד תאים אחרים. השתמש משולש הלהקה להגדיר מסנן אור כתום (590 ננומטר, רוחב פס 15 ננומטר, עוצמת 100%) כדי לעורר לדמיין mCherry.
   הערה: תאים HEK יכול להיות מצורף חשמלית לשכנים שלהם על ידי צמתים הפער ³⁴ וכתוצאה מכך התנגדות הממברנה נמוכה בתצורה של כל התא.
7. מילוי אחד pipettes משוך עם פתרון תאיים ולהסיר בועות אוויר על ידי מרפרף פיפטה כמה פעמים.
8. הר פיפטה על בעל פיפטה ולהחיל כמה לחץ חיובי כדי למנוע clogging של קצה.
9. אתר את קצה פיפטה תיקון מתחת למיקרוסקופ ונווט אותו קרוב לתא באמצעות micromanipulator.
   הערה: השלבים הבאים חלים על aמגבר, רכישת נתונים ותוכנה להערכה המוזכרים ברשימת החומרים.
10. הפעל את "בדיקת הממברנה" בתוכנת רכישת הנתונים וליישם שלב מתח (הדופק הבדיקה, למשל 5 mV עבור 10 אלפיות השנייה, הבסיס ב 0 mV), באופן ידני או אוטומטי באמצעות תוכנה שצוין באמצעות "מצב אמבטיה" בעת הפעלת "מבחן הממברנה" בתוכנה רכישת נתונים.
11. בדוק כי ההתנגדות פיפטה הוא בטווח הרצוי (1.5-3.0 MΩ).
12. אפס קיזוז זרמים על ידי התאמת הפוטנציאל פיפטה על ידי הפיכת הידוק פיפטה לקזז על מגבר תוך כדי עבודה במצב "אמבטיה" של "מבחן הממברנה".
13. יצירת תיקון בתצורה של כל התא ²⁶ .
    הערה: השלבים הבאים דורשים יישום של לחץ חיובי ושלילי הנמסר ליציאת הצד של בעל פיפטה בשימוש. זה יכול להיעשות באמצעות מזרק, דרך חתיכת הפה או אלקטרונית conרגולטור לחץ טרולי. בפרוטוקול זה לחץ חיובי ושלילי מוחל באמצעות חתיכת הפה.
    1. לאט לגשת לתא עם פיפטה תיקון מלמעלה ולהפחית את הלחץ החיובי ממש לפני לגעת בו.
       הערה: כאשר קצה קרוב לתא, ההתנגדות תעלה מעט; זה מסומן על ידי גודל מופחת של הדופק הבדיקה.
    2. לשנות את "מבחן הממברנה" מ "מצב אמבטיה" ל "מצב תיקון" ובכך מחזיק פוטנציאל פוטנציאל הצפוי של התאים הצפוי (-30 ל -40 mV).
    3. במקרים מסוימים תצורת התא המצורפת יוצרת את עצמה לאחר שחרור לחץ חיובי (2.13.1), אם לא, לחול בעדינות לחץ שלילי כדי לסייע היווצרות gigaseal.
       הערה: תצורה המצורפת לתא נקבעה כאשר דופק הבדיקה מצטמצם לשני פסגות קיבוליות קטנות בתחילת ובדופק של הדופק, ועמידות הממברנה נמצאת בטווח GΩ; מתח שלילי עד -60 mV mIght להקל על היווצרות gigaseal.
    4. לפצות את קיבול פיפטה על ידי הפיכת "פיפטה קיבול פיצוי" ידיות כדי לקבל תגובה שטוחה של הדופק הבדיקה.
    5. קרע את התיקון מבלי להרוס את החותם על ידי הפעלת פולסים קצרים של לחץ שלילי או לחץ שלילי עם כוח הולך וגדל, כדי לקבל קונפורמציה שלמה התא.
       הערה: מעבר מוצלח מתא הצמוד לתצורה של כל התא מסומן על ידי עלייה של הפסגות הקיבולות.
    6. החל פיצוי התנגדות סדרה על ידי הגדרת פרמטר שלם תא התאמות פיצוי של מגבר בשימוש עבור clamping מדויק של פוטנציאל הממברנה למתח מחזיק הרצוי.
       1. החלף את "בדיקת הממברנה" למצב "תא שלם", בלוח "פיצוי סדרה סדרה" להפעיל "חיזוי" ו "תיקון" עד 90% הימנעות overshots ו תנודה של תגובה קיבולי, להפוך את כל תאפיצוי מתג ולהתאים פרמטרים תא שלם עם הכפתורים הקדמיים בלוח הקדמי ("קיבולת תא שלם" ו "התנגדות סדרה") של המגבר באופן איטרטיבי כדי להשיג תגובה שטוחה אידיאלי חותם התגובה.
          הערה: לקבלת תיאור מפורט של פיצוי ההתנגדות לסדרה ותיקון, עיין במדריך המגבר או בהנחיה כאשר הליך זה משתנה בין יצרנים שונים.
    7. לאחר הקמת תצורה תא שלם, לחכות לפחות 2 דקות לפני ההקלטה כדי להבטיח החלפה מספקת של פתרון תאיים באמצעות פיפטה תיקון ³⁵ .
14. הקלט אור המושרה זרמים על הפוטנציאל החזקה שונים באמצעות פרוטוקולים שהוגדרו בעבר (ב 1.2).
15. החלף את המאגר תאיים נמוך [CL ^- ] בחדר לפחות חמש פעמים מבלי להרוס את התיקון להקליט עוד יחס מתח הנוכחי ( cf שלב 1.2) בשעה tהוא ריכוז כלוריד חדש.
    הערה: מערכת זלוף עבור חילופי חיץ אוטומטי מקלה על תהליך זה, אבל אין צורך.
16. חזור על 2.15. עבור כל מצב יונית להיבדק, אבל שוב ושוב לבדוק את איכות המדבקה בין המדידות על ידי "מבחן הממברנה" שתואר לעיל.
    הערה: כדי להבטיח מתח קרום מדויק יציבות יון הרכב התאורה קרום התא צריך להיות מעל 500 MΩ ואילו ההתנגדות גישה לא יעלה על 10 MΩ, ראה . 2.12.6). אל תשכח להחליף את הפרמטר כולו תא פיצוי כבוי עבור הממברנה הבדיקה.
17. חזור על 2.2. 2.15. עבור מספר תאים, אבל לקחת כיסוי חדש להחליק עבור כל סדרת הבדיקה כדי להבטיח את בריאותם של תאים.

3. הערכת נתונים

1. התאם את קו הבסיס של כל עקבות הנוכחי על ידי הפחתת הנוכחי מתכוון לפני תאורה.
2. חישוב ממוצע photocurrent נייח אני ( הערה: נתח את צלמי השיא או שנה את אורך המינוח כדי לקבוע את הצילום הפוטוגרפי הנייח בהתאם לפרוטוקול או לשאלה המדעית.
3. חזור על שלבים 3.1) 3.2) עבור כל התנאים שנבדקו ותאים שונים.
4. קבעו את הצילומים שנקבעו מול פוטנציאל ההחזקה המתאים.
   הערה: אם מדידות מרובות ממוצעות, ניתן להקפיא הקלטות בודדות למצב מוגדר או לקיבול התא.
5. הצומת של מתח המתח הנוכחי עם ציר המתח מייצג את פוטנציאל ההיפוך (זרם נטו הוא אפס). קבע את זה על ידי אינטרפולציה ליניארית בין שתי נקודות נתונים סמוכים.
   הערה: אם אין היפוך קוטביות של photocurrents, אקסטרפולציה ליניארית מן שתי הנקודות האחרונות קרוב לאפס כדי לקבל קירוב של נקודת הצומת.
6. ממוצע r שנקבעפוטנציאל eversal עבור אותם תנאים ומזימות אותם נגד ריכוז כלוריד של פתרונות חיץ חיצוניים ( ראה איור 2 ב ).

תוצאות

איור 2 מציג תוצאות מייצגות המתקבלות ממדידות בעקבות הפרוטוקול המתואר. במהלך התאורה עם אור ירוק, Ps ACR1 תכונות זרם חולף מהיר אשר דועך במהירות לרמה הנוכחית נייח. לאחר כיבוי האור, התאים מתפרקים לאפס בתוך אלפיות השנייה ( איור 2 א ). החלפת הריכוז כלוריד תאיים גורם לשינוי של פוטנציאל היפוך כי ניתן לראות ישירות את עקבות פוטו נרכשים. הערכת הפוטנציאל היפוך ממדידות מרובות מכמת את השינוי הפוטנציאלי דרמטי היפוך שנגרם ...

דיון

קביעת הפוטנציאלים היפוך בתנאים יוניים וחשמליים מוגדר מספק מידע על מינים יון מועבר לאחר הפעלה קלה של CHR. אם באופן בלעדי יון אחד הוא מגוון במדיום פיזיולוגי מורכב ואת השינויים הפוטנציאליים היפוך המתקבל על פי הפוטנציאל Nernst תיאורטית, זה מין יון הוא היחיד מועבר אחד.

עם זאת, עבור ChRs, שינויים פוטנציאליים היפוך הם בדרך כלל פחות בולט מהצפוי משוואת Nernst בשל חדירות מינים יוניים שונים כמו גם התחרות בין יונים שנערך. במ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תאי HEK293	סיגמא אולדריץ'	85120602	תאי כליה עובריים אנושיים
רשתית	סיגמא אולדריץ'	R2500	רשתית טרנס All-trans
FuGENE HD	Promega	E2312	מגיב טרנספקציה
DMEM	ביוכרום	FG 0445	Dulbecco's Modified Eagle Medium
Agarose	Roth	3810	גשרי אגר
CaCl2	Roth	5239	CaCl2 2H2O
CsCl	Biomol	2452
EGTA	Roth	3054
FBS	Biochrome	S0615	תרבית תאים
גלוקוז	Roth	HN06	D(+)-גלוקוז
KCl	Roth	6781
MgCl2	Roth	2189	MgCl2 6H2O
NaCl	Roth	3957
NMG	Sigma Aldrich	M2004	N-methyl-D-glucamine
Na-Aspartate	Sigma Aldrich	A6683	L-חומצה אספרטית מלח נתרן מונוהידרט
חומצת לימון	רוט	6490
AgeI	ThermoFischerScientific	ER1462	אנזים הגבלה
XhoI	ThermoFischerScientific	ER0695	אנזים הגבלה
	ThermoFischerScientific	ER0975	אנזים הגבלה
XL1Blue E. coli	Agilent Technologies	200249	Chemocompetent E. coli
Kanamycin	Roth	T832
מרק ליזוגני בינוני	Roth	X964
Agar-Agar	Roth	6494	צלחות אגר
ערכת טיהור פלסמיד	Marchery-Nagel	740727.25
פניצילין/סטרפטומיצין	ביוכרום	A 2213	תרבית תאים
פולי-D-ליזין הידרוברומיד	סיגמא אולדריץ'	P6407-5MG	כיסוי ציפוי החלקה
Microforge	בהתאמה		ליטוש אש
פיפטות סרולוגיות	TPP		גדלים שונים
ספסל נקי	Kojair	Biowizard SL130
בוחש	IKA	RCT קלאסי
חוט כסף	מוצרי מדע	AG-T25; אלקטרודות AG-T10	, 0.64 מ"מ (אמבטיה); 0.25 מ"מ (אלקטרודה)
pH-meter	Knick	765 אוסמומטר קלימטרי
	ווגל	OM 815
מיקרוסקופ	Carl Zeiss	ID03	ליטוש
אש CO2 אינקובטור	קלסר	CB150
כלי תרבית תאים	TPP	93040	34 מ"מ פנימי קוטר
החלקות כיסוי	Roth	P232	קוטר 15 מ"מ
מדחום	Rö כלי Messtechnik	MTM12
Beamsplitter	Chroma	21011	90/10
מחזיק פיפטה	ALA Scientific Instruments	PPH-1P-AXU-0-1.5
Headstage	התקנים מולקולריים	CV203BU
מגבר	מולקולריים	AxoPatch200B
Digitizer	התקנים	מולקולרייםDigiData1400	ממיר אנלוגי דיגיטלי
מקור אור	TILL פוטוניקה	פוליכרום V	מוגדר ל-540 ננומטר
מיקרוסקופ	קארל זייס	Axiovert 100
תריס	Vincent Associates	VS25
נהג תריס	Vincent Associates	VCM-D1
קפילרי זכוכית	וורנר אינסטרומנטס	G150F-3	נימי בורסיליקט עם קצוות מלוטשים באש OD 1.5 מ"מ ID  0.86 מ"מ
חולץ מיקרופיפטה	Sutter Instruments	P1000
מטפל אמבטיה	Lorenz Messgerä ערכת	תלת-פסית MPCU
	Chroma	69008	מסנן פלואורסצנטי  ECFP/EYFP/mCherry
מצלמת CCD	Watec	Wat-221SCCD
אופטומטר	Gigahertz Optik	P9710	למדוד עוצמות אור
אובייקטיבי	Carl Zeiss	421462-9900-000	W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC
מיקרומניפולטור	Scientifica	PatchStar
תא הקלטה
	Manson	HCS-3202	מונע רעש חשמלי ממיקרוסקופ ספק כוח מובנה
שולחן מבודד רטט	ניופורט	M-VW-3636-OPT-01
כלוב פאראדיי	בהתאמה אישית או כל שולחן
צינורות	כל מסחרי; למשל רוט		גדלים וחומרים שונים לטיפול באמבטיה ויישום לחץ פיפטה; גשרי אגר
ליניאריים שייקר	Sunlab Instruments	SU 1000
מחשבון פוטנציאל צומת נוזלי	התקנים מולקולריים או ישירות מפיטר ה. בארי		התוכנית כלולה בתוכנת הרכישה של Clampex או ניתן להשיג אותה מ   p.barry@unsw.edu.au
תוכנת רכישת נתונים	Molecular Devices	Clampex 10.X
תוכנת הערכת נתונים	Molecular Devices	Clampfit 10.X
PsACR1	GenBank או Addgene	KF992074.1 או Addgene plasmid #85465	קידוד גנים עבור PsACR1
מדריך מגבר	התקנים מולקולריים	מדריך