זברה באתרו הכנת בחוט השדרה עבור הקלטות אלקטרו מתוך השדרה חושית הנוירונים המוטוריים

ג'ורג Streisinger חלוץ בשימוש Danio rerio, הידוע בכינויו דג הזברה, כמערכת מודל לניתוח גנטי של התפתחות החולייתנים ^10. המודל מציע מספר יתרונות ובהם: (1) יחסית גידול בעלי חיים פשוט וזול; (2) הפריה חוץ, המאפשר גישה קלה עוברים מן שלבי ההתפתחות המוקדמים; ו (3) העובר שקוף, המאפשר תצפיות ישירות חוזרות ונשנות של תאים, רקמות, ואיברים כפי שהם יוצרים.

במשך העשורים שלאחר מכן, מספר התקדמויות נוספות הגדילו את כוחו של המודל דג הזברה. בפרט, מסכי גנטי קדימה מאמצים רצף שלם-בגנום מילאו תפקידי מפתח לזיהוי מוטציות בגנים קריטי לתהליכים התפתחותיים רבים ^{11, 12, 13, 14,}"> ^{15, 16.} שיטות שיבוט Gateway אפשרו היישום השיגרתי של מהונדס מתקרב ^{17, 18.} התקדמות העריכה בגנום, שהודגמה על ידי מפעיל דמוי שעתוק (TALENs) ומתקבצות בקביעות interspaced חזרות palindromic קצרות (קריספר) -Cas9 nucleases, לאפשר את כניסתה של מוטציות הממוקדות, וכן נוק-אאוט ולהפיל-בגישות ^{19, 20, 21, 22.} משולבים, שיטות אלה להפוך דג זברה כמודל עצמה לחקר המנגנונים הגנטיים הבסיסיים התנהגויות מסוימות ומחלות אנושיות מספר ^{23, 24, 25, 26, 27.}

עבודה זו מתמקדת בפיתוחתקנה נפשית ואת התפקיד של פעילות חשמלית התפתחות עצבית. הדגש הוא על חוט השדרה, עבורו מודל דג הזברה מספק מספר יתרונות. ראשית, קל יחסית לגשת דג זברה בשלבים עובריים זחל; לפיכך, אפשר ללמוד לתפקד חוט שדרה במהלך שלבי התפתחות שיש פחות תאי עצב ומעגלים פשוטים ^{28, 29.} יתר על כן, בחוט שדרת דג הזברה יש קבוצה מגוונת של נוירונים, בדומה חוליות אחרות, כפי שהוכח על ידי תבניות אופייניות ו היכר של שעתוק גורמי ^{30, 31, 32, 33, 34, 35.}

רוב המחקרים דג הזברה שמטרתם לחשוף את המנגנונים העומדים בבסיס פונקציה של מעגלים בחוט השדרה, במיוחדאלה שתומכים תנועה, ממוקדים באופן מובן על שלבי הזחל ^{36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43.} עם זאת, רבים של נוירונים היוצרים את רשתות קטר השדרה ליזום בידול שלהם בשלבים עובריים מוקדמים, ~ 9-10 שעות לאחר ההפריה (hpf) ^{44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51.} לאור זאת, ההבנה כיצד המאפיינים המורפולוגיים וחשמליים של נוירונים שדרה להתעורר ולהשתנות בין השלבים העובריים זחל חשוב עבור overaהבנת ll של היווצרות מעגל תנועה ותפקוד.

שיטות לנתיחה המתוארת כאן לאפשר הצמד תיקון הקלטות מתא עצב השדרה יושמו בהצלחה בשלבים עובריים (~ 17-48 hpf) ואת שלבי הזחל (~ הפריה 3-7 ימים שלאחר [DPF]). גישה זו מגבילה את כמות דיסקציה נדרש לספק גישה נוירונים של עניין. הפרוטוקול שונה ממרבית השיטות שפורסמו אחרים להקלטה מתא עצב שדרת דג זברה כי דבק תפר הווטרינר משמש, ולא סיכת טונגסטן בסדר, לצרף את העובר או זחל לתא ההקלטה. הזמינות של שתי גישות שונות (כלומר, דבק תפר מול סיכת טונגסטן) להרכבת עוברי דג הזברה או זחלים לניתוח אלקטרו מספקת לחוקרים עם אפשרויות חלופיות כדי להשיג מטרות הניסוי הספציפיות שלהם.

ראשית, נהלים לגישה והקלטה של ​​פופ ulation של עצב סנסורי עיקרי, תאי Rohon-בירד, מתוארים. גופי התא של הנוירונים האלה נמצאים בתוך חוט השדרה הגבי. תאי Rohon-בירד קיימים מינים בעלי חוליות רבים, להבדיל מוקדם בהתפתחות, והם עומדים ביסוד בתגובה למגע העוברי ^{6, 44, 47, 48.}

שנית, נהלים לגישה והקלטה מן הנוירונים המוטוריים השדרה מפורטים. הנוירונים מוטורי שדרת זברה להתעורר במהלך שני גלים של נוירוגנסיס. הנוירונים המוטוריים העיקריים מוקדם היליד להתעורר בסוף gastrulation (~ 9-16 hpf), עם רק 3-4 הנוירונים מוטוריים העיקרי כיום לכל hemisegment ^{45, 46, 49.} לעומת זאת, האוכלוסייה מאוחר היליד של הנוירונים מוטוריים משניים היא יותר רבה מתעוררת במהלך תקופה ממושכת, החל מהשעה ~ 14 hpfEF "> ^{45, 50.} בראשית משניים הנוירון המוטורי בפלחי-הגזע באמצע תושלם ברובה על ידי 51 hpf ^50. הנוירונים המוטוריים משניים נחשבים המקבילה של הנוירונים המוטוריים ב אמניוטים ^46. מעניין, נוירונים supraspinal, באמצעות דופמין, לווסת תנועה הזחל וג'נסיס הנוירון המוטורי משנית בעובר ו זחל צעיר ^{50, 51.} הנוירונים המוטוריים יסודי ותיכון אחד המרכיבים תת שונים. כל הפרויקטים תת הנוירון המוטורי העיקרי האקסון היקפי כי innervates קבוצת שרירים אופיינית, וכתוצאה מכך סטריאוטיפי, זיהוי מסלול אקסונלית. באופן כללי, הנוירונים מוטוריים משני לעקוב אחר מסלולי אקסונלית הוקמו בעבר על ידי נוירונים מנוע עיקריים. לפיכך, בהתייחס מסלולי אקסונלית, הנוירונים מוטוריים יסודיים ותיכון דומים, למעט כי עובי אקסונים ו somata בגודלמחדש יותר עבור הנוירונים מוטוריים עיקריים ^45.

שלישית, שיטות הקלטה מכמה סוגים של interneurons נדונות. עם זאת, במקרים אלה, כמות מוגבלת של הסרת תאים בחוט השדרה אחרים נדרשת, ובכך חוט השדרה הוא פחות שלם יותר להקלטות מתאי Rohon-בירד או הנוירונים המוטוריים.

הנהלים כל חיה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC; משרד משאבי בחיות מעבדה, אוניברסיטת קולורדו אנשוץ קמפוס רפואי).

1. בעלי הזברה

1. להעלות ולשמור דג הזברה מבוגר (Danio rerio) ב 28.5 ° C על מחזור אור h 10 h כהה / 14 ועם טיפול במים המתאים וחילופי ^52.
2. רם עובר / זחלי דג זברה ב 28.5 מעלות צלזיוס בינוניות העובר עד שהם מגיעים לשלב הרצוי (למשל, 2 DPF).

2. הכנת חומרי Dissection

1. מתקן דבק לנתיחת דג זברה
   הערה: פרוטוקול זה כרוך בשימוש דבק וטרינר תפר לצרף ההכנה לתא ההקלטה. שימוש מוצלח של דבק התפר דורש היישום של כמויות קטנות של דבק באופן מבוקר. הדבק מתחיל להתקשות בהקדם זהנתקל בסביבה מימית. לכן, לצייר את הדבק לתוך micropipette ולספק כמויות קטנות באמצעות "מתקן דבק" תוצרת בית מאפשר הפעלת לחץ שלילי או חיובי על ידי פה. החלק המרכזי של המתקן הדבק הוא נשא זכוכית, חתיכת הכלול בתוך החבילה המכילה את נימי זכוכית דק קיר בורוסיליקט (איור 1A). בקצה האחד, השחלת מחובר באמצעות חתיכת צינור גמיש כדי שופר, ואילו הקצה השני מחזיק micropipette זכוכית (איור 1).
   1. הסר את הנורה השחורה מן נשא כוס אחת ולהחליף אותו עם מתאם הגומי הלבן נושא כוס נוספת (האיור 1B ו 1C).
      הערה: זה משעמם זכוכית כפולה כתרים המתאם מאפשר חיבור micropipette זכוכית בצד אחד, בקצה השני, כדי חתיכת צינור גמיש דרך ראויה פוליפרופילן קטן, ישר (איור 1B, הבלעה).
   <li> חותכים חתיכה של צינור גמיש באורך של ~ 38 ס"מ. צרף לשופר (למשל, טיפ micropipette צהוב 200 μL) עד הסוף של צינורות גמישים שאינם מחוברים נשא זכוכית.
   הערה: חתיכת הצינור צריכה להיות ארוכה מספיק כדי לאפשר מניפולציה של micropipette הזכוכית תחת בהיקף לנתח בעוד קצה micropipette הצהוב הוא בפה (האיור 1D).

איור 1: מתקן דבק. (AC) כוס נישאת מתחבר צינור גמיש בקצה אחד ואת micropipette הזכוכית בקצה השני. מתאמי הגומי לאפשר התקשרות באמצעות התאמת פוליפרופילן קטנה (B, הבלעה) אל הצינורות, בסופו של דבר, כדי micropipette כוס בקצה השני. (ד) מנפק הדבק הסופי יש שופר (למשל, עשוי יציקהקצה פיפטה טיקים) בקצה אחד של הצינור נשא הזכוכית עם micropipette המצורפת (ראש החץ האחר).

2. Dissection / תא ההקלטה
   הערה: תא דיסקציה משמש גם חדר ההקלטה אלקטרופיזיולוגיה. התא נוצר על זכוכית שקופית באמצעות חתיכות חתוכות מראש של אלסטומר סיליקון נרפא (איור 2 א).
   1. כדי להכין את אלסטומר סיליקון, להוסיף את הבסיס ואת סוכן ריפוי צינור חרוטי פלסטיק בכל 4: יחס 1, בהתאמה.
   2. מערבב את בסיס אלסטומר ואת סוכן הריפוי יסודי ושופך את התערובת לשתי 100 מ"מ צלחות פטרי. יוצקים את אלסטומר לעובי של <1 מ"מ צלחת אחת פטרי ו ~ 2.5 מ"מ בשנייה.
   3. אפשר אלסטומר סיליקון לרפא באמצעות חשיפה לאוויר עבור ~ 4-5 ימים. אם אלסטומר נרפא נדרש במוקדם, דגירה אותו ב 60 מעלות צלזיוס.
   4. חותכים חתיכות של אלסטומר סיליקון לרפא את הגדלים הבאים:
      1. מתוך ~ 1 מ"מ-thick נרפא אלסטומר, לגזור מלבן ס"מ ~ 3.8 x 6.3; ביצירה זו משמשת בתחתית (האיור 2 א) הקאמרי. מתוך סיליקון ~ 2.5 מ"מ בעובי נרפא, לחתוך מלבן ~ 3.8 x 6.3 ס"מ. מהמלבן האחרון, לגזור מלבן פנימי ~ 2.5 x 5 ס"מ; המסגרת והתוצאה משמשת בראש (האיור 2 א) הקאמרי.
   5. כדי להפוך את הנתיחה / תא ההקלטה, למקם את המלבן סיליקון דק ישירות על גבי שקופית זכוכית (5 x 7.6 ס"מ), ולוודא כדי להסיר בועות אוויר בין סיליקון ואת זכוכית (איור 2 א). מניח את מסגרת מלבן סיליקון, לחתוך מן אלסטומר העבה, על גבי השכבה התחתונה הדקה של סיליקון.
   6. ודא כי שכבות סיליקון לצרף גם לזה כי אין בועות אוויר בין שתי שכבות (איור 2 א).
   7. לאחר השימוש, לפרק את התא על ידי הסרת מסגרת סיליקון מלבן עבה מן ליי סיליקון בתחתיתאה המחובר לשקופית זכוכית. יש לשטוף את משטחי סיליקון עם DDH ₂ O לפני שימוש ואחרי כל פגישת הקלטה ויבשה עם מגבונים נמוך מוך.
   8. אחסן את יבש הקאמרי כדי למנוע את צמיחת פטריות בין שתי פיסות סיליקון.
      הערה: אם רעלים או סוכנים תרופתיים כי אין לשטוף בקלות מן סיליקון משמשים, להקדיש תא ספציפי למטרות אלה.

איור 2: תא אלקטרופיזיולוגיה וכלים לנתיחה. (א) תא המשמש והניתוחים והקלטות אלקטרו מורכב שקופית זכוכית שעליו מונחות שתי חתיכות של אלסטומר סיליקון נרפא, שכבות על גבי אחד את השני כדי לספק מסגרת וחלק תחתון עבור באר. גודלו של הבאר, ~ 2.5 x 5 סנטימטר, מאפשר שימוש בנפחים קטנים (2-2.5 מיליליטר) של הקלטה תאיתפִּתָרוֹן. שכבת סיליקון בתחתית מאפשרת מיצוב מאובטח של דבק רקמות באמצעות עובר דג הזברה שאינה לדבוק זכוכית. (ב) micropipette כוס (עליון) משמש למסירה דבקה במהלך הניתוח. זכוכית הקיר הדק נמתחה כדי ליצור סוף ארוך, קוני כי הוא חתך מאוחר, יצירת קצה בקוטר של ~ 75 מיקרומטר. את micropipette זכוכית קוני מחוברת הקצה החופשי של המתקן הדבק (1D איור, ראש החץ) וקדימה מלאים דבק באמצעות היישום של יניקה. את micropipette האחר (התחתונה), משך ובאשר אחד המשמש הקלטת תיקון- clamp, משמש עבור חיתוך הרוחב למוח האחורי ואת להסרת עור. (ג) תחת מיקרוסקופ זקוף, micromanipulator משמש לתמרן את micropipette לקראת השלבים לנתיחה הסופי. Micropipette זכוכית, כמו B, תחתון, מצורף בעל אלקטרודה (חץ). הסרת שריר מושגת על ידיpplying יניקה דרך הצינורות המחוברים לשקע אוויר (חץ). בצד השני, הצינור המתחבר ברזלים (חץ שחור) כי, על הצד השני שלה (כוכבי), יש צינורות מחוברים שופר.

Dissection 3. עוברים וזחלים להקלטות מהדק תיקון מנוירונים השדרה

איור 3: דיסקציה הגבי של חוט השדרה דג הזברה. (AA") לאחר חיתוך רוחב למוח האחורי (א) של העובר 2-DPF, העור נחתך בצידי הימני והשמאלי של העובר (ב). חתך שני, בניצב הראשון, מתבצע אז (ג). הבא, העור הוא הרים באמצעות micropipette, המאפשר פינצטה לתפוס ולמשוך ממנו את העור. (ב) הסרת העור חושפת את גב חוט השדרה. מקורי לקו השחור, סקיn הוסר ואת השטח של חוט השדרה (כוכבית), הכלול בתוך קרומי המוח, חשוף. העור נותר ללא פגע זנב לקו השחור (חץ). (CC") את קצה micropipette הזכוכית נלחצה על קרומי המוח, ומהירה, לרוחב, תנועות קצרות מבוצעות לנקב את קרומי המוח. (DD "ו EE") לאחר קרומי המוח הם דקרו (DD "), את micropipette הוא מתקדם (EE") עברה rostrally לקרוע את קרומי המוח לשני מגזרים. Somata של נוירונים Rohon-בירד בדרך כלל מופיעים על הסרת קרומי המוח (חץ). (FG") ב זחל 7-DPF, שכבות של שריר לכסות בהיבט הגבי של חוט השדרה, פוגע גישה נוירונים Rohon-בירד. בעקבות הסרת העור, זחל מטופל עם 0.05% collagenase. (F) דגירת 5 דקות עם collagenase 0.05% היא מחמירה מדי, וכתוצאה מכךניזק שריר מוגזם, כפי שמעיד שרירים בלוי (חץ שיבוץ). (F") טיפול collagenase מופרז עלול גם לפגוע בתאי עצב Rohon-בירד (חץ), חשף כאן על ידי הביטוי שלהם של GFP ב Tg (islet2b: GFP) קו. ב Tg (islet2b: GFP) קו, נוירונים גנגליון השורש הגבי גם להביע GFP (חץ). דגירת דקות קצרה 1 עם collagenase 0.05% דיה משחררת את השריר (G) תוך שמירה על מורפולוגיה myotome (חץ שיבוץ). (G") תאי פיגמנט נוכחים על גבי שכבת השריר הגבי ביותר (ראש חץ). (H ואני) ב Tg (islet2b: GFP) קו, נוירונים Rohon-בירד (חיצים) ואת גנגליון השורש הגבי (חץ) ממשיכים להביע GFP ב 7 DPF. הגב נופים של Tg (islet2b: GFP) עוברי דג הזברה ב 2 DPF (H) עלד 7 DPF (I). בלוח סולם ברים = 500 מיקרומטר; להיות (המוצג בלוח B) סולם ברים = 80 מיקרומטר; F 'ו- G' (המוצג בלוח F) סולם ברים = 200 מיקרומטר; H ואני (המוצג בלוח H) סולם ברים = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

1. דיסקציה של עוברים להקלטות מתאי Rohon-בירד
   1. מניחים עובר בתא לנתיחה המכיל ~ 2-3 מ"ל של תמיסת רינגר (איור 2 א). לשתק את העובר על ידי הוספת ~ 100 μL של פתרון 0.4% tricaine לתא.
   2. משוך micropipettes זכוכית קיר דק על micropipette חולץ באמצעות חוט להט תיבה כדי לקבל עצה ארוכה, דקה, דומה micropipette הזרקה (איור 2B, למעלה) ^53.
   3. צרף את micropipette זכוכית משך אל o זכוכית לשעמםF המנפק הדבק. תחת המיקרוסקופ לנתח, פינצטה שימוש לשבור את קצה micropipette הזכוכית כך הטיפ הוא ~ 75 מיקרומטר (איור 2B, למעלה).
      הערה: גודל טיפ צריך להיות גדול מספיק כדי לאפשר טעינה יעילה של הדבק לתוך הקצה באמצעות הפעלת לחץ שלילי (יניקת פה) כדי קדמי למלא את micropipette, אך קטן מספיק כדי לאפשר היישום המדויק של הדבק באמצעות לחץ חיובי .
   4. טען את micropipette זכוכית עם ~ 3-5 μL של דבק על ידי יישום יניקה דרך הפיה. תביא את הקצה מלא דבק לתא לנתיחה.
      הערה: מילוי micropipette עם דבק דורשת יניקה חזקה. אם micropipette ממלא במהירות עם יניקה חלשה, הטיפ הוא גדול מדי.
   5. מניחים את העובר בחדר הקלטה (איור 3 א ו 3A"); להקלטות מעוברים וזחלים צעירים (≤72 hpf), אין צורך להסיר את רקמת השריר.
   6. לְהָבִיאקצה micropipette טעון הדבק ליד ראשו של העובר / זחל תוך שמירה על לחץ חיובי קל אל micropipette דרך הצינור בפה (כדי למנוע את כניסתם של בתמיסה מימית). לאחר הקצה הוא ליד ראשו של העובר, להפעיל לחץ חיובי מספיק כדי לגרש טיפה קטנה של דבק על החלק התחתון של החדר.
      הערה: הדבק מתקשה פעם במגע עם בתמיסה המימית, ולכן חשוב ליישם ולתחזק בלחץ חיובי מתון כפי שהוא ממוקם הפתרון לנתיחה.
   7. השתמש בכלי לנתח סיכה כדי להזיז את העובר / זחל לעבר טיפת דבק, כך שהראש יוצר קשר עם הדבק. אוריינט הגבה-לוואי העובר מעלה בעיתונות על הראש כדי להבטיח מגע טוב עם הדבק.
   8. כדבק מתקשה לאט, השתמש סיכה לנתח מחדש עמדת העובר / זחל כך שהוא נמצא בצד הגחון למטה, למעלה הגבי-לוואי. טובל את כלי הסיכה לנתח לתוך טיפת הדבק ולהסיק אשכולות של הדבק מעל ומעבר הראששל העובר כדי להבטיח את מעמדה עוד יותר.
      הערה: Tricaine מאיץ את הקצב שבו הדבק מתקשה. כדי לאפשר יותר זמן לעבוד עם דבק, להשתמש בכמות מינימלית של tricaine נדרש כדי לשתק את העובר / זחל. בנוסף, שיעור ההתקשות עשוי להשתנות עם המון שונים של דבק. לפיכך, כאשר באמצעות סדרה חדשה של דבק, לברר שיעורו של התקשות לפני השימוש בו לנתיחה.
   9. ברגע הראש מחובר היטב אל סיליקון ואת דבק יש הקרושה, להקריב את העובר / זחל על ידי חיתוך רוחב ברמה למוח האחורי עם עוד micropipette זכוכית (איור 3A- ו 4A- א).
      הערה: חיתוך רוחב למוח אחורי הוא השיטה המשמשת כאן קרבת חיה אנושית. עם זאת, בהתאם מטרות הניסוי (למשל, לימוד שחייה פיקטיבי), שיטה אחרת עשוי להיות נחוץ.
   10. לפני הצמדת הזנב אל החדר, להסיר את העור מתא המטען.
       1. להשתמשmicropipette כוס טרי (2B איור, למטה) כדי לחתוך את העור באופן שטחי מספר פעמים בכל זנב בעמדה למוח האחורי (ב איור 3A- ו- B 4A-). פירס העור באופן שטחי ידי הזזת פיפטה בניצב לציר rostro- הזנב בכל צד של תא המטען עבור dorsally רכוב (ב איור 3A-) דגימות או על הצד הגלוי של תא המטען עבור דגימות רכוב רוחבית (ב איור 4A-).
   11. כדי ליצור קפל עור עבור פינצטה לתפוס, לגרד את העור מספר פעמים עם micropipette ברמת ו בניצב לחתוך הראשונית בשלב 3.1.10.1 (ג איור 3A- ו ג 4A-).
   12. בעזרת פינצטה, בהדרגה להרים את דש העור ולמשוך את העור caudally.
       הערה: זה לעתים קרובות תוצאות הסרת מכלול העור מתא המטען. עם זאת, הוא sometimes צורך להסיר את העור במספר קטעים ידי ביצוע חזר גירוד משיכת העור. עבור יישומים מסוימים, הסרה חלקית של העור עלולה לאפשר גישה מספקת מגזרי חוט השדרה של (3B דמויות 4B) ריבית.
   13. ספק טיפה קטנה של דבק ליד הזנב של העובר / זחל. להשתמש בדבק הזה כדי לצרף את הזנב לחלק התחתון של התא לנתיחה. במהלך שלב זה, כמו הדבק מתקשה, להתאים את המיקום של תא המטען עם הכלי לנתח סיכה כדי להבטיח כי המטען נשאר dorsally אורינטציה וכי הוא מחובר היטב קאמרי.
   14. בעקבות לנתיחה הראשונית הזה, לשטוף ההכנה בהרחבה עם הפתרון של Ringer להסרת tricaine ופסולת. אפשר בהכנה לנוח ~ ​​5 דק '.
   15. חלף הפתרון דיסקציה עם פתרון הקלטה תאי. במידת הצורך, להוסיף סוכן משתק להכנה (למשל., Α-bungarotoxin [conce הסופיntration של 1 מיקרומטר]).
       הערה: 1 מיקרומטר α-bungarotoxin שמגביל 1 עד 2 DPF עוברים בתוך ~ 30 דק '. עבור זחלים מבוגרים, ריכוז גבוה של-bungarotoxin α עשוי להיות נחוץ. אלפא-bungarotoxin נשמרת בפתרון באמבטיה במהלך ההקלטות, אשר מבוצעות בדרך כלל תוך פרק זמן של 1 h. פתרונות הקלטה המכילים קטיונים divalent, כגון קובלט, אינם דורשים תוספת של סוכן משתק. בניסויים המחייב תקופות הקלטה ממושכת (מעל 1 h), ההכנה היא perfused עם פתרון אמבטיה בשיעור של 0.5-1 מ"ל / דקה.
   16. הזז את תא דיסקציה עם העובר רכוב על הבמה של מיקרוסקופ מתחם זקוף מצויד מטרה ארוכת עבודה למרחקים טבילה במים 40X.
       הערה: מיקרוסקופ זהו חלק האסדה איפה הקלטה יבוצעו. האסדה צריכה גם להיות מצוידת headstage, מגבר תיקון- clamp, A micromanipulator, לבין רכישת נתונים / מערכת מחשב (איור 2C).
   17. הר של micropipette כוס ריק בורוסיליקט עבה חומה על בעל אלקטרודה של headstage (2B הדמוי, התחתונה 2C, חץ). צרף צינורות (קוטר פנימי: 0.16 ס"מ, קוטר חיצוני: 0.32 ס"מ, ואורך: ~ 90 ס"מ) בקצה אחד לשקע אוויר של בעל אלקטרודה (חץ) ובסוף שונות שסתום משולשת (איור 2C , ראש חץ שחור).
       1. מניח שופר בקצה אחד של קטע אחר של צינורות (~ 60-70 סנטימטר אורך) ולצרף אותו השסתום המשולש בקצה השני (איור 2 ג, כוכבי שחור).
          הערה: מערכת צינורות זו מאפשרת הפעלת לחץ חיובי ושלילי אל החלק הפנימי של פיפטה ההקלטה במהלך ההיווצרות חותמת.
   18. תביאו את קצה micropipette אל החלק הגבי ביותר של חוט השדרה בעדינות לנקב את קרומי המוח. עקוב עם מהיר, קצר, לצדדים בתנועות כדי Looסן קרומי המוח (איור 3 ג ו 3C").
   19. אחרי קצה micropipette יש חצו את קרומי המוח, לקדם ולהעלות את micropipette למשוך את קרומי המוח מן חוט השדרה (איור 3D ו 3D").
   20. הזז את micropipette rostrally, שהתקדם מעל 1 עד 2 hemisegments לחשוף תאים Rohon-בירד (איור 3E ו 3E").
       הערה: לנתח את הכמות המינימאלית של קרומי המוח נדרשו לחשוף רק כמה Rohon-בירד תאים. אחרי כל הקלטה, דיסקציה נוסף נועד לחשוף יותר תאי Rohon-בירד. בשני העוברים והזחלים, נוירונים Rohon-בירד עלולים להתפוצץ מדי פעם במגע עם micropipette התיקון. נוירונים בחוט השדרה אחרים לא מתנהגים ככה, מה שמרמז כי זה עלול לשקף את המאפיינים הייחודיים של התאים Rohon-בירד, כגון mechanosensitivity שלהם. בתמיכה זו, מספר יצירות פתרון (למשל, רכיבים יונייםו osmolarity) נבדקו, ועל אף מנעו התנהגות זו של תאים Rohon-בירד.
2. דיסקציה של זחלים להקלטות מתאי Rohon-בירד
   הערה: 7 זחלי DPF, השריר המקיף את חוט השדרה הגבי חייב להסירו. בצע שלבים 3.1.1 עד 3.1.15 (עם פגייה להחליף לעובר) לפני טיפול עם האנזים.
   1. כדי להסיר את השריר, דגירה הזחל עם collagenase 0.05% עבור 1 דקות.
   2. הסר את collagenase ידי שטיפת ההכנה ~ 5 פעמים עם הפתרון של Ringer. עקוב עם ~ 5 שטיפות של פתרון תאי להסיר את collagenase לחלוטין.
   3. בצע את השארית לנתיחה לאחר ההרכבה בתא ההקלטה על הבמה של המיקרוסקופ של אסדת ההקלטה. צרף micropipette תיקון בורוסיליקט עבה חומה (איור 2B, למטה) לבעל אלקטרודה ו לשבור את קצה micropipette באמצעות הברשה קלה כנגד בתחתיתחדר סיליקון.
   4. השתמש micropipette שבורים מעט כדי לגרות את השריר משם לחשוף את חוט השדרה הגבי. כדי להסיר סיבי השריר מן ההכנה, להחיל יניקה דרך צינור המחובר לשקע מחזיק האלקטרודה. השתמש micromanipulator להזיז את micropipette לאורך סיבי השריר תוך החלת יניקה.
      הערה: המטרה היא הראשונה להשתמש micropipette כדי לשחרר את השריר באופן מכני ולאחר מכן למצוץ ממנו להסיר את סיבי השריר הפרט. לפעמים, במהלך הסרת השריר, את micropipette הופך סמיך עם הרקמה השואבת.
      1. כדי לפתוח סתימת micropipette, לצחצח את micropipette נגד התחתון של החדר, מעט שביר הקצה, תוך נשיפת אוויר דרך הצינורות לגרש את התוכן.
         הערה: אם הגודל של קצה micropipette הופך גדול להחריד, micropipette חדש עשוי להיות נחוץ. גודלו של קצה micropipette הוא יותר קריטי בעת הסרת CL השכבות השרירותosest אל הקרומים המקיפים את הכבל או קרומי מוח השדרה (טיפי micropipette קטנים לאפשר עבודה יותר מבוקר).
   5. הסר את קרומי המוח כמתואר בשלבים 3.1.18-3.1.20 באמצעות micropipette חדש (איור 2B, למטה).

איור 4: דיסקציה Lateral של חוט השדרה דג הזברה. הרכבה עוברי דג הזברה בכיוון לרוחב מקל על הגישה הנוירונים המוטוריים. בעקבות סילוקו של שרירי דיסקציה של קרומי המוח כדי לחשוף את הנוירונים המוטוריים מתבצע תחת מיקרוסקופ זקוף מותאם עם מטרת טבילה במי 40X (ראה איור 2). (א) גופי תא הנוירון מוטורי ממוקמים ventrally רוחבית בתוך חוט השדרה. עובר מחובר לתא כך בצד הגבי שלהם פונה אל בעל אלקטרודה.שים לב דבק התפר מופיע לבן פעם שהוא מתקשה (כוכביות). לאחר למוח האחורי הוא transected (א), העור נחתך באופן שטחי מספר פעמים באתר (ב) זנב למוח האחורי באמצעות micropipette זכוכית. קיצוצים שטחיים נוספים (ג), בניצב הסט הראשון (ב), יצר כרטיסיית עור כי פינצטה יכול לתפוס להסרת העור. (BG) על micropipette הכוס הריקה, משך אל טיפ קצר, קוני (2B איור, למטה), מצורף מחזיק האלקטרודה. את micropipette הוא תמרן באמצעות micromanipulator לנתיחה בסדר עוקב והסרה של רקמת השריר. (ב) קצה micropipette הזכוכית שבורה ראשון מעט באמצעות הברשה קלה כנגד התחתון של החדר, יצירת סוף משונן בקוטר טיפ גדול. את micropipette מועבר לאורך סיבי השריר תוך יניקה מוחלת. סיבי שריר מוסרי שכבה אחתבכל פעם, כדי למנוע שיבוש של קרומי המוח הבסיסית. בשנת עוברים, שכבות השריר הגבי ביותר תוסרנה ראשונה, כמו אלה נוטים להיות רזים. העור לא יוסר hemisegments זנב יותר (חץ). (ג) חצי הגבי של שריר hemisegment אחד הוסר (חץ). (ד) קווי שחור לסמן hemisegment נטול סיבי השריר, עם קרומי המוח שלם המכסה את חוט השדרה (כוכבית). (EE") שימוש micropipette, הלחץ מוחל על קרומי המוח במיקום הגב מעט somata הנוירון המוטורי. תנועות מהירות, בקיצור, לרוחב של micropipette להוביל פירסינג של קרומי המוח. (FF") את micropipette מתקדמת ventrally, להיבט הגחון של hemisegment, והרים להפריד את קרומי המוח מן הרקמה העצבית. (GG") קרום המוח הם transected ידי הזזת micropipette rostrally לאורך שלhemisegment. נוירונים מיד מגיחים מתוך חוט השדרה חשוף כעת לגשת אלקטרודות תיקון (חץ). ברי סולם = 500 מיקרומטר (א); ברי סולם = 100 מיקרומטר BG (המוצגים בלוח B).

3. דיסקציה של עוברים על הנוירון מוטורי וקלטות interneuron
   1. מניחים את העובר בתא לנתיחה המכיל פתרון של Ringer לשתק את העובר עם tricaine, כמו בשלב 3.1.1.
   2. הר העובר רוחבי, עם הצד הגבי שלה מול צדי האולם כי הוא אופטימלי עבור המשתמש (בדרך כלל תלוי handedness). בצע את הפעולות 3.1.2-3.1.17 ולהבטיח כי העובר נשאר שטוח נגד סיליקון (איור 4 א ו 4A").
   3. השתמש micropipette עבה-קיר בורוסיליקט עם טיפ כי כבר נשבר ל ~ 25 מיקרומטר לגרד יניקה השריר משם לחשוף את קרומי המוח, כמתואר בשלבים 3.2.4-3.2.4.1 (איור 4 ב - <strong> 4D).
   4. לאחר שכבות שרירים מוסרים hemisegment (ים) של עניין (איור 4D), להחליף את micropipette זכוכית עם אחד חדש שיש לו טיפ שלם (איור 2B, למטה). נקב את קרומי המוח במקום כזה הוא גב אל הנוירונים היעד. שימוש micromanipulator, לדחוף למטה את micropipette על קרומי המוח ולאחר מכן להעביר אותו במהירות הצידה כדי לקרוע ו לחצות את קרומי המוח (איור 4E ו 4E").
   5. עם פקיעת קרומי המוח, לקדם ולהעלות את micropipette להרים את קרומי המוח מן חוט השדרה (איור 4F ו- 4F"). הזז את micropipette rostrally לקרוע את קרום לאורך של hemisegment (איור 4G ו- 4G").
      הערה: הקלטות מן Rohon-בירד תאי נוירונים מנוע עיקריים, דיסקציה מוגבלת סליקה קרום המוח הרחק immediatאזור היעד ה. לעומת זאת, עבור ההקלטות מן interneurons ו הנוירונים המוטוריים משנית, יש צורך להסיר נוירונים בתוך חוט השדרה המעכבים גישה לתא של עניין. במקרה האחרון, בשל השיבוש הנרחב של מעגלים בחוט שדרה, מחקרים מוגבלים הניתוח של תכונות הממברנה חשמל פנימיות.

4. הקלטות אלקטרו מנוירונים השדרה

1. עבור הקלטות מתאי Rohon-בירד ו הנוירונים מוטוריים, להשתמש נימי זכוכית עבה-קיר בורוסיליקט משך התנגדות של ~ 3 MΩ כאשר התמלאו פתרון פיפטה (איור 2B, למטה).
   1. הפעל לחץ חיובי על ידי נושב בעדינות דרך הצינור המחובר לבעל אלקטרודה לפני טבילת micropipette באמבטיה.
      הערה: הלחץ החיובי מונע פסול סתימת קצה micropipette והוא מתוחזק על ידי סיבוב שהסתום המשולש אל מחוץ position. ברגע ליד הנוירון היעד, הלחץ החיובי יגרום זחה ייחודית של קרום התא, מחוון מועיל כי micropipette הוא קרוב מספיק כדי ליזום היווצרות חותמת.
   2. שחרר את הלחץ החיובי ידי הסיבוב שסתום ברזלים למצב הפתוח תוך החלת יניקת אור נוספת דרך הפיה.
   3. לאחר ההיווצרות חותמת GΩ בין קרום התא ועל קצה micropipette, להחיל פולסים קצרים של יניקה כדי לקרוע את הקרום ולהשיג תצורת כל התא.
   4. לאחר הקמת תצורה כל תא יציבה, עם התנגדות קלט 500 MΩ וכן התנגדות גישה 10 MΩ, להשיג הקלטות במצב או voltage- או הנוכחי מהדק.

הקלטנו בהצלחה מתא עצב Rohon-בירד ב 17 hpf עובר דרך 7 DPF זחלים (איור 5 א ו 5 ב). כאשר תאי Rohon-בירד נרשמו, ההכנה הייתה רכובה עד הגבה-לוואי. הרכבה כזו מאפשרת זיהוי חד משמעי של תאים Rohon-בירד מבוסס על עמדות הגב שטחית שלהם וגדלים סומה גדול. זיהוי הוא אשר גם על ידי פוטנציאל הממברנה מנוחה הסטריאוטיפי hyperpolarized של נוירונים אלה (איור 5, שולחן שיבוץ) 6, 54. יתר על כן, כפי עצב סנסורי עיקרי, נוירונים Rohon-בירד חסר קלט סינפטי. לכן, בהיעדר גירוי חשמלי, אין שינויים בפוטנציאל הממברנה צריכה להתרחש בעת ההקלטה במצב הנוכחי מהדק (איור 5 ב"). מאז ההקלטות הראשוניות מתאי Rohon-בירד דג הזברה בוצעו <sup class = "Xref"> 6, קווי מהונדס שונים (למשל, Tg (islet2b: GFP), Tg (NGN: GFP), ו Tg (isletss: GFP)) נוצרו המבטאים כתבים ניאון בנוירונים אלה, נוסף להקל הזדהותם 55, 56, 57.

איור 5: Whole-cell voltage- והקלטות הנוכחי מהדק מנוירונים Rohon-בירד ב 1 ו 2 DPF העוברים 7 DPF הזחלים. (א) הקלטות מהדק מתח של החיצוני וזרמים פנימה התקבלו נוירונים Rohon-בירד ב 1- (קו שחור דק), 2 (קו שחור עבה), ו 7-DPF (קו אפור) עוברים / זחלים. הפוטנציאל מחזיק היה -80 mV וזרמים שעלו בעקבות צעד depolarizing כדי 20 mV. (ב) פוטנציאל פעולה יחיד שמעוררים נוכחי קצר (1 ms)זריקות (~ 0.35 NA) כדי נוירונים Rohon-בירד של 1- (קו שחור דק), 2 (קו שחור עבה), ו 7-DPF (קו אפור) עוברים / זחלים. (ב") בהיעדר גירוי חשמלי, אין שינויים בפוטנציאל הממברנה, כגון depolarizations postsynaptic ספונטנית, מתרחשות בנוירונים Rohon-בירד. טבלת השיבוץ מסכמת את הערכים של נח פוטנציאלי קרום רשמו Rohon-בירד נוירונים של 1- (n = 21) ו 2 (n = 9) DPF העוברים 7- (n = 7) DPF זחלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

קווים מהונדסים המאפשרים זיהוי חד-משמעי של תת נוירון שדרה אחר זמינים גם. בין אלה, קו מהונדס mnx1 Tg (mnx1: GFP) מבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) משנה של הנוירונים המוטוריים השדרה קצר לאחר המפרט שלהם (~ 14-16 hpf) <sup class = "Xref"> 58, 59. תודות למיקום הסטריאוטיפי של הנוירונים המוטוריים העיקריים בתוך כל hemisegment (איור 6 א), יחד עם בעת ה- GFP המהונדס mnx1, אפשר לזהות את תת הנוירון המוטורית השונה עיקרי (איור 6 ו 6C). כולל צבע פלואורסצנטי בפתרון אלקטרודה הקלטה מאפשר הדמיה של מסלולי אקסונלית, מתן אישור נוסף של זהות הנוירון המוטורי, כפי שכמה interneurons גם להביע GFP ב Tg (mnx1: GFP) קו. לחלופין, אחר קו מהונדס המאפשר זיהוי של הנוירונים המוטוריים הוא הקו ET2 60.

איור 6: מתח Whole-cell והקלטות הנוכחי מהדק מן הנוירונים המוטוריים של 1 DPF אמברי דג הזברהOS. (א) קריקטורה מתארת את תכונות מורפולוגיות הספציפיות של תת הנוירון מוטורי העיקרי הנוכחי בחוט שדרת דג הזברה. הנוירונים המוטוריים ראשיים מזוהים על ידי העמדה של סומה שלהם בתוך קטע מסוים (כלומר, [ROP] מקורי, [MIP] המדיאלי, או הזנב [CaP]) 45. בנוסף, כל תת מרחיב האקסון אל הפריפריה באמצעות נתיב ברור. השלוב של Tg (mnx1: GFP) תיוג קו וצבע חושף את סוכת axonal הסטריאוטיפית ואת זהותו של תת הנוירון המוטורי במהלך הקלטה. באמצעות השיטות שהוצגו כאן, אפשר ברצף שיא משלושה תתי סוגים הנוירון המוטורי העיקרי שונים בתוך אותו hemisegment. (ב) הקלטות מהדק מתח מוצגות כי התקבלו ROP, MIP, וכובע, והכל hemisegment יחיד. צעד מתח ל 20 mV שימש לעורר זרמים מן הפוטנציאל אחזקה של -80 mV. (ג) במהלך r הנוכחי מהדקecordings מ ROP, MIP, וכובע, קצר (1 ms, ~ 0.4 NA) זריקות נוכחיות יושמו להפעיל פוטנציאל פעולה. פוטנציאל הממברנה התקיים ב ~ -65 mV. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

בדל עיקרי בין הנוירונים מוטוריים יסודיים ותיכון הוא somata הגדול של נוירונים מוקדם יליד. עם זאת, תת הנוירון המוטורי משניים אינם ניתנים לזיהוי על ידי הגודל או המיקום סומה. עבור הקלטות מתא עצב מוטוריים משני ספציפי, שני קווי מהונדס, Tg (gata2: GFP) ו Tg (islet1: GFP), שימשו לזיהוי הנוירונים המוטוריים משנית עם ventrally ו dorsally אקסונים מקרין, בהתאמה 55, 61. עם זאת, רק לסוג הנוירון מוטורי משנה שלישי נמצא חוט שדרת דג הזברה, עם axoNS כי dorsally הפרויקט ventrally 62. לפיכך, צבע יכול לשמש כדי למלא הנוירונים מוטוריים משניים במהלך הקלטות לזהות תת על בסיס המורפולוגיה (איור 7 א) 8, 9. לעתים קרובות, במהלך מהדק מתח (איור 7, כוכביות) או קלטות נוכחיות מהדקות (איור 7C ו 7C", ראשי חץ) מן הנוירונים מוטוריים משנית, אירועים ספונטניים או הסינפטי נרשמים.

איור 7: מתח Whole-cell וקלטות נוכחיות מהדק מן הנוירונים מוטוריים משניים של 2 DPF עובר. (א) Tg (gata2: GFP) קו, שני תתי סוגים הנוירון המוטורי משניים שונים לבטא GFP 62. בשנת שמאל hemisegment, נוירון מנוע משני גחון(כוכבית חץ מצביעים סומה האקסון, בהתאמה). בשנתי ה hemisegment השכנה, מימין (זנב), קיים הנוירון מוטורי משנית גחון / הגבי (כוכבית מציינת סומה; חצים מצביעים שני האקסונים, אחד מקרינים ventrally [חץ תחתון] ואת dorsally האחר [החץ למעלה]). נוירונים אלה תויגו עם פלורסנט לצבוע באדום במהלך ההקלטות. כדי לזהות גחון / הגבי הנוירונים מוטוריים משנית, הוא קריטי כדי להבטיח לנתיחה אינה מסיר שריר hemisegment הזנב הסמוך, ובכך לפגוע או הסרת האקסון הגבה. לאחר ההקלטה, סומה נוירון נשארה מחוברת micropipette כפי שהוא התרחק ההכנה (הכוכבית בצד שמאל למעלה). כאשר באמצעות צבעים למלא נוירונים במהלך ההקלטות, צבע מנזילות ואילו האלקטרודה הוא באמבטיה, וכתוצאה מכך רקע אדום ניאון גלוי חוט השדרה ואת notochord (כוכבית בתחתית מקורי [שמאל] hemisegment < / Em>). (ב) הקלטות מהדק מתח התקבלו גחון ועל גחון / הגבי הנוירונים מוטוריים משניים. צעדי מתח (עד -30, -10, 10, 30, 50, 70, 90, ו 110 mV) שהושרו החוצה וזרמים פנימה. פוטנציאל פעולה Unclamped / depolarizations רשאי להיות נוכח בהקלטות (כוכביות). (ג) במהלך הקלטה נוכחיים מהדק מן הנוירונים מוטוריים משנית, קצר (1 ms) זריקות נוכחיות של משרעת הגדלה הוחל על נוירונים כדי לעורר פוטנציאל פעולה (כוכביות). (ג") דוגמאות של פוטנציאל פעולה יחיד מופעל בנוירונים מנוע משנית ידי זריקות נוכחיות ~ 0.4-na מוצגים. בשלב זה, פוטנציאל פעולה ספונטנית הם נצפו גם (C ו- C", ראשי חץ). (ד) הממושך (100 ms) זריקות נוכחיות (~ 0.35 NA) להפעיל ירי החוזרות של פוטנציאל פעולה. פוטנציאל הממברנה התקיים ב ~ -65 mV.עומס / 55,507 / 55507fig7large.jpg" target = '_ blank'> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

החוקרים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.