הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

RNA הקטן Transfection ב ראשוני האדם TH17 תאים על ידי הדור הבא Electroporation

7.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55546

⸱

13 באפריל 2017

 , 
1Department of Microbiology & Immunology, Sandler Asthma Basic Research Center, University of California, San Francisco

במאמר זה

סיכום

אלקטרופורציה מהדור הבא היא שיטה יעילה להעברת תאי Th17 אנושיים עם RNA קטן כדי לשנות את ביטוי הגנים והתנהגות התאים.

תקציר

תאי CD4+ T יכולים להתמיין למספר תת-קבוצות של תאי T מסייעים אפקטורים בהתאם לסביבת הציטוקינים שמסביב. תאי Th17 יכולים להיווצר מתאי CD4+ T נאיביים במבחנה על ידי הפעלתם בנוכחות הציטוקינים המקטבים IL-1β, IL-6, IL-23 ו-TGFβ. תאי Th17 מתזמרים חסינות נגד חיידקים ופטריות חוץ-תאיים, אך פעילותם החריגה נקשרה גם למספר מחלות אוטואימוניות ודלקתיות. תאי Th17 מזוהים על ידי קולטן הכימוקין CCR6 ומוגדרים על ידי גורם השעתוק הראשי שלהם, RORγt, וציטוקין אפקטור אופייני, IL-17A. תנאי תרבית אופטימליים להתמיינות תאי Th17 מאפשרים מחקרים מכניסטיים של ביולוגיה של תאי T אנושיים בסביבה מבוקרת. הם גם מספקים מסגרת לחקר החשיבות של גנים ספציפיים ותוכניות ביטוי גנים באמצעות הפרעות RNA או הכנסת חיקויים או מעכבי מיקרו-RNA (miRNA). פרוטוקול זה מספק שיטה קלה לשימוש, ניתנת לשחזור ויעילה ביותר לטרנספקציה חולפת של התמיינות תאי Th17 אנושיים ראשוניים עם RNA קטן באמצעות מכשיר אלקטרופורציה מהדור הבא.

מבוא

תאי CD4 + T הם Orchestrators חיוני של התגובה החיסונית אדפטיבית. תאים נאיבי CD4 + T המסוגלים להתפתח לתאי T מפעיל שונים (למשל Th1, Th2, TH17, וכו '), כל אחד עם סט משלו של ציטוקינים מאפיין גורמי שעתוק, תלוי במיקרו-סביבה מקומיים 1. החלטות השושלת תאי T להפוך הן קריטיות עבור שני החסינויות וסובלנות עצמיות. תאי TH17 הם תת-קבוצה אחת של תאי T הידועים להילחם חיידקים ופטריות תאיים, אבל התגובות הפסולות שלהם הן מעורבות גם בפתוגנזה של מחלות מרובות אוטואימוניות ודלקתיות כגון טרשת נפוצה ופסוריאזיס 2, 3. ניתן להפיק תאי TH17 אדם מתאי נאיבית CD4 + T במבחנה על ידי מתן אותם עם סביבת מקטב מתאימה 4. Vario לנו שילובים של ציטוקינים IL-1β, IL-23, TGFβ, ו- IL-6 שימשו לפיתוח תאי TH17 האנושי. תאי האדם TH17 להביע CCR6, קולטן chemokine כי הוא נפוץ לזהות אוכלוסיית התא הזה ומוגדרים על ידי הביטוי של גורם השעתוק העיקרי שלהם, RORγt (המקודדים על ידי RORC) 5, 6. יש TH17 התאים את היכולת להביע ציטוקינים מרובים, אך IL-17A הוא ציטוקין מפעיל-המגדיר בשושלת מיוצר על ידי תאים אלה. בחנו את הביטוי של כל שלושת הסמנים הקשורים TH17 (CCR6, RORγt, IL-17A) כדי להעריך את החוסן של assay בידול במבחנה ב TH17 האנושי שלנו. בנוסף, אנו בתרבית תאים מסוג CD4 + T אנושיים בתנאים בלתי-מקטב, שבו אין ציטוקינים או נוגדנים חוסמים נוספו התקשורת והתרבות להשתמש כביקורת שלילית מאז הביטוי של סמנים TH17 אלה צריכים להיות מאוד נמוך או נעדר.

ve_content "> דרך אחת ללמוד פיתוח T תא אנושי נורמלי ביולוגיה היא לתפעל ביטוי גנים במהלך ההתפתחות שלהם. קצר מפריעים RNA (siRNA) הם מולקולות רנ"א קטנות כי למקד תעתיקי המקודדים חלבונים והוא יכול להיות מנוצל כדי להפחית ביטוי גנים ספציפיים . מיקרו RNA (miRNAs) הוא אנדוגניים ללא קידוד RNA הקטן הידוע לווסת ביטוי גנים לאחר תעתיק. miRNAs הוכח לשחק תפקיד חשוב הן בעכברי ביולוגיה של תא T אנושי, לרבות TH17 תא 7, 8, 9. זה חשוב לי שיטות אמינות של מניפולצית פעילות RNA קטנה תא T אנושי ללמוד והשפיע על ביטוי גנים, ובסופו של דבר על הביולוגיה של תאי T אנושי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול קל לשימוש, עקבי ואמין שפתחנו עבור החדרה RNAs סינטטי קטן וחומצות גרעין נעול (LNAs, שינוי כימי חומצות גרעין עם יציבות מוגברת)לתוך תאי מערכת חיסון, ובאופן ספציפי לתאי TH17 אנושיים.

ישנן מספר שיטות חלופיות של החדרת RNA הקטן לתוך תאי יונקים, אשר בדרך כלל מתחלקים לקטגוריות כימיות, ביולוגיות, או פיסיות 10. בשימוש נפוץ שיטות כימיות, כולל transfections שומנים מבוססי transfections וסידן-פוספט, להסתמך על יצירת מתחמים הכימי-DNA, כי הם יותר נלקחים ביעילות על ידי תאים. באופן כללי, שיטות כימיות אינן יעילות כמו עבור transfection של תאי T העיקריים. השיטה הביולוגית הנפוצה ביותר היא להשתמש וקטור ויראלי (רטרו-וירוס למשל או lentivirus), אשר מוסיף RNA זרות ישירות לתוך שורה כחלק מחזור השכפול הטבעי שלה. תמרת ויראלי בדרך כלל לוקחת יותר זמן כדי להשלים, במיוחד כאשר אחד גורמים בזמן שיבוט מולקולרי של פלסמידים proviral. בנוסף, וקטורי תמרת ויראלי יכולים להיות מזיקים חוקרים אנושי. Electroporation הוא מ פיזיתethod של גרימת הקרום permeabilization ידי העמדה לתאים פולסי מתח גבוה, המאפשרת חומצות גרעין להיכנס לתוך התא זמני שבו הם יכולים לפעול על היעד שלהם. מכשירי electroporation מסורתיים היו לא יעילים עבור transfecting לימפוציטים העיקרי. עם זאת, electroporation הדור הבא אופטימיזציה הוכיח להיות מסוגל transfecting תאי T ביעילות גבוהה מאוד, במיוחד כאשר החומר להיות transfected הוא RNA הקטן. הדור הבא המונח משמש באופן רופף להבדיל שני הפלטפורמות החדשות יותר (למשל, הניאון, Amaxa) ממכונות electroporation מסורתיות. בנוסף, שיטה זו היא להרחבה בקלות עבור מסכי תפוקה מתונים עם עד כ 120 RNA הקטנים בניסוי אחד, לעתים קרובות באמצעות ריאגנטים סינטטיים תוקף. חשוב לציין, ניתן להשיג transfections מוצלח קטן כמו 16 שעות לאחר הפעלת תא T. החסרון של שיטה זו, לעומת זאת, הוא שזה לא לגרום incorporati גנומי יציבעל, ולכן הוא חולף. לפיכך, זה שווה את המאמץ הנוסף כדי ליצור מבנה ביטוי יציב שיכול להיות ארוז לתוך וקטור ויראלי והביע בהצלחה בתאי T במקרים בם ביטוי לטווח הארוך של RNA קטנה נדרש.

השתמשנו transfection הדור הבא (למשל, ניאון) כדי לספק כלי RNA או LNA oligonucleotide יחידים או פעמים התקועות סינטטיים מגוונים למטרות שונות 11, 12, 13. התערבות RNA יעילה יכולה להיגרם עכבר עיקרי ותא T אנושי באמצעות RNA דו-גדילים קצרי מפריעים (siRNA). פרוטוקול זה מתאר מצבים מותאמים לשימוש בטכניקה זו בתאי TH17 אנושיים. בנוסף siRNAs, מחק מירנה סינטתית זמינה מסחרי מעכבים יכולים לשמש כדי ללמוד רווח מירנה ואובדן התפקוד. מחקה מירנה הן מולקולות RNA דו-גדילים דומות מאוד siRNAs, אבל designeד עם רצף של miRNAs בוגרת אנדוגניים. מעכבי מירנה הם כימית-modified RNA ו / או LNA מבוסס oligonucleotides תקועים אחד אשר נקלטות על ידי miRNAs יליד להרגיז את תפקידם. מצאנו כי כל הכלים האלה יכולים לשמש ביעילות לימפוציטים מסוג T העיקרי מתורבתים, לרבות אך לא רק תאי TH17 אנושיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה פועל לפי ההנחיות של UCSF לאתיקת מחקר אנושי.

1. הכנת תרבית תאי T, הבידוד של תאים מסוג CD4 + T, ואת קיטוב TH17

  1. ביום 0, צלחות תרבות מעיל רקמה 6-היטב עם 1.5 מ"ל לכל טוב של CD3 אנטי אנושי (2 מיקרוגרם / מ"ל) ו CD28 אנטי-אנושיים (4 מיקרוגרם / מ"ל) ב PBS עם סידן ומגנזיום לפחות 2 שעות ב 37 ° C.
    1. לחלופין, מעיל הצלחות לילה בשעה 4 ° C. גלישת צלחות ב parafilm.
  2. הכן את התאים mononuclear דם טבורי (CBMCs) על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות לפי הוראות היצרן.
    זהירות: עבוד בזהירות ולוודא ציוד מגן אישי מתאים (PPE) הוא משוחק בעת טיפול דם אנושי כדי למנוע כל סיכון של חשיפה לפתוגנים שמקורן בדם.
  3. ברגע שתאי mononuclear בודדו ורחץ, לבצע בידוד תא אנושי CD4 + T על ידי Sele גודל שליליction באמצעות ערכת תא מסחרית האנוש CD4 + T.
    הערה: אם יש זיהום תא דם אדום לאחר בידוד תא mononuclear, הגידול ימס כדוריות דם אדום אופציונאלי עשויות להתבצע לפני צעדי בידוד תא CD4 + T. Resuspend התאים mononuclear ב 1 מ"ל של חיץ בידוד (2% FBS ב PBS). מוסיפים 5 מ"ל של תמיסת lysing 1x. דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר. ואז להוסיף 5 מ"ל של חיץ צנטריפוגות בידוד XG 300 5 דקות ב 4 ° C עד גלולה התאים.
    1. Resuspend התאים mononuclear בצפיפות של 50 x 10 6 לכל 500 μL במאגר הבידוד בצינור 5 מ"ל חדש.
    2. הוספת 100 μL של FBS ו 100 μL של מיקס נוגדן לכל צינור דגירה אז כל צינור בבית 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות על שייקר מסלולית לערבב היטב.
    3. לאחר דגירה, להוסיף 3-4 מ"ל של חיץ בידוד לשטוף את התאים. צנטריפוגה התאים XG 300 8 דקות ב 4 ° C עד גלולה התאים. בזהירות לשאוב Supernatant.
    4. במהלך ספין זו, טרום לשטוף את החרוזים המגנטיים. מעביר את הכמות הרצויה של חרוזים מגנטיים לתוך צינור חדש (בשימוש ב- 1: 1 עם התאים) ולהוסיף נפח שווה של חיץ בידוד כדי לשטוף את החרוזים. מערבבים היטב באמצעות micropipette מ"ל 1 ולאחר מכן למקם את הצינורית שואבת דק 1 לפחות. בזהירות לשאוב supernatant. Resuspend החרוזים המגנטיים בהיקף הזהה הועבר בתחילה לפני הכביסה.
    5. Resuspend התאים בצינור אחד עם 500 μL של חיץ בידוד ולהוסיף 500 μL של חרוזים מגנטיים מראש שטף.
    6. דגירה התאים עם חרוזים מגנטיים עבור 15 דקות על שייקר מסלולית בטמפרטורת החדר (18 ° C עד 25 ° C) לערבב היטב.
    7. לאחר דגירה, ביסודיות pipet התאים באמצעות micropipette 1 מ"ל לפחות 10 פעמים. ואז להוסיף 3-4 מיליליטר של חיץ בידוד ומקום כל צינורית השואבת 2 דקות.
    8. להעביר בזהירות את התאים באופן שלילי שנבחרו CD4 + T הנמצאיםאת supernatant לצינור חדש.
  4. לאחר CD4 + T בידוד תא יושלם, לספור את התאים עם hemocytometer ולשמור תאים על קרח.
  5. לשטוף פעמים שתי צלחות מצופים נוגדן עם PBS. ואז להוסיף 1.5 מ"ל של 2x תערובת של TH17-מקטב התקשורת היטב כל: אנטי-אנושי IFNγ (20 מיקרוגרם / מ"ל), אנטי אנושי IL-4 (20 מיקרוגרם / מ"ל), TGFβ אדם (10 ng / mL), אדם IL-1β (40 ng / mL), אדם IL-23 (40 ng / mL), IL-6 אדם (50 ng / mL) כל מדולל תקשורת בסיס סרום ללא (בתוספת 2 מ"מ L- גלוטמין, 100 U / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל, 10 HEPES מ"מ, 1 מ"מ פירובט נתרן ו 100 מיקרומטר 2-mercaptoethanol).
    הערה: Transfection והפרעה RNA עושה עבודה בתקשורת סרום המכיל. מטרת השימוש בסרום ללא מדיה עם פרוטוקול זה היא להשיג ייצור IL-17A טוב יותר.
  6. צנטריפוגה תאי CD4 + T האנושיים XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C עד גלולת תאים. בזהירות לשאוב supernatנְמָלָה. ואז resuspend התאים בתקשורת בסיס סרום ללא צלחת התאים בצפיפות של 3 x 10 6 ב 1.5 מ"ל לכל היטב כך נפח הסופי הוא 3 מ"ל לכל טוב וציטוקינים מקטב כיום בריכוז סופי 1x.
    1. מניחים את הצלחות ב 5% 2 CO, 37 ° C חממה במשך יומיים.

2. Electroporation של במבחנת תאי TH17 אנוש Polarized

  1. ביום 2, צלחות תרבות 48-היטב רקמות מעיל עם 250 μL לכל טוב של אנטי אנושי CD3 (2 מיקרוגרם / מ"ל) ו CD28 אנטי-אנושיים (4 מיקרוגרם / מ"ל) ב PBS עם סידן ומגנזיום לפחות 2 שעות ב 37 ° C.
    1. לחלופין, מעיל הצלחות לילה בשעה 4 ° C. גלישת צלחות ב parafilm.
  2. כן RNA הקטן עבור transfection. במשך כל transfection, aliquot 1 μL של פתרון המניות 5 מיקרומטר של siRNA לתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. כלול contr RNA קטן כימית בהתאמה המתאימהol. שמור את כל הצינורות על קרח.
  3. לשטוף פעמים שתי צלחות מצופים נוגדן עם PBS. ואז להוסיף 500 μL של 1X TH17-מקטב התקשורת היטב כל: IFNγ האנטי-אנושית (10 מיקרוגרם / מ"ל), אנטי אנושי IL-4 (10 מיקרוגרם / מ"ל), אדם TGFβ (5 ng / mL), אדם אִי- 1β (20 ng / mL), אדם IL-23 (20 ng / mL), IL-6 אדם (25 ng / mL) כל מדולל תקשורת בסיס סרום ללא (בתוספת 2 מ"מ L- גלוטמין, 100 U / מ"ל פניצילין, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל, 10 HEPES מ"מ, 1 מ"מ פירובט נתרן ו 100 מיקרומטר 2-mercaptoethanol).
  4. לאחר הצלחות תרבות ריאגנטים transfection מוכנים, להשעות את התאים עם pipetting 1 מ"ל micropipette, בעדינות אך להבטיח כי כל התאים מנותקים מהחלק התחתון של בארות. פינת התאים לתוך צינור צנטריפוגות חרוטים ב XG 500 עבור 5 דקות ב 4 °.
    הערה: עבור תקופות תרבות יותר מאשר פרוטוקול ארבעה ימים המוצגת כאן, התאים צריכים להיות טרנספקציה בערך כל 3 ימים באמצעות בפרוטוקול הזה. שלב 20.4 מן ראוי לשנות זאת מאז התאים שטופלו RNA הקטן שונה לא צריכים להיות ונקווה. כל התנאים הנבדקים יש לאסוף, נספר בנפרד טרנספקציה.
  5. בזהירות לשאוב supernatant, ולאחר מכן מחדש להשעות את התאים לפחות 1 מ"ל של PBS לשטוף. ספירת תאי TH17 החיים (למשל עם hemocytometer באמצעות הרחקה הכחולה Trypan להעריך כדאיות) ולאחר מכן להעביר את התאים לצינור microcentrifuge.
  6. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי גלולה התאים.
  7. בזהירות לשאוב supernatant, ולאחר מכן מחדש להשעות את התאים באמצעות חיץ resuspension סיפק מן ערכת מערכת transfection 10 μL בצפיפות של 2.5-4 x 10 7 תאים לכל מ"ל. שמור תאים בטמפרטורת החדר.
    הערה: ככלל מנחה, ולנסות להכין רק כמו תאים רבים ככל שניתן טרנספקציה בתוך 30 דקות. ניתן להשוות קבוצות מרובות.
  8. להוסיף 9 μL של תאים 1 μL של RNA קטנים בכל microcצינור entrifuge. Pipet פעם לערבב את התאים RNA קטנים עבור transfection מכן לטעון לתוך קצה האלקטרודה פיפטה המסופקים.
    הערה: בדרך כלל, להוסיף 9.5 μL של ההשעיה התא כדי להבטיח שיש מספיק מהתערובת על מנת למנוע יצירת בועות קצה האלקטרודה pipet לפני transfection.
  9. מלאו קובט מסופק עם 3 מ"ל של E. חוצץ אלקטרוליטי בטמפרטורת החדר מקום קובט בתוך תחנת פיפטה ואז למקם את פיפטה לתוך העמדה בתוך קובט.
  10. מייד electroporate כל תמהיל 10 μL של תאים ו- RNA הקטן באמצעות הפרמטרים הבאים: מתח דופק 1,500-1,550 V, רוחב דופק 10 ms, ו 3 פולסים הכוללים במכשיר transfection.
  11. לאחר electroporation יושלם, ישירות מוסיף את תערובת תא 500 μL של 1X TH17-מקטב תקשורת בארות מוכנות של צלחת תרבות. צלחות מקום בתוך CO 5% 2, 37 ° C חממה במשך יומיים נוספים.
    הערה: לשטוף את קצה האלקטרודה פיפטה ידי pipettingמעלה ומטה PBS בין כל transfection.

3. תאי קציר האנוש TH17

  1. Resuspend התאים התקשורת והתרבות עם micropipette, pipetting בעדינות אך להבטיח כי כל התאים מנותקים מהחלק התחתון של בארות. הכן את התאים עבור מבחני ביטוי תפקודיים ו / או גן.
    הערה: שגרה, מספיק תאי ניב מבאר אחת של תאי TH17 טרנספקציה לשמש לניתוח הזרימה cytometric של סמן משטח גורם ציטוקינים ותמלול תאיים מכתים או להכנה של RNA עבור ניתוח ביטוי גנים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הצעד הראשון כדי לפתח מערכת אמינה של electroporating בהצלחת תאים אנושיים TH17 היה לייצר חזק בתרביות תאי TH17 אנושיות המובחן במבחנה. תאי T בתרבית בתנאים-מקטב TH17 הביע את הקולטן chemokine CCR6 ואת גורם שעתוק RORγt (איור 1A, שמאל). סמנים אלה לא באו לידי ביטוי כאשר תאי T היו בתרבית בתנאים הלא-מקטב (thn) (איור 1A, מימין). תאי T בתרבית בתנאים-מקטב TH17 מיוצר גם IL-17A על restimulation (איור 1B,<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מספק שיטה משופרת עבור המשלוח של RNA הקטן לתוך תאי TH17 אנושיים. למרות תאים אנושיים TH17 שימשו כאן, שיטה זו של electroporation עם RNA קטנים יכולים לשמש עם תת T מסייעים האנושי העיקרי אחרים, כגון Th1, Th2, ו Tregs. זה לא עבד היטב עבור תאים נאיביים CD4 + T כך התאים חייב להיות מופעל בתרבות לפני transfection. עבור פרוטוקול זה, אנחנו ראשונים מותאמים למערכת התרבות חוץ גופייה לייצור IL-17A טוב יותר. הגורם הגדול ביותר היה בסיס מדיה. מצאנו כי סרום ללא מדיה היי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב (R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), פרס חוקר של האגודה ללוקמיה ולימפומה (K.M.A.), והתוכנית להכשרת מדענים רפואיים של המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (NIGMS) (מענק #T32GM007618) (M.M).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אנטי-אנושי IL-17A PEebioscience12-7179-42 שיבוט: eBio64DEC17
אנטי אנושי IFNg FITCebioscience11-7319-82שיבוט: 4S. B3
אנטי אנושי CD4 eVolve605ebioscience83-0047-42שיבוט: SK3
עכבר אנטי אנושי CD196 (CCR6) BV421BD biosciences562515שיבוט: 11A9
אנטי אנושי RORgt AF647BD biosciences563620שיבוט: Q21-559
אנטי אנושי CD45 eFluor450ebioscience48-9459-42שיבוט: 2D1
Foxp3/צביעת גורם שעתוק סט חיץebioscience00-5523-00עבור גורם שעתוק תוך-תאי זרימה ציטומטריה צביעת
Hu FcR מעכב מחייב ebioscience מטוהר14-9161-71
ImmunoCult-XF T הרחבת תאיגזע בינוניים טכנולוגיות תאי גזע10981"מדיה בסיס ללא סרום"MACS
CD28 כיתה פונקציונלית טהורה,שיבוט Miltenyi Biotecאנושי 130-093-375: 15E8
אנטי אנושי CD3 מטוהרUCSF ליבת נוגדן חד שבטיN / Aשיבוט: OKT-3
LEAF מטוהר אנטי אנושי IL-4Biolegend500815שיבוט: MP4-25D2
אנטי אנושי IFNg, מדע ביולוגי מטוהר בדרגה פונקציונלית16-7318-85שיבוט: NIB42
רקומביננטי אנושי IL-23Peprotech 200-23
IL-1 ובטא אנושיים רקומביננטיים;פפרוטק 200-01B
TGF ובטא אנושיים רקומביננטיים; 1פפרוטק 100-21C
IL-6 פפרוטק אנושי רקומביננטי 200-06
siGENOME Control Pool, לא ממוקד #2DharmaconD-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Human RORCDharmaconM-003442-00
siGENOME SMARTpool Human PTPRCDharmaconM-008067-01
Dynabeads ערכת תאי CD4 T אנושיים שלא נגעוThermoFisher Scientific11346DCD4+ תא T אנושי ערכת בידוד
מערכת העברה ניאוןThermoFisher ScientificMPK5000מכשיר אלקטרופורציה מהדור הבא
מערכת העברה ניאון 10 μ L KitThermoFisher ScientificMPK1096
מאגר השעיה TThermoFisher Scientificמסופק בערכה (MPK1096)"מאגר השעיה מחדש של טרנספקציה"
LymphoprepStemcell Technologies#07801שיפוע צפיפות
בינוני קוסטאר 6 בארות צלחות מטופלות בתרבית רקמותקורנינג3516צלחות תחתונות שטוחות
costar 48 בארות צלחות מטופלות בתרבית רקמותקורנינג3548צלחות תחתונות שטוחות
מאגר ליזינג BD פארם ליז, 10xBD biosciences555899חייב להכין תמיסה 1x עם מים מזוקקים לפני השימוש
בהם

מקורות

  1. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*. Ann Rev Immunol. 28 (1), 445-489 (2010).
  2. Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Ann Rev Immunol. 27 (1), 485-517 (2009).
  3. Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing. Nature. 14 (9), 585-600 (2014).
  4. Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. Properties and origin of human Th17 cells. Mol Immunol. 47 (1), 3-7 (2009).
  5. Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunol. 8 (6), 639-646 (2007).
  6. Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J Exp Med. 204 (8), 1849-1861 (2007).
  7. Du, C., et al. MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis. Nature Immunol. 10 (12), 1252-1259 (2009).
  8. Escobar, T. M., et al. miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression. Immunity. 40 (6), 865-879 (2014).
  9. Wang, H., et al. Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210. Nature Immunol. 15 (4), 393-401 (2014).
  10. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal bioanal chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  11. Steiner, D. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. 35 (2), 169-181 (2011).
  12. Simpson, L. J., et al. A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production. Nature Immunol. 15 (12), 1162-1170 (2014).
  13. Pua, H. H., et al. MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production. Immunity. 44 (4), 821-832 (2016).
  14. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), (2015).
  15. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), 10437-10442 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

TT CD4Th17siRNACCR6ROR Gamma TIL 17A
RNA הקטן Transfection ב ראשוני האדם TH17 תאים על ידי הדור הבא Electroporation
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.