מאמר שיטה

ביטוי חלבון רקומביננטי, התגבשות, מחקרים ביופיסיקליים של א Bacillus -שמר Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

DOI:

10.3791/55576

⸱

16 במאי 2017

 ,  , 
1Division of Biological Science and Technology, Yonsei University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bacillus anthracis הוא הפתוגן המחייב של אנתרקס משאיפת קטלני, ולכן מחקרים על הגנים והחלבונים שלהם מוסדרים בקפידה. גישה חלופית היא ללמוד גנים אורתולוגיים. אנו מתארים מחקרים biophysicochemical של B. אנתרקיס אורת'ולוג ב B. cereus , bc1531, הדורש ציוד ניסיוני מינימלי וחסרים בעיות בטיחות חמורות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להתגבר על הגבלות בטיחות ותקנות בעת לימוד גנים וחלבונים מפני פתוגנים אמיתיים, הומולוגים שלהם ניתן ללמוד. Bacillus anthracis הוא פתוגן מחייב שגורם לאנתרקס שאיפה קטלני. Bacillus cereus נחשב מודל שימושי ללימוד ב 'אנתרקיס בשל הקשר האבולוציוני הקרוב שלה. אשכול הגנים ba1554 - ba1558 של B. anthracis נשמר מאוד עם אשכול bc1531 - bc1535 ב- B. cereus , וכן עם bt1364-bt1368 באשכול ב- Bacillus thuringiensis, המציין את התפקיד הקריטי של הגנים המשויכים לסוג Bacillus . כתב היד מתאר שיטות להכנת ואפיון של מוצר חלבון של הגן הראשון ( ba1554 ) מקבוצת גנים ב B. anthracis באמצעות חלבון רקומביננטי של אורתולוג ב B. cereus , bc1531.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביטוי חלבון רקומביננטי נעשה שימוש נרחב כדי להתגבר על בעיות הקשורות מקורות חלבון טבעי, כגון כמויות חלבון מוגבל זיהום מזיק. יתר על כן, במחקרים על גנים וחלבונים פתוגניים, ניתן לנצל זן מעבדה חלופי שאינו דורש אמצעי בטיחות נוספים. לדוגמה, Bacillus cereus הוא מודל שימושי לחקר Bacillus anthracis בשל הקשר האבולוציוני הקרוב שלהם 1 .

B. anthracis הוא פתוגן מחייב שגורם לאנתרקס משאיפה קטלנית בבני אדם ובעלי חיים, והוא עשוי לשמש כ bioweapon 2 . לפיכך, מחקרים מעבדה על B. anthracis מוסדרים בקפדנות על ידי המרכזים האמריקאים לבקרת מחלות, המחייבים פרקטיקות של רמה 3 (BSL-3) של בטיחות ביולוגית, אשר קובעות כי אזור המעבדה יופרד עם לחץ שלילי בחדר. בניגוד ל- B. anthracis , B. cereus מסווג כסוכן BSL-1 ולכן יש חששות בטיחות מינימליים. B. cereus הוא פתוגן אופורטוניסטי אשר, עם זיהום, גורם הרעלת מזון שניתן לטפל ללא סיוע רפואי. עם זאת, מכיוון שב 'cereus חולק גנים קריטיים רבים עם B. anthracis , ניתן לבדוק את הפונקציות של חלבונים אנתראקיס באמצעות ההומולוגים המתאימים של B. cereus 1 .

Ba1554 - ba1558 אשכול גנים של B. anthracis הוא שמר מאוד עם bc1531 - bc1535 אשכול של B. cereus , וכן עם bt1364-bt1368 אשכול של Bacillus thuringiensis , במונחים של ארגון גנים ורצף. יתר על כן, הגנים הראשונים ( ba1554 , bc1531 , bt1364 ) של אשכולות בהתאמה משומרים לחלוטין ( כלומר, 100% רצף נוקלאוטיד זהות), implyiNg תפקיד קריטי של המוצר הגן במינים Bacillus . בשל מיקומה של אשכולות גנים אלה, ba1554 זוהה בטעות כווסת שעתוק משוער 3 . עם זאת, רצף חומצות אמינו ניתוח של המוצר ba1554 מציין כי היא שייכת למשפחת MazG, אשר יש פעילות pyrophosphohydrolase נוקלאוטיד אינו קשור עם גורם שעתוק פעילות 4 , 5 . למרות חלבונים השייכים למשפחת MazG הם מגוונים ביחס לרצף הכולל אורך, הם חולקים משותף ~ 100-שאריות MazG תחום מאופיין EXXE 12-28 EXXD מוטיב ("X" מייצג שאריות חומצות אמינו, ומספר מציין את מספר שאריות X).

תחום ה- MazG לא תמיד מייצג באופן ישיר פעילות קטליטית מסוימת. חבר MazG מ Escherichia coli (EcMazG) בעל שני תחומים MazG, אבל בLy מסוף C- תחום MazG הוא פעיל enzymatically 6 . יתר על כן, הספציפי המצע של אנזימים MazG משתנה מ nonphoside nucleoside שאינם ספציפיים (עבור EcMazG) ספציפיים dCTP / dATP (עבור integrin הקשורים מזג) ו DUTP (עבור dUTPases) 6 , 7 , 8 , 9 . לכן, מנתח biophysicochemical של החלב BA1554 יש צורך לאשר פעילות NTPase שלה לפענח את הספציפיות המצע שלה.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד כי מעבדות ביותר ללא מתקן BSL-3 יכול לעקוב כדי לאפיין את המוצר חלבון של הגן bc1531 B. cereus , שהוא אורתולוג של B. anthracis ba1554 , ברמה המולקולרית. בקצרה, רקומביננטי BC1531 (rBC1531) התבטא ב coli ו מטוהרים באמצעות תג זיקה. עבור ניסויים קריסטלוגרפיים רנטגן, קריסטליZation התנאים של חלבון rBC1531 הוקרנו אופטימיזציה. כדי להעריך את הפעילות האנזימטית של rBC1531, פעילות NTPase היה פיקוח colorimetrically כדי למנוע רדיואקטיבי שכותרתו נוקליאוטידים כי כבר בשימוש מקובל. לבסוף, ניתוחים של הנתונים biophysicochemical שהושגו אפשרה לנו לקבוע את המדינה oligomerization ופרמטרים קטליטי של rBC1531, כמו גם להשיג נתונים עקיפה רנטגן מן גביש rBC1531.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Recombinant חלבון ייצור וטיהור של rBC1531

  1. הכנת חלבון BC1531 רקומביננטי (rBC1531) - ביטוי פלסמיד
    1. הכינו DNA גנומי של B. cereus 10 .
    2. להגביר את הגן bc1531 מתבנית של ד chenus גנומי על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR), באמצעות פריימרים קדימה ויופעת (ראה את רשימת החומרים) כדי ליצור BAM HI ו סאל אני הגבלת אתרי אנזים, בהתאמה 10 .
    3. לעכל את המוצר PCR ו שונה וקטור pET49b (pET49bm) באמצעות BAM HI ו Sal I, כמתואר 11 .
    4. מערבבים את המוצר PCR מעוכל וקטור (יחס 3: 1) משלב 1.1.3 באמצעות ליגז T4 DNA בתגובה 10 μL, כמתואר 11 . לדגור על 18 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    5. פיפטה 3 μL של התגובה קשירת לתוך 50 μL של chemicaLly המוסמכת E. coli DH5α תאים בצינור. מערבבים בעדינות על ידי pipetting מעלה ומטה ומניחים על קרח במשך 30 דקות. הלם חום עבור 45 s ב 42 ° C. הוסף 1 מ"ל של Luria-Bertani (LB) בינוני לגדל את התאים תוך רועד במרץ (250 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס, 45 דקות).
    6. קח 100 μL של תאים שהשתנו משלב 1.1.6 ולהפיץ אותם על צלחות LB אגר עם 100 מיקרוגרם / קנמיצין מ"ל (קאן). לדגור על ~ 18 שעות ב 37 ° C.
    7. בחר מושבות באמצעות טיפ סטרילי לגדול התאים 3 מ"ל של מדיום LB עם 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​קן; לנער במרץ (250 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס, 18 שעות).
    8. הכן DNA פלסמיד באמצעות שיטה ליקוי SDS אלקליין, כמתואר 10 .
    9. אישור רצף נוקליאוטידים של ביטוי rBC1531-ביטוי באמצעות רצף DNA 12 .
  2. Overexpression של חלבון rBC1531
    1. Re- להפוך את coli BL21 (DE3) זן עם rBC1531-expRession פלסמיד, כמתואר צעדים 1.1.5-1.1.6, עבור overexpression.
    2. בחר מושבה לגדל אותו 10 מ"ל של LB בינוני המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​קן (LB + קאן); לנער במרץ 18 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
    3. לחסן 10 מ"ל של תרבות לילה ב 1 L של LB + קאן בינוני לגדול ב 37 ° C עד OD 600 (צפיפות אופטית ב 600 ננומטר) מגיע ~ 0.7.
    4. לצלול את התרבות במים קרים כקרח במשך 15 דקות ~ כדי לקרר את הטמפרטורה ל 18 מעלות צלזיוס ולהוסיף isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) לתרבות בריכוז סופי של 1 מ"מ על ביטוי חלבון רקומביננטי. לגדל את התרבות ב 18 מעלות צלזיוס עבור ~ ~ 18-18 נוספים.
  3. טיהור של rBC1531
    1. קציר התאים על ידי צנטריפוגה (5,000 xg, 4 ° C, 30 דקות). מחק את supernatant בזהירות כדי לא להפריע לתאים. Re- להשעות את התאים 50 מ"ל של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) פתרון המכיל 10 imidazole מ"מ.
    2. Lyse התאים פעמיים על ידי sonication על הקרח כדי למנוע את חימום יתר של lysates התא (זמן: 2 דקות 30 S, מחזור על: 5 S, מחזור הנחה: 10 S, משרעת: 38%).
    3. נקה לייסט התא על ידי צנטריפוגה (~ 25,000 XG, 4 ° C, 30 דקות).
    4. מערבבים 3 מ"ל של חרוזים ניקל 60 מ"ל של PBS המכיל 10 מ"מ imidazole וכוח הכבידה חיץ נוסף ליישב את חרוזי ניקל equilibrated ב 2.5 x 10 ס"מ טור כרומטוגרפיה זכוכית.
    5. פיפטה כדי להעביר את supernatant מ צעד 1.3.3 לעמוד עם חרוזי ניקל מראש equilibrated ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות על גלגל מסתובב במהירות נמוכה (~ 20 סל"ד).
    6. אפשר supernatant לניקוז על ידי כוח הכבידה ולשטוף את חרוזי ניקל בעמודה שלוש פעמים עם 100 מ"ל של PBS המכיל 10 imidazole מ"מ.
    7. חלבון RBC1531 Elute על ידי החלת 4 x 5 מ"ל של PBS המכיל 250 מ"מ imidazole.
    8. קח 15 μL של elution מ צעד 1.3.7 ולהפעיל אותו על 15% SDS-PAGE. לדמיין את להקות חלבון בהג'ל באמצעות מכתים כחול קומסי 10 .
  4. הסרת תגי הזיקה של חלבון rBC1531 על ידי פרוטאוליזה thrombin
    1. פיפטה שברים צינור דיאליזה (משקל מולקולרי לחתוך: 3 kDa) ומניחים את הצינור בכוס המכיל 4 L של חיץ תואמת thrombin cleavage (20 מ"מ HEPES, pH 7.4, 150 מ"מ NaCl, ו 1.5 מ"מ β-mercaptoethanol) ב 4 ° C במשך הלילה.
    2. פיפטה את השברים ולהעביר אותם צינור חרוטי.
    3. למדוד את ספיגת ב 280 ננומטר ולהעריך את ריכוז החלבון rBC1531, כמתואר 13 .
    4. קח 50 מיקרוגרם של rBC1531 בצינור 0.5 מ"ל ולהוסיף כמויות שונות של thrombin ( כלומר, 2, 1, 0.6, ו 0.3 יחידות). דגירה של תגובות rBC1531 ו thrombin ב 20 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות כדי לקבוע את הכמות המינימלית של thrombin נדרש לדבוק תג זיקה N- מסוף.
    5. הפעל את rBC1531 ותגובות טרומבין על 15%SDS-PAGE ולקבוע את הכמות הנמוכה ביותר של thrombin ( למשל, 0.3 יחידות של תרומבין לכל 50 מיקרוגרם של rBC1531) כי מעכל לחלוטין את תג זיקה N- מסוף לייצר RBC1531 ללא תג.
    6. הוסף 10 מ"ג של חלבון rBC1531 ו 60 יחידות של טרומבין לצינור 15 מ"ל ו דגירה על 20 מעלות צלזיוס למשך 3 ~ שעה לתגובה thrombin- proteolysis.
    7. החלת תקני סינון ג'ל על עמודה בגודל כרומטוגרפיה (SEC) כדי להכין עקומה סטנדרטית של משקולות מולקולריות וכרכים elution, כמתואר 13 .
    8. מניחים את החלבון rBC1531 מתעכל thrombin משלב 1.4.6 בצינור צנטריפוגלי מסנן (משקל מולקולרי לחתוך: 3 kDa) ו צנטריפוגות ב 3000 גרם ב 4 ° C כדי לצמצם נפח של פחות מ 5 מ"ל.
    9. החל את חלבון rBC1531 מרוכזים בעמודה SEC ולאסוף 60 שברים eluted ב 0.5 מ"ל לכל צינור 13 .
    10. קח 15 μL של כל חלק, להפעיל אותם על SDS-PAGE 15%, ו staiN ג 'ל באמצעות תמיסת מכתים קומאסי (0.15% (w / v) קומאסי כחול מבריק, 40% (v / v) מתנול, ו 10% (v / v) חומצה אצטית קרחוני) כמתואר 10 .
    11. פיפטה שברים המכילים rBC1531 ולאסוף אותם בצינור אחד.

2. התגבשות הקרנה ואופטימיזציה של rBC1531

  1. תנאי הקרנה עבור התגבשות חלבון rBC1531
    1. לרכז את rBC1531 משלב 1.4.11 עד ~ 18.5 מ"ג / מ"ל ​​באמצעות צינור מסנן צנטריפוגלי, כמתואר בשלב 1.4.8.
    2. הוסף 50 μL של פתרון התגבשות כל התגבשות (ראה סעיף 2.2) 14 בארות של 96-היטב יושב טיפות התגבשות. מקום 0.5 μL של 18.5 מ"ג / מ"ל ​​פתרון חלבון rBC1531 על מיטת ישיבה. מערבבים את פתרון החלבון עם 0.5 μL של פתרון טוב, חוזר על התהליך עבור הצלחת כולה.
    3. מכסים את הצלחת עם סרט דבק ברור.מניחים את צלחות 96 גם על 18 מעלות צלזיוס ולאפשר דיפוזיה אדי.
    4. סרוק את הטיפות בהגדלה 20-40X באמצעות מיקרוסקופ אור כדי לפקח על היווצרות קריסטל מדי יום במשך 2-3 שבועות.
    5. איסוף נתונים עקיפה רנטגן 12 באמצעות גבישים חלבון rBC1531 שהתקבלו.
  2. אופטימיזציה של התנאים rBC1531 התגבשות
    1. הכן 500 μL של הפתרון התגבשות הראשונית שנבחרה במצב ( למשל, 0.1 C נתרן Cacodylate, pH 6.5 ו 1.0 M ציטרט ציטראט) ולמלא צלחת התגבשות 24 גם לירידה טיפה.
    2. הוסף 0.5 μL של 18.5 מ"ג / מ"ל ​​פתרון חלבון rBC1531 למיטה יושבת, לערבב עם 0.5 μL של פתרון טוב, לכסות את הצלחת מיד עם סרט דבק ברור. מניחים את הצלחת על 18 מעלות צלזיוס.
    3. לצפות צמיחה גביש תחת מיקרוסקופ אור במשך שבוע.
    4. לייעל את התנאים התגבשות שונים על ידי שינוי ה- pH ( כלומר., PH 5.5-6.8) של 0.1 m cacodylate ו על ידי שינוי ריכוז המלח ( כלומר, 0.9-1.2 M) של ציטרט נתרן כדי להשיג גבישים בודדים. צג הצמיחה גביש ~ 1 בשבוע ולאסוף נתונים עקיפה X- רנטגן 12 .

3. אפיון של Triphosphatase Nucleoside (NTPase) פעילות של rBC1531

  1. ואלידציה של מחקר קולורימטרי המבוסס על פוספט אי-אורגני
    1. הכן מלאי של pyrophosphate (100 מ"מ) ו לדלל אותו לריכוז הסופי של 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 5.0, 10, 50, 100, ו 250 מיקרומטר μL 200 של חיץ התגובה (20 מ"מ HEPES, pH 7.4; 150 MM NaCl, ו 2 מ"מ MgCl 2 ) לשכפל 96 צלחות היטב. השתמש בצלחת הראשונה כביקורת (זה אינו מכיל pyrophosphatase). ודא כי הצלחת השנייה מכילה pyrophosphatase כצלחת עובד, בהתאם להוראות בשלב 3.1.2.
    2. הוסף 0.01 יחידה של Saccharomyces cerevisiae p אורגנייםYrophosphatase (1 μL) על הבארות של צלחת עובד ו דגירה על 20 מעלות צלזיוס למשך 30-60 דקות.
    3. הכן תמיסת חומצה molybdate על ידי ערבוב molybdate אמוניום (0.86% v / v) ו חומצה אסקורבית (14% v / v) פתרונות ביחס של 7: 3. הוסף 16 μL של תמיסת חומצה מוליבדט לשני בארות עבודה ובקרה לחכות 15 דקות.
    4. קרא את הצפיפות האופטית ב 690 ננומטר (OD 690nm ).
  2. Assay NTPase
    1. הכנת מלאי של 100 מ"מ nucleoside triphosphate (NTP) המצע לדלל את הריכוז הרצוי ( למשל, 0, 0.2, 4.4, 11, 22, 44, 88, או 132 מיקרומטר) ב μL 180 של חיץ assay (20 מ"מ HEPES, PH 7.4, 150 מ"מ NaCl, ו 2 מ"מ MgCl 2 ).
    2. הוסף 20 מיקרוגרם של rBC1531 (1.5 מ"מ) ואת מצעים NTP מ 3.2.1 עד 200 μL לכל תגובה צלחת 96-היטב פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב היטב. מכסים את הצלחת עם המכסה ומניחים אותו 37 ° C חממה למשך 30 דקותכדי לבצע את התגובה המצע הידרוליזה.
    3. מעבירים את הצלחת לאמבט מים 70 מעלות צלזיוס ומאפשרים לעמוד במשך 15 דקות כדי לעצור את תגובות rBC1531 בתיווך קטליטי.
    4. הוסף 0.01 יחידה של S. cerevisiae pyrophosphatase אנאורגני (1 μL) היטב כל צלחת התגובה (מ 3.2.3 צעד) ו דגירה על 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הוסף 16 μL של תמיסת חומצה מוליבדט לצלחת תגובה לפתח את הצבע (~ 15 דקות). קרא ב OD 690nm .
    5. ניתוח באמצעות משוואת Michaelis-Menten, כמתואר 12 .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיון של חלבון העניין במחקר זה החל על ידי הכנת כמות מספקת של רקומביננטי B. B. creus bc1531 (rBC1531) חלבון, רצוי יותר ממספר מיליגרם. קטע ה- DNA המקודד את החלבון BC1531 הוכן על ידי PCR באמצעות הדנ"א הגנומי של B. cereus כתבנית, שכן הוא מכיל גנים אורתולוגים זהים ba1554 . RBC1531 היה overexpressed כמו חלבון מסיס בתאי E. coli . חלבון rBC1531 באה לידי ביטוי עם תג 6x-Histidine ואת אתר thrombin מחשוף ב N- מסוף

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים על פתוגנים אמיתיים מוגבלים עקב מגבלות ותקנות בטיחות. לחלופין, ניתן לחקור פתוגנים באמצעות לא פתוגנים הקשורים אבולוציונית או מינים פחות פתוגניים. הגן ba1554 נחשב לגן קריטי ב-B. anthracis. למרבה המזל, גן זהה קיים ב-B. cereus לא קליני.לפיכך, ללא חששות בטיחות רציניים, ניתן להשתמש בחלבון BC1531 רקומביננטי לאפיון ביופיזי ואנזימטי. כאן, תיארנו נהלים מפורטים, מעבר מגן לחלבון רקומביננטי מטוהר. באמצעות חלבון רקומביננטי, נערכו ניתוחי אפיון ביופיזיקליים כדי לגלות כי rBC1531 טטרמרי מזרז הידרוליזה של ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכי האפקט של קרני הרנטגן נאספו ב- beamline 7A של מעבדת ה- Pohang Accelerator (קוריאה). מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר הבסיסי למדע, אשר ניתנה באמצעות הקרן הלאומית למחקר של קוריאה (NRF), הממומנת על ידי משרד המדע, ICT & תכנון עתידי (2015R1A1A01057574 ל- MH).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Bacillus cereus ATCC14579אוסף קוריאני לתרבית רקמות3624
ערכת הכנת DNA גנומיGeneAll106-101הכנת DNA גנומי
פריימר קדימהMacrogenGAAGGATCCGGAAGCAAAAA
CGATGAAAGATATGCA		em>BamHI אתר מסומן בקו תחתון
פריימר הפוךMacrogenאתר CTTGTCGACTTATTCTCTCT
CCCTCATCAATACGTG		SalI מסומן בקו תחתון
nPfu-ForteEnzynomicsP410PCR polymerase
BamHIEnzynomicsR003S
SalIEnzynomicsR009S
pET49b וקטור ביטויNovagen71463וקטור הביטוי שונה כדי להוסיף תגי זיקה ואתרי BamHI/SalI10
T4 DNA ligaseEnzynomicsM001S
דיאליזה memebraneThermofisher18265017
מחמם בלוק יבשJSRJSBL-02T
מרק LB (לוריא-ברטני)תמיסת LPSLB-05
LB אגר, מילר (לוריא-ברטני)בקטון, דיקינסון וחברת
KanamycinLPS פתרוןKAN025
ערכת מיני הכנהFavorgenFAPDE300הכנת DNA פלסמיד
BL21 (DE3) תא מוכשרNovagen69450-3CN
איזופרופיל ובטא;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)פישר ביו-ריאגנטים50-213-378
נתרן כלוריDaejung7548-4100חומר PBS
אשלגן כלוריDaejung6566-4405חומר PBS
אשלגן פוספטBio Basic IncPB0445חומר
PBS נתרן פוספטBio Basic IncS0404חומר PBS
ImidazoleBio Basic IncIB0277
SonicatorSonicsVCX 130
Ni-NTA agarosQiagen30210חרוז ניקל
מסובבFinepcrAG
דיוק פלוס חלבון תקני צבע כפולBio-rad1610374SDS-PAGE חלבון סטנדרטי
Coonmassie Brilliant Blue R-250Fisher BioReagentsBP101-25Coomassie תמיסת צביעה
מתיל אלכוהולSamchun כימיM0585תמיסת צביעה של Coomassie
חומצה אצטיתDaejung1002-4105תמיסת צביעה של Coomassie
דיאליזה memebraneThermofisher68035
2-MercaptoethanolSigma-aldrichM6250
ThrombinMerckmillipore605157-1KUCNהכן ציטוטים של 20 μ L (יחידה אחת לכל μ L) ולאחסן ב-70 מעלות; C והפשרה לפני השימוש
Superdex 200 16/600ג'נרל אלקטריק28989335גודל אי הכללה כרומטוגרפיה
תקן סינון ג'לBio-rad151-1901
מסנן צנטריפוגליAmiconUFC800396
לוחות קריסטרליזציה מחקרהמפטוןHR3-083צלחת טיפה יושבת 96 באר
סוויטת הליבה של JCSG I-IVQiagen130924-130927תמיסת התגבשות התגבשות
מיקרוסקופNikonSMZ745T
Cryschemלוחות Hampton researchHR3-158צלחת טיפה יושבת 24 בארות
פירופוספטאזסיגמא10108987001
תמיסת אמוניום מוליבדטסיגמא13106-76-8
חומצה L-אסקורביתסיגמא50-81-7
מצע NTPStartagene200415-51
ספקטרופוטומטרBiotekSynergyH1קורא מיקרו-פלטות
GraphPad פריזמה 5GraphPadפריזמה 5 לחלון
<

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ivanova, N., et al. Genome sequence of Bacillus cereus and comparative analysis with Bacillus anthracis. Nature. 423, 87-91 (2003).
  2. Spencer, R. C. Bacillus anthracis. J Clin Pathol. 56, 182-187 (2003).
  3. Deli, A., et al. LmbE proteins from Bacillus cereus are de-N-acetylases with broad substrate specificity and are highly similar to proteins in Bacillus anthracis. FEBS J. 277, 2740-2753 (2010).
  4. Gross, M., Marianovsky, I., Glaser, G. MazG -- a regulator of programmed cell death in Escherichia coli. Mol Microbiol. 59, 590-601 (2006).
  5. Galperin, M. Y., Moroz, O. V., Wilson, K. S., Murzin, A. G. House cleaning, a part of good housekeeping. Mol Microbiol. 59, 5-19 (2006).
  6. Lee, S., et al. Crystal structure of Escherichia coli MazG, the regulator of nutritional stress response. J Biol Chem. 283, 15232-15240 (2008).
  7. Moroz, O. V., et al. Dimeric dUTPases, HisE, and MazG belong to a new superfamily of all-alpha NTP pyrophosphohydrolases with potential "house-cleaning" functions. J Mol Biol. 347, 243-255 (2005).
  8. Robinson, A., et al. A putative house-cleaning enzyme encoded within an integron array: 1.8 A crystal structure defines a new MazG subtype. Mol Microbiol. 66, 610-621 (2007).
  9. Moroz, O. V., et al. The crystal structure of a complex of Campylobacter jejuni dUTPase with substrate analogue sheds light on the mechanism and suggests the "basic module" for dimeric d(C/U)TPases. J Mol Biol. 342, 1583-1597 (2004).
  10. Green, M., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory Manual. 1, John Inglis. (2012).
  11. Brown, T. A. Gene cloning an introduction. , Chapman & Hall. (1986).
  12. Kim, M. I., Hong, M. Crystal structure of the Bacillus-conserved MazG protein, a nucleotide pyrophosphohydrolase. Biochem Biophys Res Commun. 472, 237-242 (2016).
  13. Sheehan, D. Physical biochemistry: Principles and applications. , A John Wiley & Sons. (2009).
  14. Lesley, S. A., Wilson, I. A. Protein production and crystallization at the joint center for structural genomics. J Struct Funct Genomics. 6, 71-79 (2005).
  15. Jeon, Y. J., et al. Structural and biochemical characterization of bacterial YpgQ protein reveals a metal-dependent nucleotide pyrophosphohydrolase. J Struct Biol. 195, 113-122 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Protein CrystallizationEnzymatic KineticsNickel Affinity ChromatographySize Exclusion ChromatographyThrombin DigestionSitting Drop Vapor DiffusionX ray CrystallographySpectrophotometric AnalysisBacillus Cereus

מאמרים קשורים